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문제 정의
- 본 연구는 金銀花의 류마티스성 관절염에 대한 향염증효과를 조사하기 위해 윤활관절세포에서 MIF mRNA 발현을 조사하였고, 인위적으로 류마티스성 관절염이 유발된 생쥐에 金銀花 추출물 투여 후 윤활관절막내에서 일어나는 일반적인 형태변화, 혈관분포, 섬유화, 그리고 MIF, COX-2, MMP-9의 면역조직학적 변화를 조사하였다.
제안 방법
- 우선 관절 주변 근육을 제거하여 윤활관절주머니 개방한 후 0.1% collagenase가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Weljin, Korea)에 2시간동안 반응하여 윤활관절막 분리하고 세절하였다.
- 한편 윤활관절막의 자유면 기저부에서 모세혈관의 분포 변화를 조사하기 위해서 Wright's stain을, 윤활관절막내 섬유화를 조사하기 위해 Van Gieson's picric acid-fuchsin 염색을 실시하였다.
- 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF primer(sense, 5'-CACCATGCCTATGTTCATCGTGAACA-3'; antisense, 5'-GGGCTCAAGGCGAAGGT GGAACCGTT-3')를 PCR machine으로 반응시켰다.
- 1% collagenase에 37℃에서 1시간동안 처리한 다음 3000 rpm에 5분간 원심분리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum(FBS; Sigma, USA)이 함유된 DMEM를 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin(Sigma), 100 ㎍/㎖ streptomycin(Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다. 세포는 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 PBS로 씻어주고, trypsin-EDTA(Gibco/BRL)를 처리하여 계대 배양하였다.
- 금은화 추출물의 첨가량 결정을 위해 MTT assay를 실시하였는데, 금은화 추출물 10 ㎎/㎖까지는 세포생존률의 변화가 일어나지 않아 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다. 금은화 추출물이 류마티스 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor(MIF)에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다.
- 윤활관절세포 - 5×105 cells/well을 6 well에 plating하고 12시간 후에 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, 1 ng/㎖)를 1시간 처리하여 MIF mRNA 발현을 유도하였다. 금은화 추출물 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양한 후 수거한 RNA를 trizol reagent (Sigma)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer (Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF primer(sense, 5'-CACCATGCCTATGTTCATCGTGAACA-3'; antisense, 5'-GGGCTCAAGGCGAAGGT GGAACCGTT-3')를 PCR machine으로 반응시켰다.
- RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF primer(sense, 5'-CACCATGCCTATGTTCATCGTGAACA-3'; antisense, 5'-GGGCTCAAGGCGAAGGT GGAACCGTT-3')를 PCR machine으로 반응시켰다. PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
- 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.2(Optima, USA)를 이용한 영상분석(image analysis)을 통해 비교하였다.
- 오리엔트(한국)에서 분양 받은 태령 4주된 DBA 암컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (CON군), 관절염 유발군 (AE군), 관절염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각군에 각 10마리씩 배정하였다. 관절염 유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS, Sigma)를 증류수에 희석한 후 각각 300㎍/㎏씩 무릎관절에 주사하였다.
- 대조군 (CON군), 관절염 유발군 (AE군), 관절염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각군에 각 10마리씩 배정하였다. 관절염 유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS, Sigma)를 증류수에 희석한 후 각각 300㎍/㎏씩 무릎관절에 주사하였다. 특히 무릎관절낭으로의 정확한 주사를 위해 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 다음 무릎부위 피부를 절개하여 무릎뼈를 확인한 후 주사하였다.
- 관절염 유발을 위해 lipopolysaccharide(LPS, Sigma)를 증류수에 희석한 후 각각 300㎍/㎏씩 무릎관절에 주사하였다. 특히 무릎관절낭으로의 정확한 주사를 위해 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 다음 무릎부위 피부를 절개하여 무릎뼈를 확인한 후 주사하였다. 한편 무릎관절에서의 관절염 유발여부는 LPS 주사 후 24-48시간 동안 무릎주변에서 나타나는 부종 (edema)의 확인을 통해 이루어졌다.
- 특히 무릎관절낭으로의 정확한 주사를 위해 sodium pentobarbital 용액으로 마취한 다음 무릎부위 피부를 절개하여 무릎뼈를 확인한 후 주사하였다. 한편 무릎관절에서의 관절염 유발여부는 LPS 주사 후 24-48시간 동안 무릎주변에서 나타나는 부종 (edema)의 확인을 통해 이루어졌다. 금은화 추출물 45 ㎖/㎏을 매일 28일 동안 경구투여 하였다.
- 한편 무릎관절에서의 관절염 유발여부는 LPS 주사 후 24-48시간 동안 무릎주변에서 나타나는 부종 (edema)의 확인을 통해 이루어졌다. 금은화 추출물 45 ㎖/㎏을 매일 28일 동안 경구투여 하였다.
- 관절염 유발 28일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
- 관절염 유발 28일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
- 적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여 5㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 Hematoxylin과 Eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다. 한편 윤활관절막의 자유면 기저부에서 모세혈관의 분포 변화를 조사하기 위해서 Wright's stain을, 윤활관절막내 섬유화를 조사하기 위해 Van Gieson's picric acid-fuchsin 염색을 실시하였다.
- Avindin biotin complex(ABC) kit(DAKO)에 1시간동안 실온에서 반응시킨 후 0.05% 3,3'-diaminobenzidine(DAB)과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 윤활관절막내에서 류마티스 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor(MIF), 염증 효소인 cyclooxygenase(COX)-2 그리고 단백분해효소인 matrix metalloproteinase(MMP)-9의 양성반응 변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 무릎관절 표본을 우선 proteinase K로 proteolysis한 다음 10% normal goat serum(1:20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다.
- 윤활관절막내에서 류마티스 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor(MIF), 염증 효소인 cyclooxygenase(COX)-2 그리고 단백분해효소인 matrix metalloproteinase(MMP)-9의 양성반응 변화를 조사하기 위해 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 무릎관절 표본을 우선 proteinase K로 proteolysis한 다음 10% normal goat serum(1:20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 rabbit anti-mouse MIF(1:100, Santa Cruz Biotec, USA), rabbit anti-mouse COX-2(1:500, Santa Cruz Biotec) 그리고 rabbit anti-mouse MMP-9(1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 5일 동안 반응시켰으며, 2차 항체 goat anti-rabbit IgG(1:100, Santacruz)에 3일 동안 link 하였다.
- 무릎관절 표본을 우선 proteinase K로 proteolysis한 다음 10% normal goat serum(1:20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 rabbit anti-mouse MIF(1:100, Santa Cruz Biotec, USA), rabbit anti-mouse COX-2(1:500, Santa Cruz Biotec) 그리고 rabbit anti-mouse MMP-9(1:100, Santa Cruz Biotec)에 4℃ humidified chamber에서 5일 동안 반응시켰으며, 2차 항체 goat anti-rabbit IgG(1:100, Santacruz)에 3일 동안 link 하였다. Avindin biotin complex(ABC) kit(DAKO)에 1시간동안 실온에서 반응시킨 후 0.
- 이러한 금은화의 항염증능이 류마티스성 관절염에 대한 치료효과를 조사하기 위해서 실시된 본 연구는 윤활관절세포의 MIF mRNA 발현을 측정하였고, LPS로 인위적 류마티스성 관절염이 유발된 생쥐에 금은화 추출물 투여 후 윤활관절막의 일반적인 형태변화, 혈관분포, 섬유화 그리고 면역조직화학을 통한 MIF, COX-2, MMP-9 양성반응 변화를 관찰하였다.
- 이러한 金銀花의 MIF 활성 억제는 NF-κB 활성을 저해함으로써 염증효소 COX-2 작용을 차단하게 되어 염증으로 유발되는 윤활관절막내 조직 손상을 막았다. 또한 윤활관절막내 MMP-9의 생성을 억제함으로써 세포외 기질의 손상과 염증세포의 이주증가를 막았다. 이상의 결과로 金銀花는 MIF의 활성 억제를 통해 초기 류마티스성 관절염의 진행을 차단하고 항염증작용을 통해 류마티스성 관절염로 기인된 조직 손상을 완화시키는 치료 효과를 보이는 것으로 생각된다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 생쥐 무릎 윤활관절세포는 관절염이 유발된 암컷 DBA 생쥐 무릎관절에서 적출하였다. 우선 관절 주변 근육을 제거하여 윤활관절주머니 개방한 후 0.
- 배지는 2일마다 교환하여 주었다. 실험에는 3-5회 계대배양 세포를 사용하였다.
- 금은화 (제주도산, 2006) 200 g을 증류수 500 ㎖에 넣고 2시간동안 전탕한 후 여과하였다. 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 감압․농축 후 동결 건조하여 추출물 62 g (수득률 31%)을 얻었다.
- 오리엔트(한국)에서 분양 받은 태령 4주된 DBA 암컷 생쥐를 무균사육장치내에서 2주일동안 적응시킨 후 체중 20 g된 생쥐를 선별하여 사용하였다. 대조군 (CON군), 관절염 유발군 (AE군), 관절염 유발 후 금은화 투여군 (LT군)으로 나누었으며, 각군에 각 10마리씩 배정하였다.
데이터처리
- 유전자 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 수치화를 위해 Optimas 5.2를 이용한 영상분석(image analysis)을 실시하였다. 본 실험 결과의 유의성은 ANOVA test(SPSS14KO, SPSS.
- 2를 이용한 영상분석(image analysis)을 실시하였다. 본 실험 결과의 유의성은 ANOVA test(SPSS14KO, SPSS. USA)를 통해 확인하였다.
이론/모형
- 0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다. 금은화 추출물이 류마티스 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 macrophage migration inhibitory factor(MIF)에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. 윤활관절세포 - 5×105 cells/well을 6 well에 plating하고 12시간 후에 phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA, 1 ng/㎖)를 1시간 처리하여 MIF mRNA 발현을 유도하였다.
성능/효과
- 관절염 관련 MIF 유전자발현 억제 PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였는데, 금은화 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 즉, PMA 자극 시 발현되는 MIF mRNA 발현량에 비해 0.
- 관절염 관련 MIF 유전자발현 억제 PMA 자극에 의한 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였는데, 금은화 추출물 처리 후 농도-의존적으로 발현이 감소되었다. 즉, PMA 자극 시 발현되는 MIF mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에서 13.9%, 0.6 ㎎/㎖서 20.3%, 0.8 ㎎/㎖에서 20.6%, 1.0 ㎎/㎖에서 52.6% 감소하였다(Fig. 1).
- 관절염 유발 후 윤활관절막의 자유면(apical surface)에서 관찰되는 주된 형태학적 변화는 윤활관절세포 과형성(hyperplasia)으로 인한 윤활관절막 자유면의 두께 증가였다. 윤활강 쪽으로 많은 돌기(filopodia)를 내어 마치 세포질이 이탈한 것처럼 보이는 윤활관절세포의 출현도 증가하여 윤활관절막의 자유면 표면이 전반적으로 거칠게 나타났다.
- 관절염 유발 후 윤활관절막의 자유면(apical surface)에서 관찰되는 주된 형태학적 변화는 윤활관절세포 과형성(hyperplasia)으로 인한 윤활관절막 자유면의 두께 증가였다. 윤활강 쪽으로 많은 돌기(filopodia)를 내어 마치 세포질이 이탈한 것처럼 보이는 윤활관절세포의 출현도 증가하여 윤활관절막의 자유면 표면이 전반적으로 거칠게 나타났다. 또한 자유면 쪽으로 침윤하는 림프구의 증가도 관찰되었다.
- 대조군의 윤활관절막내 지방조직사이에서 적은 수로 분포한 혈관은 관절염 유발 후 증가되는 양상을 보였는데, 특히 윤활관절막의 자유면 기저부의 윤활세포주변에서 직경이 큰 모세혈관의 출현이 증가하였다. 그러나 관절염 유발 후 금은화 추출물을 경구 투여한 생쥐에서는 일부 윤활관절막의 자유면에서만 모세혈관의 급속한 출현 증가가 관찰되었을 뿐, 그 외 지역에서는 대조군과 유사한 분포양상을 보였다(Fig.
- 관절염 유발 후 윤활관절막내 주된 형태학적 변화 중 하나는 섬유화(fibrosis)와 섬유화를 주도하는 섬유모세포 침적 증가였다. 섬유화는 일부 지방층을 제외한 윤활관절막의 모든 지역에서 관찰되었고, 이런 섬유화부위에서는 세포가장자리가 잘 발달된 섬유모세포의 분포가 증가하였다.
- MIF의 양성반응세포의 분포는 관절염 유발 후 증가하는 반면, 관절염 유발 후 금은화 추출물을 경구 투여한 생쥐에서는 감소하였다. 이런 MIF 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 이런 MIF 양성반응세포는 윤활관절막 자유면 에 분포하였고, 핵막주변 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. MIF 양성반응의 영상분석 결과 관절염 유발군은 대조군에 비해 926% 증가하였으나, 관절염 유발 후 금은화 추출물 투여군은 관절염 유발군에 비해 73% 감소하였다(Table 1, Fig. 3A).
- 이런 COX-2 양성반응세포는 윤활관절막 자유면에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. COX-2 양성반응의 영상분석 결과 관절염 유발군은 대조군에 비해 1302% 증가하였으나, 관절염유발 후 금은화 추출물 투여군은 관절염 유발군에 비해 75% 감소하였다(Table 1, Fig. 3B).
- 단백분해효소인 MMP-9의 양성반응세포의 분포는 관절염 유발 후 증가하는 반면, 관절염 유발 후 금은화 추출물을 경구 투여한 생쥐에서는 감소하였다. 이런 MMP-9 양성반응세포는 윤활관절막 자유면에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다.
- 이런 MMP-9 양성반응세포는 윤활관절막 자유면에 분포하였고, 세포질에서 강한 양성반응을 보였다. MMP-9 양성반응의 영상분석 결과 관절염 유발군은 대조군에 비해 322% 증가하였으나, 관절염 유발 후 금은화 추출물 투여군은 관절염 유발군에 비해 41% 감소하였다(Table 1, Fig. 3C).
- 본 실험에서도 NF-κB에서도 활성에 의한 COX-2 양성반응세포의 윤활관절막내 분포 증가를 일으켰다.
- 특히 모든 지역에서 일어난 섬유화는 FLS에서의 IL-1β 신호기전에 의한 것으로 collagen fiber의 합성 촉진과 collagenase의 합성 또한 유도하고44), 관절염 유발 시 중성호성백혈구, 단핵구 및 림프구 등에 대한 주화작용45), 관절 내 연골과 연골 하 골조직의 파괴46) 및 prostaglandin 등의 염증매개물질의 분비를 자극한다47). 본 실험에서도 류마티스성 관절염의 윤활관절막내에서 FLS의 세포과 형성, 혈관신생성 증가, 섬유화 증가를 확인할 수 있었다.
- . 본 실험에서도 윤활관절막내에서 MMP-9 양성반응세포의 분포 증가가 관찰되었다.
- 이에 반해 金銀花 추출물 처리군의 윤활관절막내에서는 FLS의 세포과형성, 혈관신생성, 섬유화 등이 류마티스성 관절염 유발군보다 적었다. 이는 MIF 활성 억제에 의한 것으로 金銀花 추출물이 PMA로 자극된 윤활관절세포에서 MIF mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제한다는 in vitro의 결과와 LPS 동물모델을 통해 금은화 처리 후 MIF 양성반응세포의 분포 감소가 관찰된 in vivo 결과를 통해 확인할 수 있었다. 이러한 金銀花의 MIF 활성 억제는 NF-κB 활성을 저해함으로써 염증효소 COX-2 작용을 차단하게 되어 염증으로 유발되는 윤활관절막내 조직 손상을 막았다.
- 또한 윤활관절막내 MMP-9의 생성을 억제함으로써 세포외 기질의 손상과 염증세포의 이주증가를 막았다. 이상의 결과로 金銀花는 MIF의 활성 억제를 통해 초기 류마티스성 관절염의 진행을 차단하고 항염증작용을 통해 류마티스성 관절염로 기인된 조직 손상을 완화시키는 치료 효과를 보이는 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 金銀花 추출물은 윤활관절세포에서 MIF 유전자 발현을 억제하였고, LPS 유발 생쥐 관절염 모델에서 윤활관절막내 조직 손상의 완화와 MIF, COX-2, MMP-9 양성반응을 감소시켰다. 金銀花 추출물은 MIF 활성 억제를 통해 COX-2와 MMP-9 생성을 억제함으로서 류마티스성 관절염에 대한 치료 효과를 보이는 것으로 사료된다.
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