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문제 정의
- 본 연구에서는 사람 유래 폐암세포인 NCI-H460을 누드마우스의 전지 겸부에 피하 이식하여 일정한 크기까지 고형암을 형성시킨 후 in vivo 실험17,18)에서 난담반을 4주간 경구투여 하여 난담반의 항암효과에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 1주일에 2회씩 캘리퍼스(calipers)로 종양의 장, 단축을 측정하고 체중을 측정하였다. 최초 약물투여 후 28일이 경과하면 실험을 종료하고 실험 자료를 정리하여 시험물질에 의한 고형암 억제효과를 판정하였다.
- cells/nude mouse/100 ㎕을 injection하여 종양주를 획득한 후 계대군에 계대하였다. 3회에 걸친 반복계대로 원래의 고형암의 성질을 회복한 종양괴를 얻은 후 이 종양괴를 5마리의 계대군에 이식하였다.
- Changes in body weights in nude mice bearing NCI-H460 cell solid tumor. After nude mice with NCI-H460 cell-transplanted tumor were treated with 27 daily dose of IS4 45, 90 mg/kg), the body weights of nude mice in the positive control, NCI-H460 cell alone (■, n=7), IS4 45 mg/kg (◆, n=7) and IS4 90 mg/kg (▲, n=6) were measured two times a week.
- 부검 시 복대동맥을 통하여 채혈하여 혈청을 얻어 혈액생화학자동분석기(HITACHI, Tokyo, JAPAN)를 이용하여 alanine phopsphatase (ALP), creatinine (CRE), Calcium, glucose (GLU), alanine transferase (ALT), aspartate transaminase (AST), urea nitrogen (UN)를 분석하였다.
- 순화기간을 거친 후 건강한 계대군 피하에 종양괴를 이식하고 배양한 종양괴(tumor lump)를 적출하여 표면에 분포한 혈관과 지방층을 제거한 뒤, 신선한 종양조직만을 선별하여 무처치 동물의 피하에 이식하였다. 이식 후 개별 종양 체적이 100 mm3에 이르면 체중과 종양크기를 측정하고 무작위법으로 군분리 하였다.
- 시험 기간 중 시험 군들의 일일 증상 관찰을 통해 고형암 중심괴사가 나타나는 개체와 고형암 크기 측정일의 결과에서 고형암 부피가 1500 mm3 이상이 되는 개체를 확인하여 두 조건 중 한 가지에 해당하는 개체를 사망개체로 간주하고 생존증가율을 아래 공식과 같이 계산하였다.
- 시험 종료 시 방혈치사 시킨 후 간, 심장, 비장, 신장, 고환을 적출하여 중량을 측정하고 육안적인 소견을 관찰하였다. 조직을 10% 중성 포르말린 액에 고정한 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작한 다음 Hematoxylin & Eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 시험기간 중 체중 변화를 관찰하기위하여 시험 시작 후 7일마다 체중을 측정하였다.
- 시험물질을 생리식염수에 녹여 zonde를 사용하여 4주간 1일 1회 강제 경구투여 하였다.
- 실험동물 입수시 모든 동물의 일반건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였다. 시험을 실시하는데 적합하고 건강한 동물을 선발하며 환경에 적응시키기 위하여 1주일간의 순화기간을 거쳤다.
- 실험동물 입수시 모든 동물의 일반건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시하였다. 시험을 실시하는데 적합하고 건강한 동물을 선발하며 환경에 적응시키기 위하여 1주일간의 순화기간을 거쳤다.
- 순화기간을 거친 후 건강한 계대군 피하에 종양괴를 이식하고 배양한 종양괴(tumor lump)를 적출하여 표면에 분포한 혈관과 지방층을 제거한 뒤, 신선한 종양조직만을 선별하여 무처치 동물의 피하에 이식하였다. 이식 후 개별 종양 체적이 100 mm3에 이르면 체중과 종양크기를 측정하고 무작위법으로 군분리 하였다.
- 피부 위를 만져 종양편의 위치를 확인하고 1주일에 2회 이상 성장을 관찰하였다. 이식 후 부피가 100 mm3에 도달한 것들로 군분리 후 시험물질을 투여하였다.
- 조직을 10% 중성 포르말린 액에 고정한 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작한 다음 Hematoxylin & Eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 종양의 중심괴사(central necrosis)가 일어나기 전에 충분한 혈액공급으로 급속히 자라는 단계의 종양을 함유한 동물을 희생시켜 주로 급속한 분열이 일어나는 외곽부위를 일정한 크기(3 × 3 × 3 mm)로 잘라 종양절편을 만들었다.
- 1주일에 2회씩 캘리퍼스(calipers)로 종양의 장, 단축을 측정하고 체중을 측정하였다. 최초 약물투여 후 28일이 경과하면 실험을 종료하고 실험 자료를 정리하여 시험물질에 의한 고형암 억제효과를 판정하였다. 경시적인 고형암 부피 및 억제율의 계산은 아래의 공식을 이용 환산하였다.
- 종양의 중심괴사(central necrosis)가 일어나기 전에 충분한 혈액공급으로 급속히 자라는 단계의 종양을 함유한 동물을 희생시켜 주로 급속한 분열이 일어나는 외곽부위를 일정한 크기(3 × 3 × 3 mm)로 잘라 종양절편을 만들었다. 투관침(trocar)의 끝에 종양편(tumor fragment)을 올리고, 동물의 좌측후지 전측방을 약 4 mm가량 절제하여 이곳을 통하여 준비한 투관침을 삽입, 좌측전지의 후방의 체간 측면부에 끝이 이르도록 하였다. 투관침을 가볍고 빠르게 360도를 회전시키며 빼주어 종양편이 목표한 위치에 자리 잡도록 해주고 절제부위는 소독하였다.
- 투관침을 가볍고 빠르게 360도를 회전시키며 빼주어 종양편이 목표한 위치에 자리 잡도록 해주고 절제부위는 소독하였다. 피부 위를 만져 종양편의 위치를 확인하고 1주일에 2회 이상 성장을 관찰하였다. 이식 후 부피가 100 mm3에 도달한 것들로 군분리 후 시험물질을 투여하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 담반을 가열하여 탈수, 분말한 후 난백과 혼합, 반응시킨 난담반(고담반 : 난백 = 30 : 13)(InSan 4, 이하 IS4)을 사용하였다. 시험물질 100 ㎎을 deionized water에 총 양을 1 ㎖로 하여 녹이고, 시험물질이 다 녹은 뒤에 6,000 rpm으로 10분 동안 centrifuge를 하여 상층액을 0.
데이터처리
- 각각의 실험결과에 대해 분산의 동질성을 비교하기 위한 Levene's test를 실시하고, 분산이 동질성을 갖는 경우 one-way analysis of variance (ANOVA)를 실시하여 유의성이 관찰되면 대조군과의 유의차가 있는 시험군을 알아내기 위하여 Dunnett‘s t-test를 실시하였다(p<0.05 or p<0.01).
이론/모형
- 사육 상자에는 시험유형, 시험번호, 시험물질, 군 번호, 개체번호, 성별, 투여량, 실험기간 및 시험책임자를 기재한 개체식별 카드를 부착하였다. 개체식별은 tail marking법을 사용하였다.
성능/효과
- (IS4 45 mg/kg, IS4 90 mg/kg, p<0.01) 또한 IS4 45 mg/kg군의 PHOS 수치는 7.79 ± 0.82 mg/dl 로 NCI-H460 cell alone군의 9.27 ± 0.99 mg/dl 에 비해 유의성 있는 감소가 나타났다(IS4 45 mg/kg군, p<0.05).
- 4). 각 군들의 경시적 변화를 살펴보면 IS4 투여 후 12일 정도 후부터 NCI-H460 tumor 성장을 억제하여 15일 이후부터는 NCI-H460 cell alone 군에 비해 고형암 성장 억제 경향을 나타냈다. 고형암 억제 경향을 수치적으로 살펴보면 시험 후반일인 22일에서 NCI-H460 cell alone군 2806.
- 결론적으로 IS4가 장기에 부작용을 미치지 않으면서 NCI H460 인간폐암세포를 이식한 누드마우스의 종양성장을 억제하고 동시에 생존율을 높이는 항암효능을 나타내는 것으로 보이나, IS4를 투여한 기간이 짧은 점으로 미루어 장기에 대한 부작용을 완전히 배제할 수는 없다. 또한 IS4의 폐암 이외의 다른 암종에 대한 항암 작용, 효과, 작용 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료되며 향후 천연물, 특히 광물질을 이용한 항암제 개발의 진일보한 연구가 진행되기를 기대하는 바이다.
- . 난담반의 NCI-H460 인체폐암세포에 대한 세포자살유도효능을 알아보기 위해 생담반, 고담반 그리고 난담반에 대한 in vitro 실험을 진행한 결과 난담반이 세포살해 능력이 가장 높게 나타났다. 난담반은 농도 의존적으로 인체폐암세포의 성장을 억제시켰고 이에 대한 기전연구에서 caspase-3의 활성에 의해 세포사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다16).
- 본 실험기간 중 체중의 변화와 사료 및 음수 섭취량의 변화에 있어서 NCI-H460 cell 단독군보다 IS4의 투여군에서 투여 초기 체중과 사료의 섭취량이 감소하였으나, 1주 후부터는 정상으로 회복되었다(Fig. 1, 2, 3). 시험기간 중 군 간의 유의할만한 사항은 나타나지 않았다.
- 본 연구에서 고형암의 크기, 성장 억제율, 최종일의 고형암의 무게 및 부피측정 결과 모두 농도 의존적으로 유의성 있는 감소를 나타내었다. 또한 생존율은 농도 의존적으로 유의하게 증가하였으며, 이는 기존의 실험과 비교할 경우 난담반이 길경이나 삼기보폐탕, 동충하초 등 다른 천연물을 이용한 NCI-H460을 이용한 동물실험의 결과에 비해 효능과 생존율이 더 뛰어난 것으로 보인다30-32).
- 부검 시 혈액 생화학분석결과를 보면 혈중 ALP, CA, CRE, ALT, AST 수치에서는 시험물질 투여에 의한 유의할 만한 차이는 나타나지 않았다. 한편 혈중 UN 수치에서 시험물질 투여군 모두에서 유의성 있는 감소 결과가 나타났다.
- 시험 군에서 특이한 이상 증상이 발견되지 않았고 사료 섭취율 및 체중 변화에 있어서도 변화가 나타나지 않아 시험물질의 중독성은 보이지 않는 것으로 여겨지며 혈중 생화학적 수치에서도 유의할 만한 결과는 나타나지 않았으며 혈중 UN 수치에서 시험물질 투여군 모두에서 유의성 있는 감소 결과가 나타났다.
- 시험 기간 중 시험 군들의 일일 증상 관찰을 통해 고형암 중심괴사가 나타나는 개체와 고형암 크기 측정일의 결과에서 고형암 부피가 1,500 mm3 이상이 되는 개체를 확인하여 두 조건에 해당하는 개체를 사망개체로 간주하여 얻은 결과로 평균생존시간을 계산해보니 양성대조군인 NCI-H460 cell alone군은 18.29 ± 3.59일이었으며 IS4 45 mg/kg 투여군은 20.71 ± 2.61일로 생존율이 10.68% 증가하였다.
- 시험 기간 중의 고형암 부피를 일주일에 두 번 calipers를 사용 측정한 결과를 보면 NCI-H460 cell alone 군보다 IS4 45, 90 mg/kg 투여 군에서 tumor volume이 농도 의존적으로 억제되었다(Fig. 4). 각 군들의 경시적 변화를 살펴보면 IS4 투여 후 12일 정도 후부터 NCI-H460 tumor 성장을 억제하여 15일 이후부터는 NCI-H460 cell alone 군에 비해 고형암 성장 억제 경향을 나타냈다.
- 시험 종료일에 적출한 고형암의 무게 및 plethysmometer에 의한 부피측정 결과를 보면 양성대조군인 NCI-H460 cell alone의 고형암 무게 및 부피 2.52 ± 0.75 g과 4.67 ± 1.18 cm3에 비해 IS4 45 mg/kg군은 2.24 ± 0.78 g, 4.03 ± 1.28 cm3로 감소하였고 IS4 90 mg/kg군은 2.17 ± 0.60 g, 3.79 ± 0.85 cm3로 모두 유의성있는 감소가 나타났다(p<0.05)(Table 2)
- . 이러한 사항을 종합해 보면 난백 알부민의 구리대사 및 Lysozyme의 항균효과 등 난담반 구성 물질의 항암효능에는 다양한 기전이 작용할 것으로 추측된다.
- 측정한 고형암 부피를 NCI-H460 cell alone군의 고형암부피를 100% 기준으로 한 성장 억제율 분석 결과에서 보면 시험물질 투여 군들에서 8일 이후 25일까지 용량 의존적인 억제경향이 나타났다. (IS4 45 mg/kg I.
- 부검 시 혈액 생화학분석결과를 보면 혈중 ALP, CA, CRE, ALT, AST 수치에서는 시험물질 투여에 의한 유의할 만한 차이는 나타나지 않았다. 한편 혈중 UN 수치에서 시험물질 투여군 모두에서 유의성 있는 감소 결과가 나타났다. (IS4 45 mg/kg, IS4 90 mg/kg, p<0.
후속연구
- 결론적으로 IS4가 장기에 부작용을 미치지 않으면서 NCI H460 인간폐암세포를 이식한 누드마우스의 종양성장을 억제하고 동시에 생존율을 높이는 항암효능을 나타내는 것으로 보이나, IS4를 투여한 기간이 짧은 점으로 미루어 장기에 대한 부작용을 완전히 배제할 수는 없다. 또한 IS4의 폐암 이외의 다른 암종에 대한 항암 작용, 효과, 작용 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 사료되며 향후 천연물, 특히 광물질을 이용한 항암제 개발의 진일보한 연구가 진행되기를 기대하는 바이다.
- . 화학적으로 합성한 순수화합물 CuSO4는 담반이 아니므로 천연광물성 한약재인 담반으로 명명해서는 안 될 것이다. 천연 광물성 한약재인 담반의 주성분은 CuSO4·5H2O로 순수화합물 CuSO4와 형태, 성질 및 분자구조가 다르며 주성분 CuSO4 외의 미량부존 미네랄의 존재여부로 인해 약리작용이 다르다.
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