This study showed the increase of antitumor activities of water soluble E. sinica extract by nano-encapsulation process with lecithin. Five groups of lecithin only group (LO), lecithin nano-encapsulated E. sinica group (LE), E. sinica only group (EO), one negative control group (NCO) and positive co...
This study showed the increase of antitumor activities of water soluble E. sinica extract by nano-encapsulation process with lecithin. Five groups of lecithin only group (LO), lecithin nano-encapsulated E. sinica group (LE), E. sinica only group (EO), one negative control group (NCO) and positive control group (PCO) were set for several anticancer experiment and fed into Sarcoma-180 injected mice. The cytotoxicity of LE on the human normal kidney cell (HEK293) showed 14.8% lower than 19.2% of EO and 18.4% of LO. Growth of human liver carcinoma cell and human stomach carcinoma cell as representative of digestive system in vitro was inhibited up to about 85.1% and 87.3%, in adding 1.0 mg/$m{\ell}$ of LE, which values 15% higher than that from conventional EO. The survival rates of each mice group were 40%, 63%, 48%, 33% and 100%, respectively after 40 days of injecting Sarcoma-180. The increment of their body weights of the extract feeding groups was suppressed down to 10~15%, compared to the negative control. The nano-particles also reduced the hypertrophy of the internal organs such as spleen and liver down to 15~20%, compared to those as the other groups. Among them, LE effectively reduced the size of tumor form to 20%. From these results, in vitro and in vivo antitumor activities of E. sinica could be enhanced by using nano-encapsulation process with lecithin because of better permeation into the cancer cells by confocal observations.
This study showed the increase of antitumor activities of water soluble E. sinica extract by nano-encapsulation process with lecithin. Five groups of lecithin only group (LO), lecithin nano-encapsulated E. sinica group (LE), E. sinica only group (EO), one negative control group (NCO) and positive control group (PCO) were set for several anticancer experiment and fed into Sarcoma-180 injected mice. The cytotoxicity of LE on the human normal kidney cell (HEK293) showed 14.8% lower than 19.2% of EO and 18.4% of LO. Growth of human liver carcinoma cell and human stomach carcinoma cell as representative of digestive system in vitro was inhibited up to about 85.1% and 87.3%, in adding 1.0 mg/$m{\ell}$ of LE, which values 15% higher than that from conventional EO. The survival rates of each mice group were 40%, 63%, 48%, 33% and 100%, respectively after 40 days of injecting Sarcoma-180. The increment of their body weights of the extract feeding groups was suppressed down to 10~15%, compared to the negative control. The nano-particles also reduced the hypertrophy of the internal organs such as spleen and liver down to 15~20%, compared to those as the other groups. Among them, LE effectively reduced the size of tumor form to 20%. From these results, in vitro and in vivo antitumor activities of E. sinica could be enhanced by using nano-encapsulation process with lecithin because of better permeation into the cancer cells by confocal observations.
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문제 정의
본 연구에서는 식품과 천연물 중 암의 발생을 억제 또는 지연하거나 항암보조기능 성분들이 다수 포함되어 있다는 것을 밝혀낸 다양한 연구 결과 (Jin et al., 2008; Ha et al., 2009)를 근거로 보통 열수추출 방법을 통해 얻은 마황 추출물을 생체적합성 고분자 소재인 레시틴으로 나노 입자화하여 in vitro 및 in vivo 활성을 비교함으로써 항암효과를 알아보았다. 최근 마황의 각성 작용으로 인해 마황이 뛰어난 항암 활성 등의 유용한 기능을 가짐에도 불구하고 그 이용이 제한적이다 (Marchei et al.
, 2007). 이에 본 연구에서는 적은 양의 추출물로도 세포 수준에서 최적의 효과를 낼 수 있는 나노의 가치를 재평가하고, 더 나아가 이러한 항암 효과를 극대화시킬 수 있는 기능성 소재와 관련된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 마황 나노 포집물의 다양한 분석 연구 및 세포 투과 관찰 실험을 수행하였다.
제안 방법
그리고 레시틴 (L-α-phosphatidylcholine, Sigma, USA)을 둥근바닥플라스크에 넣어 chloroform (Sigma, USA)으로 녹였고, 이후 감압 회전상태에서 유기용매를 모두 날려 multilayer를 형성시켰다.
완전히 건조되어 다층의 layer가 형성된 둥근바닥플라스크에 액상의 마황 추출시료를 넣고, 초음파 분산기 VCX500 (Sonics & Materials Inc., USA)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다 (Fallouh et al, 1986).
, USA)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다 (Fallouh et al, 1986). 본 실험에서 레시틴만 나노 입자화 한 것은 LO로, 마황 나노 추출물 레시틴 나노 입자는 LE로, 마황 추출물은 EO로, 음성대조군은 증류수로써 NCO로, 양성대조군은 대표적인 항암제인 Taxol (Sigma, USA)로써 PCO로 각각 표기하였다 (Kim and Lee, 2001; Sandoval et al, 2002).
TEM은 나노입자 한 개를 크게 확대하여 관찰하는 것도 가능하기 때문에 입자의 모양, 입자의 크기 등을 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있다. TEM 사진을 찍기 위해서 phosphotungstic acid solution을 이용하여 negative staining을 하였다. 나노 입자가 충분히 염색이 된 후, formvar/carbon으로 코팅된 grid에 얇게 펴서 말린 뒤 EFTEM (LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Germany), 120 kV에서 관찰 하였다 (Saxena et al.
TEM 사진을 찍기 위해서 phosphotungstic acid solution을 이용하여 negative staining을 하였다. 나노 입자가 충분히 염색이 된 후, formvar/carbon으로 코팅된 grid에 얇게 펴서 말린 뒤 EFTEM (LEO 912AB OMEGA, Carl Zeiss, Germany), 120 kV에서 관찰 하였다 (Saxena et al., 2005).
세포의 농도가 4~5×104 cells/㎖ 가 되도록 NucleoCounterTM (Cell counting device, New Brunswick, USA)를 이용해 세포수를 세었고 적정 농도로 배지희석을 한 후, 96well plate의 각 well에 100 ㎕ 씩 분주하였다.
양성대조군인 Taxol은 이미 효능이 알려진 약물이므로 추출물의 농도 대비 20배 희석된 5 ㎎/㎏ 의 농도로 제조하여 마황 시료와 동일한 조건에서 매일 1회분씩 나누어 투여하였다 (Bárdos et al., 2003).
세포의 농도가 4~5×104 cells/㎖ 가 되도록 NucleoCounterTM (Cell counting device, New Brunswick, USA)를 이용해 세포수를 세었고 적정 농도로 배지희석을 한 후, 96well plate의 각 well에 100 ㎕ 씩 분주하였다. 24시간 동안 배양 (37℃, 5% CO2 incubator)한 후, 각각의 시료를 최종농도 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎎/㎖ 가 되게 100 ㎕ 씩 세포가 배양된 배지에 첨가 분주하여 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양이 완료된 후에 상층액을 aspirator를 이용해 제거하였고, 차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100 ㎕ 를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하여 세포가 더 이상 자라지 못하게 하였다.
배양이 완료된 후에 상층액을 aspirator를 이용해 제거하였고, 차가운 10% (w/v) TCA (trichloroacetic acid) 100 ㎕ 를 가하여 4℃에서 1시간 동안 방치하여 세포가 더 이상 자라지 못하게 하였다. 증류수로 5회 반복 세척하여 TCA를 제거 하고 실온에서 plate를 건조한 뒤 각 well에 1% (v/v) acetic acid에 녹인 0.4% (w/v) SRB용액을 100 ㎕ 씩 첨가하고 상온에서 30분 동안 염색시켰다. 결합되지 않은 SRB 염색액은 1% acetic acid로 5회 정도 세척, 건조시킨 후에 10 mM Tris buffer 100 ㎕ 를 첨가하여 염색액을 녹여냈다.
Micro reader (Molecular Devices, Thermo max, USA) 를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Selectivity 측정은 SRB assay를 이용하여 정상세포 (HEK293)에 대한 각 sample 농도에서 세포독성을 측정하고, SRB assay를 이용하여 각 암세포주의 생육억제활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 selectivity를 계산하였다 (Dol and Peto, 1981).
Cell scraper (Biocompare, UK)로 배양 flask로부터 cell을 분리한 후 2×106 cells/㎖ 의 농도로 조절하여 200 ㎕ 를 마우스 복강에 1 ㎖ syringe를 이용하여 피하이식 하였다. 상기의 방법으로 마우스 복강 내에서 6~7일 간격으로 계대배양을 통해 보존된 sarcoma-180 세포를 취하여 복수암 실험군 마우스의 복강과고형암 실험군 마우스의 왼쪽 대퇴부 근육에 200 ㎕ 씩 피하이식 하였다. 종양세포 이식 후 21일 동안 시료의 농도를 100 ㎎/㎖ 로 조절하여 매일 동일한 시간에 0.
상기의 방법으로 마우스 복강 내에서 6~7일 간격으로 계대배양을 통해 보존된 sarcoma-180 세포를 취하여 복수암 실험군 마우스의 복강과고형암 실험군 마우스의 왼쪽 대퇴부 근육에 200 ㎕ 씩 피하이식 하였다. 종양세포 이식 후 21일 동안 시료의 농도를 100 ㎎/㎖ 로 조절하여 매일 동일한 시간에 0.5 ㎖ 씩 경구 투여하였다. 양성대조군인 Taxol은 이미 효능이 알려진 약물이므로 추출물의 농도 대비 20배 희석된 5 ㎎/㎏ 의 농도로 제조하여 마황 시료와 동일한 조건에서 매일 1회분씩 나누어 투여하였다 (Bárdos et al.
, 2003). 40일간 3일 간격으로 복수암 유발 마우스의 체중을 측정하였고, 생존율 (survival rate)을 측정하였으며, 고형암 유발 마우스에서 종양 세포 이식 40일 후 희생시켜 고형암과 비장 및 간의 무게를 측정하여 체중에 대한 장기의 중량을 측정하였다 (Jung et al., 2002; Kim et al., 2007).
나노시료 첨가에 의한 면역세포 B cell (Raji)의 분포양상을 공초점 레이저 주사 현미경 LSM510 META NLO (Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)으로 관찰하였다. 나노입자 제조를 위해 초음파 분산을 시작할 때, dye로 FITC (fluorescein isothiocyanate)를 넣어줌으로써 fluorescence tagging 하였다.
나노시료 첨가에 의한 면역세포 B cell (Raji)의 분포양상을 공초점 레이저 주사 현미경 LSM510 META NLO (Carl Zeiss Jena GmbH, Germany)으로 관찰하였다. 나노입자 제조를 위해 초음파 분산을 시작할 때, dye로 FITC (fluorescein isothiocyanate)를 넣어줌으로써 fluorescence tagging 하였다. 1 ㎖ 의 면역 B세포 2 × 108 cells/㎖ 을 CO2 농도 5%, 30℃의 incubator에서 배양한 후, FITC로 염색된 나노시료 (1 ㎎/㎖) 100 ㎕ 와 1시간 동안 반응시켰다 (Lee et al.
실험에 사용된 마황 나노 시료의 농도는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 그리고 1.0 ㎎/㎖로 조절하여 정상세포에 대한 세포독성과 각 암세포에 대한 성장 효과를 검토하였다. Fig.
복수암 유발에 따른 복수의 형성을 확인하기 위한 지표로 Table 1에서와 같이 체중 측정 결과를 이용하였다. EO 및 LE 실험군이 S-180 복수암 주사 후 최장 40일까지 생존하였기 때문에 전체 마우스 군에 시료를 매일 경구투여하며 3일 간격으로 40일까지 마우스의 체중과 수명을 측정하였다. 증류수를 경구 투여한 마우스 군의 최종 체중이 48.
대상 데이터
In vivo 실험에 사용된 실험동물은 오리엔트바이오 (KOREA)로부터 4주령의 ICR (Female, 22~24 g) 마우스를 구입하여 온도 20~25℃, 습도 55 ± 10%가 유지 가능한 사육실에서 각 군별로 8마리씩 일주일간 안정기를 취한 후 사용하였다.
본 실험에 사용된 마황은 경동시장에서 2009년 국내산을 건시료로 구입하여 음지의 상온에서 보관하면서 사용하였다. 마황 50 g을 수직 환류 냉각기에 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 10배의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 24시간 추출하였다.
마황 50 g을 수직 환류 냉각기에 부착된 추출 flask에 시료 중량에 대하여 10배의 증류수를 추출용매로 사용하여 60℃에서 24시간 추출하였다. 얻어진 추출물을 감압여과장치 (Rotary Vacuum Evaporator N-N series, Eyela, Germany)로 여과하여 농축을 하였고, 동결건조를 한 후에 파우더를 얻어 실험에 사용하였다 (Jeong et al., 2009).
나노 입자화를 통한 항암활성 증진효과의 탐색을 위해 천연 항암 효과가 기대되는 마황 추출물 (Park et al., 2004)을 이용해 nanoparticle을 제조하였다. 우선 마황 60℃ 물 추출 시료 50 ㎎ 을 1 ㎎/㎖ 의 농도로 증류수에 녹였다.
세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640을 사용하였고, 그 밖에 배양에 필요한 시약으로 hepes buffer (Sigma, USA)와 fetal bovine serum (Gibco, USA), gentamycin sulfate (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA) 를 사용하였다.
실험에 이용된 세포주로는 추출물 및 나노입자의 정상 세포에 대한 독성을 알아보기 위해 인간 신장 세포인 HEK293 (Kidney normal, Human, ATCC, USA)를 이용하였고, 세포 수준의 항암 활성을 평가하기 위해 인간 유래 간암 세포인 Hep3B (Hepatoma adenocarcinoma, Human, ATCC, USA), 인간 유래 위암 세포인 AGS (Stomach adenocarcinoma, Human, KCLB, Korea)를 이용하였다. 모든 세포는 RPMI 1640배지에서 10% heating-inactivated FBS (fetal bovine serum)으로 적응시켜 배양하여 실험에 이용하였다.
마황 나노입자의 정상세포독성 및 항암 활성 측정을 위해 사용된 SRB (Sulforhodamine B) assay는 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법이다. 실험에 사용된 세포주는 인간 신장 유래 정상세포인 HEK293과 소화계 장기 유래의 대표적인 암인 간암세포 (Hep3B), 위암세포 (AGS)였다. 세포의 농도가 4~5×104 cells/㎖ 가 되도록 NucleoCounterTM (Cell counting device, New Brunswick, USA)를 이용해 세포수를 세었고 적정 농도로 배지희석을 한 후, 96well plate의 각 well에 100 ㎕ 씩 분주하였다.
Sarcoma-180 세포를 10% heating inactivated FBS를 함유한 RPMI 1640의 기본 배지에서 배양하였다. Cell scraper (Biocompare, UK)로 배양 flask로부터 cell을 분리한 후 2×106 cells/㎖ 의 농도로 조절하여 200 ㎕ 를 마우스 복강에 1 ㎖ syringe를 이용하여 피하이식 하였다.
데이터처리
SPSS program (ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 T-test로 검정하였으며 모든 data는 평균 ± 표준오차 (Mean ± standard error)로 나타내었다.
이론/모형
나노 입자의 분포 및 확인을 위해 사용된 장치는 TEM (Transmission Electron Microscopy)이고, 나노 입자의 크기를 알아보기 위해 사용된 장치는 DLS (Dynamic Light Scattering, Benthos, USA)이다. TEM은 나노입자 한 개를 크게 확대하여 관찰하는 것도 가능하기 때문에 입자의 모양, 입자의 크기 등을 결정하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
성능/효과
레시틴으로 나노 입자화한 경우, 마황 추출물군의 세포독성보다 4% 낮은 세포 독성을 나타냈다. 전반적으로 20% 이하로 나타난 마황 시료의 세포 독성 값은 HEK293 세포를 이용하여 천연알칼로이드의 세포 독성을 연구한 결과인 40%와 비교했을 때 (Ji et al., 2008) 세포 수준에서 큰 영향을 주지 않으며, 경미한 독성을 보이는 것으로 사료된다.
4의 (A)와 (B)는 인간 간암 세포 유래 Hep3B와 인간 위암 세포 유래 AGS에 대한 항암 활성을 나타낸 것이다. 1.0 ㎎/㎖ 의 농도에서 간암세포와 위암세포 모두에서 나노 입자화한 LE가 각각 85.1%, 87.3%로 가장 높은 항암 활성을 나타냈다. 마황 열수 추출물 EO가 간암세포에서 67.
, 2009). 음성대조군에서 16일째부터 생존율의 감소가 일어나 33%의 생존율을 나타낸 것과 대조적으로, 마황을 나노 입자화한 LE군에서는 63%로 생존율의 감소가 30% 정도 더디게 진행되었다. Taxol을 투여한 양성대조군의 경우 실험이 종료되는 40일 째까지 100%의 생존율을 나타냈다 (Jagetia and Nayak, 1996).
6은 Confocal 현미경을 이용해 마황 레시틴 나노입자의 모습을 실시간 10분 간격으로 찍은 사진으로서, 나타난 면역세포에서 나노 입자의 침투정도를 확인할 수 있다. 따라서 본 연구를 위해 제조한 나노 시료의 경우 입자의 크기가 50~200 ㎚로 분산됨에 따라 세포의 침투의 용이성이 일반 열수 추출물에 비해 뛰어난 것을 확인 할 수 있다. 100 ㎚ 이하의 소수성 표면을 갖는 리포솜은 약물의 분자성 약물의 운반을 용이하게 하여 세포에 대한 친화성이 증가하게 된다.
증류수를 경구 투여한 마우스 군의 최종 체중이 48.8 ± 0.5 g으로 나타난 것과 대조적으로 LO군에서는 44.0 ± 0.4 g, EO군에서는 42.6 ± 0.2 g, LE군에서는 39.1 ± 1.3 g로 나타나 전반적으로 체중 감소를 보였다.
후속연구
Taxol을 투여한 양성대조군의 경우 실험이 종료되는 40일 째까지 100%의 생존율을 나타냈다 (Jagetia and Nayak, 1996). 본 실험 결과를 통해 복수암에 효과적으로 작용하는 마황 레시틴 나노입자의 기능을 확인하였고, 이번 연구 결과를 기반으로 나노입자의 항암 기작에 대한 더욱 심도있는 연구가 진행될 필요가 있을 것으로 사료 된다. 나노입자를 경구 투여한 LE군에서의 고형암 성장 억제 효과 및 면역 장기에 미치는 영향을 알아보고자 종양세포 이식 40일 후 고형암 및 장기의 무게를 측정한 결과를 Table 2에 나타냈다.
, 2010) 면역 기능이 약한 사람들에게는 더욱 치명적이다. 따라서 나노입자의 섭취 시장기의 비대화가 일어나지 않은 것으로 보아, 향후 나노 단위로 포집한 천연물이 항암소재로서 높은 부가가치를 가질 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마황은 어떤 질환에 효과가 있는가?
마황은 중국 북부, 몽골 등지에 주로 분포하는 길이가 30~70 ㎝ 인 한약재로서 ephedrine, pseudoephedrine, ephedroxane, norephedrine 등 체액성 면역과 관련된 물질에 의해 교감신경계 자극에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 주로 천식치료 및 열병을 다스리는데 쓰이고 있으며 (Lee et al., 2005) 발한, 해열, 항염증에 효과가 있다고 보고되었다 (Song and Lee, 2006). 이외에도 최근에는 마황의 미백활성과 관련된 연구 (Kim, 2008) 및 알러지성 피부염 억제 효과에 대해 보고되어진 바 있다 (Shin and Kim, 2005).
약물전달시스템에 있어서 나노입자가 가지는 이점은 무엇인가?
나노입자 (10−9 m)는 인체에 쉽게 침투할 수 있기 때문에 순환을 통하여 각기 다른 신체 부위로 전달되며, 특히 100 ㎚이하의 소수성 표면을 갖는 리포솜은 분자성 약물의 운반을 용이하게 하여 세포에 대한 친화성이 증가하게 된다 (Mertins et al., 2005).
수용성 성분이 침투하기 어려운 내피세포의 구성을 극복하기 위해 어떤 연구가 진행되고 있는가?
하지만 인체의 내피세포는 인지질로 구성되어 있어 수용성 성분이 침투하기 어려운 구조로 되어 있다. 따라서 수용성 물질의 세포내 침투 효율 향상을 위해서 활성물질을 레시틴의 유상이 포집한 리포솜 형태로 제조하고 이를 생체에 적용시켜 높은 침투력 및 생체활용성을 나타내고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다 (Kim and Kwak, 2004).
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