[논문]위령선(威靈仙)이 RANKL 처리 RAW 264.7 Cell에 미치는 영향

송영훈; 유정은; 임현정; 유동열

doi:10.15204/jkobgy.2010.23.3.078

[국내논문] 위령선(威靈仙)이 RANKL 처리 RAW 264.7 Cell에 미치는 영향
Effects of Clematidis Radix Extract on Osteoclastogenesis and Gene Expression in RANKL-induced RAW 264.7 Cell 원문보기

大韓韓方婦人科學會誌 = The Journal of Korean obstetrics & gynecology, v.23 no.3, 2010년, pp.78 - 90

송영훈 (대전대학교 한의과대학 부인과교실) , 유정은 (대전대학교 한의과대학 부인과교실) , 임현정 (대전대학교 한의과대학 부인과교실) , 유동열 (대전대학교 한의과대학 부인과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose: This study was performed to evaluate the effect of Clematidis Radix extract(CB) on osteoclast differentiation and gene expression. The osteocastogenesis and gene expression were determined in RANKL-induced RAW 264.7 cell. Methods: RANKL-induced RAW 264.7 cell with Clematidis Radix extract was stained by TRAP which is expressive marker of osteoclast. The gene expression of RANK, $TNF{\alpha}$, IL-6, iNOS and Cathepsin, those are factors related to bone resorption, was estimated by using Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Results: Clematidis Radix extract decreased the number of TRAP-positive multi nuclei cell, and decreased the gene expression of RANK, $TNF{\alpha}$, IL-6, iNOS and Cathepsin K in RANKL-induced RAW 264.7 cell. Conclusion: It is concluded that Clematidis Radix extract might decrease the bone resorption resulted from decrease of osteoclast differentiation and it's related gene expression.

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문제 정의

이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW 264.7 cell에서의 TRAP(+) 세포 형성능을 측정하였으며, 관련 단백질 유전자인 RANK, TNFα, IL-6, iNOS, Cathepsin K 등의 유전자 발현에 대하여 연구한 결과 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구는 祛風除濕通絡止痛의 효능과 관절염 치료작용이 있다고 보고된 威靈仙 추출물이 골다공증에도 효과적일 것으로 사료되어 파골세포의 분화와 기능 활성화에 관여하는 인자들에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW 264.
1). 이러한 실험 결과를 바탕으로 CB가 파골세포 기능에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하여, 그 기전을 밝히고자 하였다.

제안 방법

威靈仙 100 g을 플라스크에 넣은 후, MeOH 500 ㎖를 가하고 6시간 이상 가열하여 환류 추출하였다. 여과지를 이용 하여 여과한 다음, 여액을 evaporator(EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축한 다음 농축액을 동결 건조(8.2 g)하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 威靈仙 추출물(이하 CB라 함)을 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma, USA))를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.
RANKL 처리 대조군은 Control (C) 로, 실험군은 50 ㎍/㎖의 威靈仙 추출물을 투여한 군(CB50), 100 ㎍/㎖를 투여한 군(CB100), 200 ㎍/㎖를 투여한 군 (CB200)으로 하였다.
RANKL 처리로 RAW 264.7 cell을 파골세포로 만든 후, 성숙한 파골세포의 발현 marker로 알려진 TRAP을 염색하여 TRAP-positive 다핵세포를 확인하였다. 분화시킨 세포를 PBS로 세포를 2회 세척하고, 3.
7% formaldehyde-citrate-acetone 용액으로 10분 고정시키고 증류수로 2회 세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive 다핵세포{TRAP(+) MNCs}를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive 다핵세포{TRAP(+) MNCs}를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
침전물을 75% EtOH로 2회 세척한 다음 건조시켰다. 유전자 발현에 필요한 RNA양을 대조군과 시험군에서 mRNA양이 같도록 조정한 다음, 전기영동으로 확인하여 사용하였다.
Primer가 annealing 하도록 실온에서 약 10분간 방치한 후 4℃ 로 유지하며 다음 시약을 가하였다. 5배의 cyscript buffer 4 ㎕, 0.1M DTT 2 ㎕, dUTP nucleotide mix 1 ㎕, dUTP cydye-labelled nucleotide 0.1 ㎕, cyscript reverse transcriptase 1㎕, H2O 0.9 ㎕를 첨가하여 총 20 ㎕로 한 후, 아주 조심스럽게 손으로 tipping 혼합하였다. 이 후, 42℃에서 90분간 incubation 한 후, 얼음 상에 방치하였다.
Oligo (dT)12-18, reaction buffer(50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 8.3), 1 mM dNTP (Biotools, Spain)과 200 unit M-MLV -RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, USA)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15 ㎕에 10배의 PCR buffer, 0.
3), 1 mM dNTP (Biotools, Spain)과 200 unit M-MLV -RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega, USA)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15 ㎕에 10배의 PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 pmole의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25 unit의 Taq polymerase (Biotools, Spain)을 넣어 PCR을 시행하였다. RANK 의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다.
TNFα의 sense primer 는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT를 사용하였으며, IL-6의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA를 사용하였다. iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다. Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA 이었으며, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 이었다.
iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다. Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA 이었으며, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 이었다. PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동 한다.
우선 시험관에 정량한 RNA 5 ㎍, 50 ng/㎕ 의 random hexamer 3 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕를 넣고 diethyl pyrocarbonate (DEPC, Sigma, USA) 처리된 증류수를 가하여 10 ㎕의 RNA/primer mixture를 만들었다. 실험용 sample을 65℃에서 5분간 incubation 시킨 후 1분 이상 얼음에 방치하였다.
RNase 1 ㎕를 가하고 다시 37℃에서 20분간 incubation 시킨 다음, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다. 각각의 optical tube에 2배의 SYBR Green Mix 12.5 ㎕, cDNA 0.2 ㎕, 5 pmol/㎕ primer pair mix 1 ㎕, 11.3 ㎕ H2O를 넣고, 50℃ 2분 1 cycle, 95℃ 10 min 1 cycle, 95℃ 15 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 30 sec 40 cycles, 72℃ 10 min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다.
3 ㎕ H2O를 넣고, 50℃ 2분 1 cycle, 95℃ 10 min 1 cycle, 95℃ 15 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 30 sec 40 cycles, 72℃ 10 min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다. SDS 7000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5 ㎕를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다. SDS 7000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
이를 위하여 RANKL 처리한 RAW 264.7 cell에서의 TRAP(+) 세포 형성능을 측정하였으며, 관련 단백질 유전자인 RANK, TNFα, IL-6, iNOS, Cathepsin K 등의 유전자 발현에 대한 연구를 실시하였다.

대상 데이터

실험에 사용한 威靈仙(Clematis manshurica RUPR.)은 둔산한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다.
2 g)하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 威靈仙 추출물(이하 CB라 함)을 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma, USA))를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 ㎛의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다.
실험에 사용된 파골세포 전구세포는 mouse myeloid 세포주인 RAW 264.7 cell에 RANKL을 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.
7 cell에 RANKL을 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.7 cell은 한국세포주은행에서 구입하였다.
5 M NaOH을 2 ㎕ 씩 가한 후 37℃에서 15분간 incubation하였으며, 2 MHepes buffer(free acid)를 10 ㎕ 가하여 중화시켰다. 각각의 시약은 Amersham Bioscience(USA) 에서 구입하였다.
25 unit의 Taq polymerase (Biotools, Spain)을 넣어 PCR을 시행하였다. RANK 의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TNFα의 sense primer 는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT를 사용하였으며, IL-6의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA를 사용하였다.
TNFα의 sense primer 는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT를 사용하였으며, IL-6의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA를 사용하였다.

데이터처리

각 결과에 대한 유의성 검증은 student's t-test를 이용하였다.
PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동 한다. 전기영동 결과 나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1 (Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.

성능/효과

실험 결과, CB 50㎍/㎖ 투여군은 대조 군에 비해 TRAP-positive 다핵세포수를 약 9% 증가시켰고, CB 100㎍/㎖ 투여군은 약 37% 감소시켰다. 또한, CB 200㎍/㎖ 투여군도 대조군에 비해 약 66% 감소시켰다(p<0.
실험 결과, CB 50㎍/㎖ 투여군은 대조 군에 비해 TRAP-positive 다핵세포수를 약 9% 증가시켰고, CB 100㎍/㎖ 투여군은 약 37% 감소시켰다. 또한, CB 200㎍/㎖ 투여군도 대조군에 비해 약 66% 감소시켰다(p<0.
실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 (p<0.01) 억제하였다(Fig. 2).
실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 (p<0.01) 억제하였다(Fig. 3)
실험결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 (p<0.01) 억제하였다(Fig. 4).
실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 (p<0.01) 억제하였다(Fig. 5).
실험 결과, CB는 50 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 (p<0.01) 억제하였다(Fig. 6)
RANKL이 RANK와 결합하면 TRAP의 활성화, transcription factor의 활성화(NF-kB, AP-1, NFATc1)와 MAPK의 pathway 활성화(ERK, JNK, p38), Src, Akt 등이 활성화되어 파골세포의 기능이 활성화 된다⁴¹⁾. 실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 2).
따라서 TNFα의 발현이 증가하면 파골세포의 분화 및 기능 활성화가 증가될 수 있다. 실험 결과, CB는 200㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 3).
따라서 PKA의 활성 증가는 파골세포 기능 활성화와 인산화 증가를 유발한다⁴³⁾. 실험결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 4).
증가된 NO는 파골세포의 형성과 골의 재흡수를 억제 한다^44,45). 실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 5).
따라서 파골세포의 활성화로 인한 재흡수과정은 세포에서 발현되는 Cathepsin K나 MMP-9, TRAP의 mRNA를 지표로 사용하여 측정할 수 있다. 실험 결과, CB는 200 ㎍/㎖, 100㎍/㎖ 농도에서 대조군에 비해 유전자 발현을 유의성 있게 억제하였다(Fig. 6).
威靈仙 추출물(CB)이 파골세포의 분화 및 기능 활성을 억제하여 골의 재흡수를 억제하는지를 평가하기 위하여, RANKL 처리 RAW 264.7 cell에서 TRAP-positive 다핵세포 형성에 미치는 영향을 측정하였으며, 골 흡수 관련인자들의 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과, 威靈仙 추출물은 RANKL 처리 RAW 264.7 cell에서 TRAP-positive 다핵세포의 형성을 억제하였고, RANK, TNFα, IL-6, iNOS, Cathepsin K 등의 유전자 발현을 억제하였다.
이상의 연구결과, 威靈仙 추출물(CB)은 RANKL 처리 RAW 264.7 cell에서 파골세포로의 분화를 억제하였으며, 파골세포 분화 및 기능 활성화에 관련된 유전자 발현을 억제하였다. 이는 골다공증의 치료 및 예방에 활용하기 위해 威靈仙을 단방이나 복합방에 가미하여 활용할 수 있음을 의미한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	골다공증의 유발 요인은 어떤 것들이 있는가?	골다공증의 유발 요인으로는 여성의 폐경, 갑상선 기능항진, 당뇨병, 스트레스, 흡연 및 운동 부족, 신체적 노화와 glucocorticoid 계열 약물의 복용 등이 알려져 있다2-4).
	세계보건기구에서 골다공증을 어떻게 정의하고 있는가?	세계보건기구는 골다공증을 골량의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하는 전신적인 골격계질환으로 결과적으로 뼈가 약해져서 부러지기 쉬운 상태가 되는 질환으로 정의하고 있는데, 빠른 속도로 초고령화 사회에 진입하고 있는 국내현실상 골다공증의 유병률은 매우 높아질 것이 분명하고, 골다공증 골절의 치료비용도 가파르게 증가할 것이다1).
	뼈 조직내에 존재하는 파골세포의 RANKL은 어떻게 파골세포로 분화하는 것을 촉진하는가?	뼈 조직내에 존재하는 파골세포는 대식세포 계열의 전구세포로부터 다양한 분화유발인자들에 의해 분화되어 활성화 된다5,6). 특히, 파골세포 분화 유발인자인 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 조골세포로부터 분비되며, 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로 분화하는 것을 촉진한다7). 분화한 파골세포는 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정과 AP-1, NFATc1, c-Fos, c-jun, NF-κB의 활성화, Src, Akt 활성화 등을 통하여 뼈조직을 파괴하는 단백질인 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase) 및 cathepsin K 합성을 촉진하게 된다8-10).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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