[국내논문]괴화 추출물 루틴의 소염작용: 쥐의 복강대식세포로부터 NO와 TNF-alpha 생산에 있어서 괴화 루틴에 의한 억제효과 Anti-inflammatory Function of the Sophora japonica Extract Rutin: The Inhibitory Effect of Rutin of Korean Sophora japonica on the Productions of NO and TNF-alpha from Mouse Peritoneal Macrophages원문보기
Korean Sophora japonica has been found to posses an anti-inflammatory activity. In this study, Korean Sophora japonica extract, rutin, was used to know whether rutin inhibits to produce inflammatory mediators NO and TNF-$\alpha$ from the mouse peritoneal macrophages that were treated an i...
Korean Sophora japonica has been found to posses an anti-inflammatory activity. In this study, Korean Sophora japonica extract, rutin, was used to know whether rutin inhibits to produce inflammatory mediators NO and TNF-$\alpha$ from the mouse peritoneal macrophages that were treated an inflammatory agent LPS. The rutin-1 hr pretreated macrophages were incubated with LPS for 0.5~5 hrs, and then collected the supernatant and the cell lysate for measurements of the level of iNOS, NO, TNF-$\alpha$ mRNA, TNF-$\alpha$, and p-NF-${\kappa}B$. Minimal and maximal effective doses of the rutin on them were 1 and $100{\mu}g/ml$, respectively. The maximal effective dose of rutin certainly inhibted the productions of iNOS, NO, TNF-$\alpha$ mRNA, TNF-$\alpha$and p-NF-${\kappa}B$ from the LPS-treated macrophages (p<0.0001). Its $ED_{50}$ for inhibition of TNF-$\alpha$ mRNA and p-NF-${\kappa}B$ was $5{\mu}g/m{\ell}$, and for iNOS, NO, and TNF-$\alpha$ was $10{\mu}g/m{\ell}$. The rutin did not have any cytotoxic effect. As the results, the Sophora japonica rutin could be a good candidate for an anti-inflammatory action.
Korean Sophora japonica has been found to posses an anti-inflammatory activity. In this study, Korean Sophora japonica extract, rutin, was used to know whether rutin inhibits to produce inflammatory mediators NO and TNF-$\alpha$ from the mouse peritoneal macrophages that were treated an inflammatory agent LPS. The rutin-1 hr pretreated macrophages were incubated with LPS for 0.5~5 hrs, and then collected the supernatant and the cell lysate for measurements of the level of iNOS, NO, TNF-$\alpha$ mRNA, TNF-$\alpha$, and p-NF-${\kappa}B$. Minimal and maximal effective doses of the rutin on them were 1 and $100{\mu}g/ml$, respectively. The maximal effective dose of rutin certainly inhibted the productions of iNOS, NO, TNF-$\alpha$ mRNA, TNF-$\alpha$and p-NF-${\kappa}B$ from the LPS-treated macrophages (p<0.0001). Its $ED_{50}$ for inhibition of TNF-$\alpha$ mRNA and p-NF-${\kappa}B$ was $5{\mu}g/m{\ell}$, and for iNOS, NO, and TNF-$\alpha$ was $10{\mu}g/m{\ell}$. The rutin did not have any cytotoxic effect. As the results, the Sophora japonica rutin could be a good candidate for an anti-inflammatory action.
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문제 정의
이에 본 연구는 괴화 루틴이 대식세포에서 대표적 염증매개물질인 NO와 TNF-α 생산에 있어 작용과 기전 그리고 세포독성을 가지고 있는 지를 밝히고자 하였다.
괴화 루틴은 염증유발물인 LPS에 자극된 대식세포로부터 iNOS 생산을 억제하게 하는 작용이 있다는 것을 알 수 있었고, 괴화 루틴이 농도 의존적으로 강한 억제효과가 있음을 나타내었다. 이러한 괴화 루틴의 iNOS 생산억제 효과는 염증매개물질 NO 생산억제 여부를 궁금하게 해 연구를 수행하였다. 그 결과, 괴화 추출물인 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 염증유발물질인 LPS에 의한 NO 생산억제를 보이기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서는 최고의 NO 생산억제를 보였다 (각각 P < 0.
그래서 TNFα에 대한 괴화 루틴의 영향에 대해 알고자 연구를 수행하고자하였다.
이러한 TNF-α mRNA 발현억제가 TNF-α 단백질 생산억제로도 이어지는지 여부를 조사하였다.
그러면 앞에서 보여준 괴화 루틴에 의한 iNOS와 TNF-α 생산억제도 (Fig. 2, 5) NF-κB 인산화 억제에 기인한 것인 지 알아 보고자 하였다.
이와 같이 괴화의 독성 유무에 대한 논점이 연구시기와 생물 종에 따라 동일하지 않았다. 그래서 괴화 루틴의 세포 독성에 대한 안전성을 검사하였다. 결과에서 보는 바와 같이, 괴화 루틴은 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서도 쥐의 비장세포 또는 대식세포에 독성 효과를 미치지 않았으며 오히려 대조군과 비교하여 미미하나마 더 높은 생존율을 보여주었다 (Fig.
제안 방법
상기 농축액을 전개용매 50% 에탄올로 칼럼 C-18 COSMOSIL PACKED (10 ㎛, 4.6 × 250 ㎜, column 온도 20℃)에서 유속 0.8 ㎖/mim으로 하여 280 ㎚ UV 검출기를 가진 semiprep Waters HPLC (Waters 2690 Separations Module and Waters 2487 Dual Absorbance Detector, Waters, Milford, MA. USA)와 collector (Foxy 200 X-Y Fraction Collector, Isco, Lincoln, Neb. USA)를 이용해 rutin을 분획 분리하였으며, 수율은 분리실험에 따라 차이가 있었으나 5.0~7.0% (w/w)이였다 (data not shown).
분획을 위한 standard rutin은 Sigma (St Louis, MO, USA)로부터 구입해 사용하였다. 본 추출 분획 과정에서 괴화 루틴내의 세균내독소인 LPS 잔유량 검사는 Limulus ES II kit (Wako, Osaka, Japan)로 검사하였으며. 잔류량은 17 endotoxin units (EU)/㎖이였다 (data not shown).
세포 용해 후 시료를 immunoblotting 기법을 사용해 세포 내에 존재하는 iNOS, TNF-α, NF-κB, NF-κB 인산화 (p-NF-κB) 량을 조사하였다.
합성한 각각의 cDNA를 중합연쇄 반응액 (total volume: 50 ㎕; 5 ㎕ of 10x Taq buffer, 4 ㎕ of 2.5 mM dNTP, 1 ㎕ of 10 pmoles/ ㎕ TNF-α 또는 β-actin sense or anti-sense primer, 8 units of Taq)과 혼합하여 TNF-α와 β-actin의 RT-PCR 증폭산물을 얻었다.
2 ㎍의 total RNA를 역전사 반응액 (total volume: 50 ㎕; 10 ㎕ of 5x RAV-RTase buffer, 20 ㎕ of 2.5 mM dNTP, 0.02 µM of TNF-α 또는 β-actin anti-sense primer, 10 units of RAV-RTase)과 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 TNF-α와 β-actin의 cDNA를 합성하였다.
실험동물은 건국대 실험동물 윤리위원회가 인정한 미국 국립 보건원 권고 가이드라인 (NIH publication #85-23, 1985)에 따라 수행되었다. 괴화 루틴으로 자극하기 전에 incomplete RPMI-1640 medium으로 씻어낸 후, serum free RPMI-1640 medium을 주입하였다. 주입 후 30분에 괴화 루틴을 여러 농도로 1시간 동안 자극한 후 염증 유도물질인 LPS (10 ㎍/㎖)로 30분 (인산화 분석위해), 2시간(mRNA 분석위해) 또는 5시간 (NO 및 단백질분석 위해) 동안 더 자극하였다.
괴화 루틴으로 자극하기 전에 incomplete RPMI-1640 medium으로 씻어낸 후, serum free RPMI-1640 medium을 주입하였다. 주입 후 30분에 괴화 루틴을 여러 농도로 1시간 동안 자극한 후 염증 유도물질인 LPS (10 ㎍/㎖)로 30분 (인산화 분석위해), 2시간(mRNA 분석위해) 또는 5시간 (NO 및 단백질분석 위해) 동안 더 자극하였다. 자극시간은 예비실험에서 얻은 최적의 시간 조건이었다 (data not shown).
, 2007). 활성화된 대식세포로부터 생산된 NO 는 곧바로 산소와 반응해 nitrite로 변환되므로 (Bredt et al., 1992), 배양액에 있는 nitrite를 측정하여 NO 생산을 검사하였다. Nitrite는 Griess reagent를 사용하여 측정하며 간단히 설명하면 다음과 같다.
, 2005), 역전사 kit 및 중합연쇄반응 kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 이용하여 실시하였다. 간단히 설명하면, Trisol (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 2 ㎍의 total RNA를 역전사 반응액 (total volume: 50 ㎕; 10 ㎕ of 5x RAV-RTase buffer, 20 ㎕ of 2.
5 mM dNTP, 1 ㎕ of 10 pmoles/ ㎕ TNF-α 또는 β-actin sense or anti-sense primer, 8 units of Taq)과 혼합하여 TNF-α와 β-actin의 RT-PCR 증폭산물을 얻었다. 이 증폭 산물은 1% agarose gel 전기영동상에서 분석하였다. 유전자 증폭을 위하여 TNF-α forward primer : 5' - GGCAGGTCTTTG GAGTCATTGC - 3'와 reverse primer: 5' - CATTCGAGGCT CCAGTGAATTCCAG - 3', 그리고 β-actin forward primer: 5' - CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG - 3'와 reverse primer: 5' - CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG - 3'를 사용하였다.
, 2003). 그래서 괴화 flavonoid 중의 하나인 루틴의 소염효과를 알아보기 위해 먼저 iNOS와 NO의 생산에 있어 괴화 루틴의 작용을 검사하였다. 그 결과, 괴화 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 단백질의 생산이 억제되기 시작하다가 괴화 루틴 100 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 생산이 최대로 억제됨을 보여 주었다 (각각 P < 0.
배양한 후, 10W safety lamp (Kodak, Rochester, NY, USA)가 설치된 암실에서 x-ray film (Agfa, Devaert, Belgium))에 감광시킨 후 x-ray film을 developing, washing, fixing 및 washing 순서과정을 거친 후 iNOS, TNF-α, NFκB, phospho-NF-κB band의 크기와 강도를 분석하였다.
대상 데이터
iNOS, TNF, NF-κB, p-NF-κB 검사를 위해 immunoblotting에 사용된 각종 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, 역전사 중합 연쇄반응 (RT-PCR)을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan)에서, ethanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany)에서, standard rutin 및 각종 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입했다.
복강 대식세포 배양을 위하여 배양액 RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine acid, penicillin-streptomycin 및 trypsin-EDTA는 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)로 부터 구입하였으며, 각종 culture plates, flasks, 그리고 각종 tube들은 Falcon (Franklin Lakes, NJ, USA)으로부터 구입하였다. iNOS, TNF, NF-κB, p-NF-κB 검사를 위해 immunoblotting에 사용된 각종 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, 역전사 중합 연쇄반응 (RT-PCR)을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan)에서, ethanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany)에서, standard rutin 및 각종 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입했다.
iNOS, TNF, NF-κB, p-NF-κB 검사를 위해 immunoblotting에 사용된 각종 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, 역전사 중합 연쇄반응 (RT-PCR)을 위한 시약은 Takara (Otsu, Shiga, Japan)에서, ethanol을 비롯한 각종 유기용매들은 Merck (Berlin, Germany)에서, standard rutin 및 각종 시약은 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입했다. 본 실험에서 복강 대식세포의 추출을 위해 사용된 Balb/c 생쥐들은 분양받아 항온 항습실에 사육하면서 실험하였다. 항온항습실의 조건은 온도 22 ± 1℃, 습도 55 ± 5%, 조명 150 Lux의 조건이었다.
건재상에서 구입한 한국산 괴화를 물로 세척하고 잘 건조시킨 괴화를 50% 에탄올 수용액에 가한 후 교반하여 주면서 80℃에서 2시간 단위로 2회 추출하였다. 상기 추출물을 상온으로 서서히 냉각시킨 다음 원심여과하여 잔사를 제거하고 여액을 병합하여 60℃에서 감압 농축하여 농축액을 얻었다 (Paniwnyk et al.
1). 분획을 위한 standard rutin은 Sigma (St Louis, MO, USA)로부터 구입해 사용하였다. 본 추출 분획 과정에서 괴화 루틴내의 세균내독소인 LPS 잔유량 검사는 Limulus ES II kit (Wako, Osaka, Japan)로 검사하였으며.
7 주령의 Balb/c 마우스에 2 개월 이상 배양된 thioglycollate medium (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 마우스에 투여한지 4일 후 마우스를 경추 탈골시켜 희생시킨 후 대식세포를 무균상태에서 회수하여 cold incomplete RPMI1640 medium으로 씻은 후 배양하였다 (Chang et al., 2001). 실험동물은 건국대 실험동물 윤리위원회가 인정한 미국 국립 보건원 권고 가이드라인 (NIH publication #85-23, 1985)에 따라 수행되었다.
유전자 증폭을 위하여 TNF-α forward primer : 5' - GGCAGGTCTTTG GAGTCATTGC - 3'와 reverse primer: 5' - CATTCGAGGCT CCAGTGAATTCCAG - 3', 그리고 β-actin forward primer: 5' - CAAAGAAAATGGACGCCGCCGAACTTGG - 3'와 reverse primer: 5' - CCTGCTTGCTTGCTGATCCACATCTGCTGG - 3'를 사용하였다.
, 2001). 실험동물은 건국대 실험동물 윤리위원회가 인정한 미국 국립 보건원 권고 가이드라인 (NIH publication #85-23, 1985)에 따라 수행되었다. 괴화 루틴으로 자극하기 전에 incomplete RPMI-1640 medium으로 씻어낸 후, serum free RPMI-1640 medium을 주입하였다.
데이터처리
실험성적은 평균 또는 mean ± s.e.m.으로 나타냈으며, 각 group 간의 통계학적 검정에는 SAS ANOVA 프로그램 (SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하였다.
이론/모형
NO 생산량 분석은 다른 참고문헌을 참고하였다 (Green et al., 1982; Lee et al., 2007). 활성화된 대식세포로부터 생산된 NO 는 곧바로 산소와 반응해 nitrite로 변환되므로 (Bredt et al.
RT-PCR에 관한 자세한 사항은 다른 문헌을 참조하였으며 (Chang et al., 2005), 역전사 kit 및 중합연쇄반응 kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 이용하여 실시하였다. 간단히 설명하면, Trisol (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 total RNA를 추출하였다.
성능/효과
연구수행 결과 괴화 루틴이 대식세포의 주요 전사인자인 NF-κB의 인산화 억제, 그리고 NO와 TNF-α 생산을 억제한다는 것과 세포독성을 가지고 있지 않음을 보였다.
이러한 결과들은 괴화 루틴이 TNF-α의 생산에도 영향을 분명히 미칠 수 있다는 가능성을 암시하였다.
그 결과, 괴화 추출물인 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 염증유발물질인 LPS에 의한 NO 생산억제를 보이기 시작하다가 100 ㎍/㎖ 농도에서는 최고의 NO 생산억제를 보였다 (각각 P < 0.0001, P < 0.0001; Fig 3).
그 결과, 괴화 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 단백질의 생산이 억제되기 시작하다가 괴화 루틴 100 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 iNOS 생산이 최대로 억제됨을 보여 주었다 (각각 P < 0.0001, P < 0.0001; Fig. 2).
2). 괴화 루틴은 염증유발물인 LPS에 자극된 대식세포로부터 iNOS 생산을 억제하게 하는 작용이 있다는 것을 알 수 있었고, 괴화 루틴이 농도 의존적으로 강한 억제효과가 있음을 나타내었다. 이러한 괴화 루틴의 iNOS 생산억제 효과는 염증매개물질 NO 생산억제 여부를 궁금하게 해 연구를 수행하였다.
이러한 결과로 미루어 괴화 루틴은 세포 독성이 없는 소염제로서 안전성을 확인하였으며 또한 괴화의 iNOS, NO, TNF-α, TNF-α mRNA, p-NF-κB 억제효과가 세포독성에 기인한 것이 아니라는 것도 더불어 확인하였다.
그 결과, 괴화 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 TNF-α 단백질의 생산억제 (P < 0.0001)를 보이기 시작하다가, 100 ㎍/㎖ 농도에서는 최고조의 TNF-α의 분비억제 (P < 0.0001)를 보였다 (Fig. 5).
괴화 루틴이 LPS로 유도된 대식세포로부터 iNOS, NO, TNF-α mRNA, TNF-α 생산을 확실히 억제한다는 결과들 (Fig. 2~5)은 괴화 루틴이 좋은 소염제 후보가 될 수 있음을 말해주고 있다.
그 결과 괴화 루틴 1 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 NF-κB의 인산화를 억제 (P < 0.0001)되기 시작하다가 괴화 루틴 100 ㎍/㎖ 농도에서 LPS에 의한 NF-κB의 인산화를 최대로 억제 (P < 0.0001)됨을 보여 주었다 (Fig. 6).
따라서 괴화 루틴이 LPS에 유도된 대식세포에서 NF-κB 인산화를 억제해 결과적으로 iNOS, NO, TNF-α mRNA, TNF-α 생산이 억제됨을 유추할 수 있다.
그래서 괴화 루틴의 세포 독성에 대한 안전성을 검사하였다. 결과에서 보는 바와 같이, 괴화 루틴은 높은 농도인 100 ㎍/㎖에서도 쥐의 비장세포 또는 대식세포에 독성 효과를 미치지 않았으며 오히려 대조군과 비교하여 미미하나마 더 높은 생존율을 보여주었다 (Fig. 7). 이러한 결과로 미루어 괴화 루틴은 세포 독성이 없는 소염제로서 안전성을 확인하였으며 또한 괴화의 iNOS, NO, TNF-α, TNF-α mRNA, p-NF-κB 억제효과가 세포독성에 기인한 것이 아니라는 것도 더불어 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
대식세포에서 생산 분비되는 염증매개물질에는 어떤 것들이 있는가?
염증발생 시 염증부위에 면역세포들이 침투되고 이들 세포들에 의해 여러 종류의 화학물질 및 cytokine를 생산 분비하여 생체방어 및 염증반응을 일으킨다. 이들 면역세포 중 탐식 및 항원제공에 관여하는 대식세포는 감염초기에 nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) 등을 생산 분비하여 생체방어에 중요한 역할을 한다 (Arenzana-Seisdedos et al., 1987; Le and Vilcek, 1987; Snyder and Bredt, 1992).
TNF-α는 무엇인가?
, 1992). TNF-α는 일명 cachectin이라 하며 중요한 면역 활성물질이며 trimer 형일 때 생물학적 활성이 크며 단구와 대식세포에서 많이 생산되어진다 (Tracey et al., 1988).
대식세포에서 생성 분비된 NO는 어떤 변화를 겪는가?
NO는 nitric oxide synthase (NOS)의 촉매에 의해 생산되는데 NOS는 iNOS (inducible NOS), nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS) 세 종류가 있는데 NADPH의 도움을 받아 L-arginine를 산화해 NO와 citrulline을 생산한다(Nathan, 1997). 대식세포에는 주로 iNOS가 존재하며 생성된 NO는 free radical 구조이기 때문에 반감기가 6~10초로 매우 불안정하여 안정화된 최종산물인 NO2 (nitrite)로 신속히 변환되는 것으로 알려져 있다 (Bredt et al., 1992).
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