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문제 정의
- 따라서 본 연구는 補氣에 관여하는 생체 기능과 관련시켜 산양산삼 약침이 생체의 면역 체계에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흰쥐에게 健康 및 補氣에 관계하는 穴로 알려진 印堂(Ex-HN1), 膻中(CV17) 및 關元 (CV4)에 상응하는 부위에 산양산삼 약침을 처리한 후, LPS에 의한 급성기 염증 반응을 유도하여, 경시적으로 혈액 및 간장의 전염증성 cytokine들과 기타 생체 내 면역체계에 관계하는 생물학적 수치들을 검토하였다.
- 따라서 산양산삼의 補氣효능을 알아보기 위한 기초 연구로, 산양산삼 약침을 印堂 (Ex-HN1), 膻中(CV17), 關元(CV4)에 각각 4주간 처리한 흰쥐에게 LPS로 급성 염증 반응을 유도한 후, 혈액 및 간장의 전염증성 cytokine들과 기타 생체 내 면역 체계에 관 계하는 생물학적 수치들을 검토했다. 그 결과 LPS처리 직전(0h), 혈액 내 모든 전염증 성 cytokine들의 농도는 처리군들 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
가설 설정
- 9. Plasma total protein 및 albumin농도는 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않 았다. Albumin/Globulin비는 關元(CV4) 약침군이 가장 높은 값을 나타내었다.
제안 방법
- LPS 처리는 4주간의 약침처리 기간이 종료된 후, 5 ㎎/㎏의 수준으로 각 처리군 모 두 동일하게 복강 주사하였다.
- MCP-1 및 CINC-1농도 측정은 quantitative sandwich enzyme immunoassay kit (Biosource)로 실시했다. Detection limit는 < 8 pg/㎖이었다.
- Plasma ICAM-1 및 CINC농도는 시판 enzyme-linked immunosorbent assay microtiter plates (antibodies specific for rat ICAM-1 R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)와 CINC-1 (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, United Kingdom)이 코팅된 microtiter strips에 의해서 측정했다.
- Plasma 및 PLF 내의 NO2-/NO3-의 측정 은 kit (Assay Designs, Ann Arbor, MI, USA)로 측정했다.
- 혈액 채취는 시험 최종일에 LPS처리 직전, LPS처리 후, 2 h 및 5 h째에 각 처리군 별로 심장 천자법에 의해 채혈했다. 간장 채취는 LPS처리 후, 5시간째에 혈액 채취가 끝난 후 적출했다. 또한 peritoneal cells을 분리하기 위하여 10 ㎖의 phosphate buffered saline을 복강으로 주입한 후, PLF 를 채취했다.
- 대조군을 제외한 3개 약침처리군(印堂: Ex-HN1, 膻中: CV17, 關元: CV4)은 4주 동 안, 격일로 오후 6시에 각 처리군 별로 약침 처리(0.1 ㎖)를 하였으며, 약침 처리시의 Stress를 줄이기 위해 1.5 m의 합판에 10개 의 보정축을 설치한 보정틀을 제작, 이용하 였다. 取穴은 인체의 印堂(Ex-HN1), 膻中 (CV17) 및 關元(CV4)에 상응하는 부위를 WHO의 표준 경혈 정위법12)의 방법에 준해 取穴하였다.
- 산양산삼의 면역조절 기능을 알아보기 위한 기초연구로, 산양산삼 약침을 4주간 처리 한 흰쥐에게 LPS로 급성 염증 반응을 유도한 후, 혈액 및 간장의 전염증성 cytokine들과 기타 생체 내 면역체계에 하는 생물학적 수치들을 검토한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.
- 평균 체중이 196.75 ± 6.28 g의 SpragueDawley계 수컷 24두를 1주일 간 실험 식이 에 적응시킨 후, 평균 체중이 유사하게 대조 군(LPS), 關元(CV4)약침군(CV4 산삼약침 + LPS), 膻中(CV17)약침군(CV17 산삼약침 + LPS) 및 印堂(Ex-HN1)약침군(Ex-HN1 산 삼약침 + LPS)으로 나누어, 각 처리군당 6두씩 임의 배치했으며, 동물실험은 상지대 학교실험동물윤리위원회(Sangji University Animal Welfare)의 규정에 따라 수행했다.
- Lymphocyte subpopulation의 검사는 LPS 처리 후, 5시간째의 혈액을 사용했다. 혈액 내의 CD4와 CD8의 분포는 flow cytometry 로 분석했다. Th cells과 cytotoxic T cells 의 동정을 위해 fluorescein-conjugated mouse anti-rat CD8과 phycoerythrinconjugated mouse anti-rat CD4 (Serotec, Oxford, United Kingdom)가 각각 사용되었 다.
- 혈액 채취는 시험 최종일에 LPS처리 직전, LPS처리 후, 2 h 및 5 h째에 각 처리군 별로 심장 천자법에 의해 채혈했다. 간장 채취는 LPS처리 후, 5시간째에 혈액 채취가 끝난 후 적출했다.
대상 데이터
- Cytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6 및 IL-10)정량은 시판 Kit (Biosource International, USA)를 이용했다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS package를 이용하여 one-way ANOVA검정을 수행하였으며, 각 처리군 간의 유의성 검정은 Duncan's multiple range test에 의해 p<0.05 수준에 서 실시했다.
이론/모형
- 3 pg/㎖이었다. PGE2농도 측정은 enzyme-linked immunosorbent assay로 했다. PGE2농도의 측정 한계는 g <8.
- 5 m의 합판에 10개 의 보정축을 설치한 보정틀을 제작, 이용하 였다. 取穴은 인체의 印堂(Ex-HN1), 膻中 (CV17) 및 關元(CV4)에 상응하는 부위를 WHO의 표준 경혈 정위법12)의 방법에 준해 取穴하였다.
- 본 연구에서 LPS의 주입 농도는 5 ㎎/㎏ 의 수준에서 실시했는데, 이러한 수준은 급성 염증 반응을 유발하기 위한 적정 수준이 라는 다른 연구자19-21)의 시험 결과를 참고 했으며, LPS처리 후, cytokine측정을 위한 채혈 시간 결정은 전염증성 cytokine들의 최대 농도가 유지되는 시간을 고려한 다른 연구자들의 시험결과10)를 참고했다.
성능/효과
- 1. Plasma IL-1β농도의 경시적 변동치는 LPS처리 후, 2h째에는 약침 처리군 모두 가 대조군보다 낮은 값을 나타내었으며, 약침 처리군 간에서는 유의한 차이를 나 타내지 않았다.
- 2. Plasma IL-6농도의 경시적 변동치는 LPS처리 후, 2h째에는 약침군이 대조군 보다 낮은 경향을 보였으나, 膻中(CV17) 약침군은 대조군과 유의한 차이는 아니었다. LPS처리 후, 5h째에는 약침군 모두 가 대조군보다 낮은 값을 나타내었다.
- 3. Plasma TNF-α농도는 LPS처리 후, 2h째 및 5h째 모두에서 약침군이 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 膻中(CV17)약침군 은 대조군과 유의한 차이는 아니었다.
- 4. Plasma IL-10농도는 LPS처리 후, 2h째에 는 전 처리군 모두 유의한 차이를 나타 내지 않았다. 그러나 LPS처리 후, 5h째에서는 약침군 모두가 대조군보다 높은 경향을 보였으나, 膻中(CV17)약침군은 대조군과 유의한 차이는 아니었다.
- 5. 간장 IL-1β 및 IL-6농도는 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 6. lymphocyte subpopulations은 CD4는 關 元(CV4)약침군이 대조군보다 높은 값을 나타내었으며, CD8은 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. CD4/CD8의 비율은 關元(CV4)약침군이 높은 수치를 나타내었다
- 8. PLF MCP-1농도는 關元(CV4)약침군이 대조군보다 낮은 값을 보였다. PGE2농도 는 關元(CV4)약침군이 대조군보다 높은 값을 나타내었다.
- NO2-/NO3-농도는 약침군모두가 대조군보다 낮은 값을 보였으며, 약침군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. ICAM-1농도는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 印堂(Ex-HN1)약침군이 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다. CINC-1농도는 關元(CV4)약침군이 대조군보다 낮은 값을 나타내었다.
- NO2-/NO3-농도는 약침군모두가 대조군보다 낮은 값을 보였으며, 약침군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. ICAM-1농도는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 印堂(Ex-HN1)약침군이 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다. CINC-1농도는 關元(CV4)약침군이 대조군보다 낮은 값을 나타내었다.
- Table 2는 LPS처리 후, 각 처리군 별 plasma IL-1β농도의 경시적 변동치를 나타 낸 것이다. LPS처리 직전(0 h)에는 대조군 을 비롯한 전 처리군 모두가 상호간에 유의 한 차이를 나타내지 않았으나, LPS처리 후, 2시간째(2 h)에 전 처리군 모두가 급격히 상승하여 5시간째(5 h)까지도 상승 상태를 유지했다. 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처 리 후, 2 h째에는 약침 처리군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었으며, 약침 처리 군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- Table 5는 LPS처리 후, 각 처리군 별 Plasma IL-10농도의 경시적 변동치를 나타 낸 것이다. LPS처리 직전(0h)에는 대조군을 비롯한 전 처리군 모두가 상호간에 유의한 차이를 나타내지 않았으나, LPS처리 후, 2 시간째(2h)에 전 처리군 모두가 상승하여 5 시간째(5h)까지도 상승 상태를 유지했다. 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처리 후, 2h째에 는 전 처리군 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- LPS처리 후, 5h째에 각 처리군 별 lymphocyte subpopulations의 구성비는 CD4는 關元(CV4)약침군이 대조군보다 높은 값을 나타내었으며, CD8은 처리군 간에 유 의한 차이를 나타내지 않았다. CD4/CD8의 비율은 關元(CV4)약침군이 높은 수치를 나 타내었다.
- Plasma PMN phagocytosis는 전 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. NO2-/NO3-농도는 약침군모두가 대조군보다 낮은 값을 보였으며, 약침군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. ICAM-1농도는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 印堂(Ex-HN1)약침군이 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- Plasma PMN phagocytosis는 전 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. NO2-/NO3-농도는 약침군모두가 대조군보다 낮은 값을 보였으며, 약침군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. ICAM-1농도는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 印堂(Ex-HN1)약침군이 대조군과 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- Plasma TNF-α농도는 LPS처리 후, 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처리 후, 2h째 및 5h째 모두에서 약침군이 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 膻中(CV17)약침군은 대조 군과 유의한 차이는 아니었다.
- LPS처리 직전(0 h)에는 대조군 을 비롯한 전 처리군 모두가 상호간에 유의 한 차이를 나타내지 않았으나, LPS처리 후, 2시간째(2 h)에 전 처리군 모두가 급격히 상승하여 5시간째(5 h)까지도 상승 상태를 유지했다. 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처 리 후, 2 h째에는 약침 처리군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었으며, 약침 처리 군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다. LPS처리 후, 5 h째에는 약침 처리군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었으며, 약침 처리군 간에서는 關元(CV4)약침군이 여타 약침군보다 낮은 값을 나타내었다.
- LPS처리 직전(0h)에는 대조군을 비롯한 전 처리군 모두가 상호간에 유의한 차이를 나타내지 않았으나, LPS처리 후, 2시간째(2h)에 전 처리군 모두가 급격히 상 승하여 5시간째(5h) 까지도 상승 상태를 유지했다. 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처리 후, 2h째 및 5h째 모두에서 약침군이 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 膻中(CV17) 약침군은 대조군과 유의한 차이는 아니었다.
- LPS처리 직전(0h)에는 대조군을 비롯한 전 처리군 모두가 상호간에 유의한 차이를 나타내지 않았으나, LPS처리 후, 2 시간째(2h)에 전 처리군 모두가 급격히 상승하여 5시간째(5h)까지도 상승상태를 유지했다. 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처리 후, 2h째에는 약침군이 대조군보다 낮은 경향을 보였으나, 膻中(CV17)약침군은 대조군 과 유의한 차이는 아니었다. LPS처리 후, 5h째에는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 값을 나타내었다.
- 따라서 산양산삼의 補氣효능을 알아보기 위한 기초 연구로, 산양산삼 약침을 印堂 (Ex-HN1), 膻中(CV17), 關元(CV4)에 각각 4주간 처리한 흰쥐에게 LPS로 급성 염증 반응을 유도한 후, 혈액 및 간장의 전염증성 cytokine들과 기타 생체 내 면역 체계에 관 계하는 생물학적 수치들을 검토했다. 그 결과 LPS처리 직전(0h), 혈액 내 모든 전염증 성 cytokine들의 농도는 처리군들 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과 는 본 연구에 사용된 흰쥐들은 염증 상태가 아닌 극히 정상적인 상태임을 시사해준다.
- 각 처리군 별 상승 수준은 LPS처리 후, 2h째에 는 전 처리군 모두 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 LPS처리 후, 5h째에서는 약침군 모두가 대조군보다 높은 경향을 보였으나, 膻中(CV17)약침군은 대조군과 유의한 차이는 아니었다.
- 그러나 전염증성 cytokine들의 각각의 경시적 변동 경향은 처리군 별 다소 차이를 나타내어, Plasma IL-1β는 2h째에는 약침 처리군 모두가 대조 군보다 낮은 값을 나타내었으며, 약침 처리 군 간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았다.
- 그러나 TNF-α는 LPS의 shock에 의해 Kuffer cell로부터 방출되며, 간장에 상처를 주고 간세포의 사멸을 일으 키며33), TNF-α의 과잉 생산은 광범위의 pathogenic상태를 유발하므로 생체 내에서 TNF-α의 생산을 하락시키는 방법을 연구 하고 있다16). 따라서 이러한 3종류의 전염증성 cytokine들의 처리군 별 농도 차이는 처리군에 따라 염증 상태의 수준이 다르다는 것을 나타내며, 결과적으로 대조군보다 약침 처리군 모두가 염증의 수준이 낮으며, 특히 關元(CV4) 및 印堂(Ex-HN1)약침군이 가장 낮은 염증 수준임을 시사해 준다.
- 이러한 결과 는 본 연구에 사용된 흰쥐들은 염증 상태가 아닌 극히 정상적인 상태임을 시사해준다. 또한 LPS처리 후, 2h째에서 처리군에 관계 없이 모든 전염증성 cytokine들이 급격히 증가하여 LPS처리 후, 5시간째에서도 증가 상태를 유지했다. 이러한 결과는 LPS shock 가 5시간 이상 지속되었다는 다른 연구자들 의 결과10)와 일치했다.
- 또한 Plasma total protein 및 albumin농 도는 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았으나, Albumin/Globulin비는 關元(CV4) 약침군이 가장 높은 값을 나타내어 關元 (CV4) 산삼약침의 항 염증효과가 가장 우수함을 인지시켜주었다.
- 본 연구 의 결과는 IL-1β 및 Il-6농도는 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았으나, 關元 (CV4)약침군이 대조군보다 TNF-α농도는 낮고, IL-10의 농도는 높게 나타나 關元 (CV4)약침군의 염증 상태가 가장 완화되었음을 시사한다.
- ICAM-1 및 CINC-1도 염증 부위에서 염증 상태를 악화 시키는 중요한 역할을 할 수 있다43,44). 본 연구의 결과에서는 Plasma PMN phagocytosis는 전 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. NO2-/NO3-농도는 약침군 모두가 대조군보다 낮은 값을 보였으며, 약침군 간에서는 유의한 차이를 나타내 지 않았다.
- 그 결과 LPS처리 직전(0h), 혈액 내 모든 전염증 성 cytokine들의 농도는 처리군들 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과 는 본 연구에 사용된 흰쥐들은 염증 상태가 아닌 극히 정상적인 상태임을 시사해준다. 또한 LPS처리 후, 2h째에서 처리군에 관계 없이 모든 전염증성 cytokine들이 급격히 증가하여 LPS처리 후, 5시간째에서도 증가 상태를 유지했다.
- 그러나 印堂(Ex-HN1)약침군은 대조군과 유의한 차이는 아니었다. 이러한 생체 내 염증에 관여하는 기능성 물질들의 농도 변화는 염증 상태의 수준을 나타내주는 지표가 될 수 있으며, 본 시험의 결과를 검토해 보면 關元 (CV4) 산삼약침이 염증 상태의 완화에 효과적임을 시사하고 있다.
- Albumin/Globulin비는 關元(CV4) 약침군이 가장 높은 값을 나타내었다. 이상의 결과를 종합해 보면 산삼 약침은 LPS 염증 반응에 면역 조절능을 나타내며, 특히 關元(CV4) 산삼약침은 염증 제어 효과가 우수함을 시사한다.
후속연구
- 이처럼 蔘은 그 효능이 우수한 영약으로 알려져 있으나 자생의 산삼은 생산량이 제한되어 있고 경제적 부담의 한계가 있어 임상에 응용하기에 어려움이 많다. 따라서 최근에 산삼의 씨앗 이나 幼蔘을 인위적으로 산에 뿌려 야생 재배한 산양산삼4)을 생산하고 있으나 산양산삼은 인위적 재배인 관계로 자생의 산삼과 비교하여 생육환경 등의 식물 생태학적인 면에서 다소 차이가 있어 그 효능에 대한 구체적인 평가가 필요하다. 따라서 최근 들 어 몇몇 연구자들에 의해 산양산삼의 효능 효과 실험이 수행되어 우수한 생물학적 효 능이 밝혀졌다.
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