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문제 정의
- 또한 입욕제에서 은은히 펴지는 향기는 지친 심신을 달래주고 기분전환을 시켜주는 등의 효과가 있는 것으로 알려지고 있다. 본 실험에서 이러한 기능을 하는 입욕제가 피부염 모델에도 효과가 있는지를 확인해 보았다.
- 이에 본 연구에서는 지역 한방 산업의 대표상품으로서 활용할 수 있는 한방 입욕제를 개발하고자, 경남 산청 지역에서 재배하고 있는 소목, 강활, 독활, 방풍 등의 한약재를 중심으로 기존 연구 5-9) 및 서적 10-12) 들을 토대로 처방을 구성한 뒤 피부에서 유의한 효과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 이후 5일간 방치 한 후에 challenge을 시행하였다. 5일 방치 기간 중 마지막 5일째에는 challenge 준비 작업(제모)을 수행하였다. 전신 마취제로 30 ml을 복강 주사한 뒤 마취 유지 시간 동안 물 스프레이로 생쥐의 등을 도포한후 면도기로 일차적으로 털을 깎았다.
- 한방 입욕제의 농도는 피부 표면적 1 cm2 당 150 μg으로 만들어 사용하였다. 5일간 하루 2회로 나누어 오전(10시)에는 challenge를, 5시간 후인 오후(3시)에는 해당 입욕제를 도포하였다. 해당 시험이 종료되는 5일뒤에는 마우스 등의 피부 병변을 사진 촬영하였고, 조직을 절편, 조직 표본을 제작하였다.
- DNFB와 TMA에 처리에 의한 피부염 감작 (sensitization)실험은 Hopkins 등 13) 이 제시한 방법을 변형하여 수행하였다. 먼저 2주간의 적응기간(adaptation)을 거친 생쥐 5마리를 각각 정상군 (Naive group, 이하 N군), 피부염만을 유발한 대조군(Control group, 이하 C군), 알레르기성 접촉 피부염 유발 후 해당 한방 입욕제 후보 A, B 처방 추출물을 도포한 A, B 실험군(이하 A, B 군)으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 한방 입욕제가 알레르기성 접촉 피부염에 어떠한 효과를 미치는지를 알아보기 위해 실제 피부 조직에서 나타난 변화를 육안으로 관찰해본 결과 처음 sensitization 후 제모시켜 피부의 상태를 확인했을 때에는 이미 가피(痂皮)가 벗겨지고 어느 정도 염증이 개시된 상태였다. 다음 5일간 유도 기간을 가진 뒤 염증 반응을 좀 더 유발하고 향후 약물의 효과관찰을 용이하게 하기위해 다시 5일간 오전에는 challenge를 , 오후에는 입욕제를 도포하는 실험을 진행하였다. 처음 1~2일 간은 C군과 비교해봤을 때 피부 상태에서 A와 B군에서 큰 차이를 보이지 않았으나 3일 경과 후부터 이들 사이에서 차이가 나타났다.
- 이후 challenge 및 한방 입욕제 도포 과정은 알레르기성 접촉 피부염 모델과 동일하게 진행하였다. 마찬가지로 종료 시점인 5일 경과 후 해당 등 부위에 사진 촬영을 하고 조직 절편 후 조직 표본을 제작하였다.
- 먼저 2주간의 적응기간(adaptation)을 거친 생쥐 5마리를 각각 정상군 (Naive group, 이하 N군), 피부염만을 유발한 대조군(Control group, 이하 C군), 알레르기성 접촉 피부염 유발 후 해당 한방 입욕제 후보 A, B 처방 추출물을 도포한 A, B 실험군(이하 A, B 군)으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 본 실험에 사용한 한방 입욕제 후보 처방 A와 B의 구성 약재들은 부산대학교 한의학전문대학원에서 구입, 정선해 사용하였고, 내용과 분량은 Table 1, Table 2와 같다. 산청 지역에서 재배하고 있는 소목, 강활, 독활, 방풍 등의 한약재를 중심으로 위령선, 백지, 계지, 모과, 애엽을 넣은 처방을 A, 구척, 홍화, 당귀, 천궁을 넣은 처방을 B로 하였다.
- 앞서 언급한 알레르기성 접촉 피부염과 외과 창상 치유는 이미 서양 의학 분야에서 많은 발전이 이루어져 왔으나 완치가 어렵고 재발율이 높기 때문에 특히 만성 환자들이 한의학을 많이 이용하고 있다. 이에 저자는 알레르기성 접촉 피부염과 창상 치유의 보조 요법으로서 입욕 요법(入浴 療法)을 하나의 대안으로 생각하게 되었다.
- 해당 용액은 양쪽 귀 벽에 각각 30 μL 씩, 총 60 μL를 사용하였다. 이후 5일간 방치 한 후에 challenge을 시행하였다. 5일 방치 기간 중 마지막 5일째에는 challenge 준비 작업(제모)을 수행하였다.
- 전 처리가 완료된 N군의 제모한 등에는 AOO용액을, 그외 나머지 군에는 DNFB+TMA 용액을 각각 60 μL씩 도포하여 challenge을 시행하였다.
- 5일 방치 기간 중 마지막 5일째에는 challenge 준비 작업(제모)을 수행하였다. 전신 마취제로 30 ml을 복강 주사한 뒤 마취 유지 시간 동안 물 스프레이로 생쥐의 등을 도포한후 면도기로 일차적으로 털을 깎았다. 털깎기가 완료되면 곧바로 제모제를 면도 부위에 도포, 약 3~5분간 방치한 뒤 물로 깨끗이 씻어냈다(이때 제모제로 인한 피부 병변 발생을 방지하기 위해 미온수로 약 3회 반복 세척을 함).
- 조직 염색은 H & E 염색법을 이용하였고, 광학현미경 상에서 40배의 배율로 피부의 전반적인 상태를 관찰하였다.
- 먼저 2주간의 적응기간(adaptation)을 거친 생쥐 5마리를 각각 정상군 (Naive group, 이하 N군), 피부염만을 유발한 대조군(Control group, 이하 C군), 알레르기성 접촉 피부염 유발 후 해당 한방 입욕제 후보 A, B 처방 추출물을 도포한 A, B 실험군(이하 A, B 군)으로 나누어 실험을 진행하였다. 총 5일 간 allergy 접촉 피부염 모델 생쥐에 알레르기를 유발하였는데, 이 과정은 감작(sensitization)과 유발(challenge)의 두 단계로 진행하였고 1차적으로 sensitization 후 5일 뒤 2차로 challenge을 시행하였다. 먼저 sensitization 과정은 생쥐를 흡입 마취액(Isoflurane)으로 마취 유도 후 양쪽 귀 벽에 N군에는 AOO용액, 나머지 군에는 DNFB와 TMA용액을 도포하였다.
- 육안평가 기준은 다음과 같이 설정하였다. 피부병변이 없는 정상인 상태(0점), 홍반 (Erythema)이 있는 상태(1점), 홍반과 부종(Edema), 혈종 (Excoriation)이 동반된 상태(2점), 홍반, 부종, 가려움(Pruritus), 혈종이 나타나지만 다소 뚜렷하지 않은 상태(3점), 종창, 진무름(Erosion), 혈종, 농포(Pustule)등이 뚜렷한 상태(4점), 종창, 농포, 진무름 등이 매우 심한 상태(5점)로 채점하였다.
- 5일간 하루 2회로 나누어 오전(10시)에는 challenge를, 5시간 후인 오후(3시)에는 해당 입욕제를 도포하였다. 해당 시험이 종료되는 5일뒤에는 마우스 등의 피부 병변을 사진 촬영하였고, 조직을 절편, 조직 표본을 제작하였다.
대상 데이터
- 각 처방은 초음파약탕기(SM-35EP-PLUS, 한국 소니메디)를사용하여 10회 분량을 부피의 약 3~4배의 물을 가하여 전탕하였으며, 추출된 약물은 감압건조기(Ex-DRY, 한국 소니메디)를 이용하여 40도, 60mmHg에서 건조하였으며, 건조 추출물은 -20도에서 냉동보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다. 처방 A는 물 4 liter에 약재 900 g을 넣고 95도에서 90분간 열수추출하여 최종적으로 98.
- 본 실험에 사용된 시약 중 0.1%(w/v) dinitrofluorobenzene (DNFB), 10%(v/v) trimellitic anhydride(TMA), AOO(Acetone:Olive oil = 4:1) 등은 Sigma 사(St. Louis. MO)제품을 사용하였고, 그밖에 흡입마취제로 중외 포란액(Isoflurane, 중외제약 Ⓡ ), 전신마취제로 zoletil 50(Virvac Ⓡ ), 제모제(프리모, 세화피엔씨 Ⓡ )등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 한방 입욕제 후보 처방 A와 B의 구성 약재들은 부산대학교 한의학전문대학원에서 구입, 정선해 사용하였고, 내용과 분량은 Table 1, Table 2와 같다. 산청 지역에서 재배하고 있는 소목, 강활, 독활, 방풍 등의 한약재를 중심으로 위령선, 백지, 계지, 모과, 애엽을 넣은 처방을 A, 구척, 홍화, 당귀, 천궁을 넣은 처방을 B로 하였다.
- 실험 동물은 암수와 상관없이 8주령의 ICR 생쥐를 이용하여 실험당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co., Korea)와물을 충분히 공급하고 온도 23 ± 1℃, 습도 55 ± 15%, 12시간-12 시간 (light-dark cycle)의 환경에서 2주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 평균±표준편차로 기록하였고, 통계적 유의성 검증에는 Origin (version 8.1, OriginLab Corp.)의 Student's t-test 분석법을 이용하여 처리하였으며, 유의성 한계는 P<0.05로 정하였다.
이론/모형
- 실험 종료 후 digital camera로 해당 등 부위를 촬영하였으며, 결과 관찰은 육안 평가법을 이용하였다. 육안평가 기준은 다음과 같이 설정하였다.
- 외과적 창상 치유 모델 유도는 알레르기성 접촉 피부염 모델에서의 sensitization 과정이 생략되며, 이후 제모 과정부터는 동일하게 진행하였다(외과적 창상 치유 모델에 대한 입욕제의 효능 실험은 한 등 14) , 허 등 15) 의 논문을 참고하였다). 제모 후 큰주사기용 neddle로 제모한 부위에 10회 가량 scratch를 유발, 등에 선홍색의 선이 보일 정도로 유도하였다.
성능/효과
- 다음으로 피부 조직의 표피 두께 변화 결과는 Fig. 5B와 같으며, 역시 N군을 '1'로 보았을 때 C군은 2.4 ± 0.3 (n=4), A군은 1.5 ± 0.2 (n=4), B군은 1.6 ± 0.1 (n=4)로 상처 유발로 표피 두께가 유의적으로 증가하였으며 (p<0.01), A, B 군에서 그 값이 유의하게 감소하였다(p<0.05).
- 또한 skin wound index 값에서는 C군은 4.5 ± 0.2 (n=5)로 종창, 농포, 구진 등의 증상이 유도된 반면, A군은 2.8 ± 0.4 (n=5), B은 3.2± 0.3 (n=5)로 역시 약물 도포로 index 값이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5A).
- 또한 생쥐의 행동 관찰에서 C군에 비해 A, B 군에서 긁는 행동이 상대적으로 감소하면서 소양감이 감소한 것으로 미루어 피부염이 현저히 감소한 것을 알 수 있었다(Fig. 1 & 2).
- 산청 지역에서 재배하고 있는 소목, 강활, 독활, 방풍 등 한약재를 중심으로 A와 B 처방을 만들어 피부에 대한 효과를 비교해 본 결과 처방 A에서 좀 더 좋은 결과가 나타났고 이는 처방 A의 구성 약재가 피부에 효능이 좋은 것으로 생각된다.
- 생쥐에서 알레르기성 접촉 피부염과 창상을 유발한 후 그 효과를 확인하였는데 A와 B군에서 알레르기성 접촉 피부염 및 외과적 창상 치유 모델 모두에서 유의한 효과를 확인할 수 있었다. 외과적 창상 치유 모델의 효과 실험에서는 알레르기성 접촉 피부염 모델에 비해 효능이 떨어지는 것으로 나타났는데 이는 scratch 유발방법 설계 시 횟수를 약 10회 정도로 정했기 때문으로 사료된다.
- 05). 알레르기성 접촉 피부염 모델에서와 마찬가지로 외과적 창상 모델에서도 표피 두께변화 및 index, 행동학적 측면에서 효과가 유의하게 나타난 것으로 한방 입욕제가 외과적 창상의 치료에 효과가 있음을 확인할수 있었다.
- 알레르기성 접촉 피부염에 대한 skin wound index에서는 C군은 4.7 ± 0.4 (n=5)로 소양감, 건조, 부종, 혈종, 진무름 등의 증상이 유도된 반면, A군은 1.5 ± 0.2 (n=5), B군은 1.6 ± 0.3 (n=5)로 해당 수치가 현저히 감소한 것을확인할 수 있었으며(Fig. 1), digital camera로 관찰한 생쥐의 등에서 이러한 결과를 재확인 할 수 있었다(Fig. 2).
- 이상에서 알레르기성 접촉 피부염과 외과적 창상 치유 모델에서 A와 B 처방을 투여해 피부 손상 완화를 형태학적 측면에서 조사한 바, 이 처방들이 생쥐의 알레르기성 접촉 피부염과 창상 치유에 효과가 있는 것으로 나타났다. 본 실험 결과를 토대로 상기 처방을 이용한 입욕제가 알레르기성 접촉 피부염 및 창상 치유에 광범위하게 이용될 수 있고, 기존 치료제와 차별화 할 수있는, 부작용이 없는 안전성이 확보된 치료제로 개발하기 위해서는 치료 기전을 중심으로 하는 계속적인 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- 01). 즉, 알레르기성 접촉 피부염 유발 후 표피의 두께가 유의하게 증가하였으나, A, B 군에서 유의하게 감소한 결과를 바탕으로 상기 한방 입욕제가 항염증 반응, 특히 표피의 두께 개선에 효과적인 것으로 나타났다.
- 한방 입욕제가 알레르기성 접촉 피부염에 미치는 영향과 더불어 외과적 창상 모델에서 어떠한 효과가 있는지를 살펴본 결과, A와 B군에서는 C군에 비해 긁는 행동이 상대적으로 감소한 것을 바탕으로 알레르기성 접촉 피부염 증상과 마찬가지로 외과적 창상 모델에서도 효과가 있음을 알 수 있었다(Fig. 5). 또한 skin wound index 값에서는 C군은 4.
후속연구
- 이상에서 알레르기성 접촉 피부염과 외과적 창상 치유 모델에서 A와 B 처방을 투여해 피부 손상 완화를 형태학적 측면에서 조사한 바, 이 처방들이 생쥐의 알레르기성 접촉 피부염과 창상 치유에 효과가 있는 것으로 나타났다. 본 실험 결과를 토대로 상기 처방을 이용한 입욕제가 알레르기성 접촉 피부염 및 창상 치유에 광범위하게 이용될 수 있고, 기존 치료제와 차별화 할 수있는, 부작용이 없는 안전성이 확보된 치료제로 개발하기 위해서는 치료 기전을 중심으로 하는 계속적인 연구가 필요한 것으로 생각된다.
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