[논문]인삼양영탕(人蔘養榮湯)이 Aβ를 처리한 PC12 세포와 생쥐의 손상 뇌신경조직에 미치는 영향

장영주; 정인철; 이상룡

[국내논문] 인삼양영탕(人蔘養榮湯)이 Aβ를 처리한 PC12 세포와 생쥐의 손상 뇌신경조직에 미치는 영향
The Neuroprotective Effects of InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) on Aβ-induced Damages in Mice 원문보기

동의신경정신과학회지 = Journal of oriental neuropsychiatry, v.21 no.1, 2010년, pp.109 - 124

장영주 (대전대학교 한의과대학 신경정신과교실) , 정인철 (대전대학교 한의과대학 신경정신과교실) , 이상룡 (대전대학교 한의과대학 신경정신과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: This experiment was designed to investigate the effect of the InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) extract on $A{\beta}$-induced AD model. Methods: The effects of the InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) extract on neural damages of cultured PC12 cells induced by $A{\beta}$ were investigated. The effects of the InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) extract on neural damages of hippocampal and cortical neurons in the mouse induced by $\beta$-amyloid were investigated. Results: 1. $A{\beta}$ treatment into neuronal cells activated cell death pathway when analyzed by MTT assay and by histological analysis. Then InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) treatment improved cell survival to a similar level as in normal group. 2. $A{\beta}$ treatment increased caspase 3 protein levels but decreased phospho-Erk1/2 in neuronal cells. InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) treatment reversed the production levels of two proteins close to those in normal group. 3. $A{\beta}$ treatment induced the atrophy of neuronal cells in terms of neuronal processes and cell body shrinkage, but InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) greatly improved their morphology. 4. Neuroprotective activity, as observed in InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang)-treated groups, was similarly observed in cells treated with galantamine which was used as a positive control. Moreover, overall recovery pattern by InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) was similar between cultured PC12 cells and in vivo hippocampal and cerebral cortical neurons in the mouse brain. Conclusions: This experiment shows that the InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) may play a protective role in neural tissues damaged by cytotoxic substances. Since neuronal damage seen in degenerative brains such as AD are largely unknown, the current data may provide possible insight into therapeutic strategies for AD treatments. InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) might be effective for the treatment of AD. Investigation into the clinical use of the InSamYangYoung-tang(Renshenyangrongtang) for AD is suggested for future research.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 Aβ 처리에 의한 해마나 대뇌피질의 조직학적 생화학적 변화를 조사하고 人蔘養榮湯 처리에 의하여 변화가 유발되는지 조사하였다.
본 실험에서는 PC12 세포의 생존력 관련 생화학적 반응성을 조사하기 위하여 Aβ와 人蔘養榮湯을 동시 처리 후 인산화된 Erk1/2 (phospho-Erk1/2)와 phospho-c-Jun의 생성수준을 조사하였다.
이에 저자는 人蔘養榮湯이 AD연계성 손상조직에 미치는 영향을 검토하고자 Aβ를 처리하여 세포독성을 부여한 배양 PC12 세포와 생쥐의 해마조직 세포 및 대뇌피질의 신경세포의 세포 조직학적 및 생화학적 변화를 관찰한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 상기 선행 연구의 결과를 바탕으로 『韓醫神經精神科學』¹⁰⁾에서 精竭神衰型健忘에서 養營固本, 補精益腦의 治法에 활용되는 대표적인 治方으로 제시된 人蔘養榮湯이 뇌의 신경세포에 대하여 양성적 효과가 있을 것으로 사료되어 본 실험을 계획 실시하였다.

제안 방법

(iii) 0.3 mg/ml또는 0.5 mg/ml의 人蔘養榮湯 열수추출물과 Aβ peptide 10 μM을 처리한 실험군으로 구분하였으며, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
(iii) Aβ peptide를 측뇌실 양쪽에 200 pmol의 농도로 5 μl 주입 후 galantamine(3 mg/kg)을 투여한 양성대조군, (ⅳ) Aβ peptide를 측뇌실 양쪽에 200pmol의 농도로 5 μl 주입 후 人蔘養榮湯 열수추출물(400 mg/kg, p.o)을 처리한 실험군으로 나누었다.
(iii) 人蔘養榮湯 열수추출물과 Aβ peptide 10 μM를 처리한 실험군으로 구분하였고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 정해진 비율로 혼합하여 처리한 후, 실온에서 4시간 동안 반응하였다. 1차 항체 반응이 끝난 후 PBST(PBS plus0.1% tritonX-100)로 조직을 씻어내고, 2.5% bovineserum albumin(BSA), 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 fluorescein-goat anti-mouse(green)나 Rhodamine-goatanti-rabbit antibody(red)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 2차 항체 처리를 수행하였고, 2차 항체 처리 후 3회에 걸쳐 PBST로 세척하였다. Hoechst33258 핵 염색을 수행하는 경우 2회 세척 후 0.
5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 정해진 비율로 혼합하여 처리한 후 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 PBST로 조직을 씻어내고, 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 fluorescein-goatanti-mouse(green; Molecular probes)와 rhodamine-goatanti-rabbit antibody(red; Molecular probes)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 2차 항체 처리를 수행하고 3회에 걸쳐 PBST로 세척하였다. Hoechst33258 핵 염색을 수행하는 경우 2회 세척 후 0.
PC12 cell은 한국생명공학연구원 장수연구센터로부터 분양 받아 예비배양을 거쳐 활성화 후 본 실험에 사용하였다. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 5% FBS, 5% horse serum, 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM(GIBCO, USA)배지 하에서 배양하였다. 세포는 75cm² flask(SPL, Korea)에서 충분히 증식한 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(Sigma, USA) 용액으로 씻어준 후 trypsin-Versene(Lonza, USA) 용액을 넣고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착하여 계대 배양하였다.
Aβ peptide의 주입을 위하여 생쥐의 피부를 제거하고 미세드릴로 skull을 제거한 후 Picoinjector(Harvard Instrument, USA)를 이용하여 미세유리관으로 대뇌의 양측방 뇌실부위(coordinates:0.5 mM postterior to bregma, 1.5 mM lateral to midline, 2.5 mM ventral to the brain surface)에 5분간 서서히 약물을 주입하였다.
人蔘養榮湯 처리에 의한 Aβ 매개성 치매모델 생쥐에서 신경보호 효과를 조사하기 위하여 Aβ를 측뇌실(lateralventricle)부위에 주입 후 해마와 대뇌피질 부위에서 조직학 및 생화학적 변화를 조사하였다.
人蔘養榮湯 처리에 의한 신경세포의 생존성 및 사멸 반응성을 알아보기 위하여 phospho-Erk1/2와 caspase 3 생성수준의 변화를 조사하였다. 해마조직의 경우 phospho-Erk1/2는 Aβ 처리 후 완전히 소멸되었으나 galantamine 양성대조군과 人蔘養榮湯 실험군에서 정상군 수준으로 회복되었다(Fig.
뇌조직은 -20℃에서 냉동시킨 후 cryostat를 이용하여 20 μM의 두께로 잘라 슬라이드에 붙이고, H & E 염색을 실시하기 위하여 슬라이드를 Hematoxylin에 1분 동안 담가둔 후 흐르는 증류수에 여러 번 세척하였다. 그 다음 Eosin에 30초간 담그고 흐르는 증류수에 여러 번 세척하고 에탄올 50%, 70%, 95%의 순으로 여러 번 씻으며 염색을 제거하였다. 이러한 과정을 마친 후 xylene에 1분간 담가 놓고, 마지막으로 gelatine mountmedium을 이용하여 coverslide를 부착하였다.
5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:800, Cell Signaling), Cleaved Caspase-3 antibody(1:500, Cell signaling)와 monoclonal anti-neurofilament 200(NF-200, 1:400, Sigma-Aldrich)이었다.
5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:800, Cell Signaling), Cleaved Caspase-3 antibody(1:500, Cell signaling)와 monoclonal anti-neurofilament 200(NF-200, 1:400, Sigma-Aldrich)이었다.
그 다음 각 sample에 대한 단백질을 정량하였으며, 15 μg의 단백질을 Western blot analysis에 사용하였다. 뇌조직 단백질을 12% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(1.5 M Trisma base, 10% sodium dodecylsulfate, 30% Acrylamide, 10% A mMonium Sulfate, TEMED)상에서 전기 영동시킨 후 PVD Fmembrane(Pall Corporation, USA)를 수행하였다. 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 3% bovine serum albumin(BSA), 0.
그 후 membrane을 씻어내고 goatanti-rabbit IgG(Santa cruz biotechnology)또는 anti-mouse/rabbit IgG(Santa CruzBiotechnology)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase를 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 처리 하고 다시 한 번 씻어냈다. 마지막으로 membrane에 부착된 단백질을 Western blot ting detection system을 이용하여 측정하였으며 Kodak Scientific Imaging Film(Eastman Kodak Co., USA)에 감광하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), cleaved Caspase-3 antibody(1:1, 000, Cell Signaling), phospho-c-Jun antibody(1:1, 000, Cell Signaling)과 Actin(1:30, 000, MPbiomedicals)이었다.
그 후 membrane을 씻어내고 goatanti-rabbit IgG(Santa cruz biotechnology)또는 anti-mouse/rabbit IgG(Santa CruzBiotechnology)가 결합되어 있는 horseradish peroxidase를 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 30분 동안 처리 하고 다시 한 번 씻어냈다. 마지막으로 membrane에 부착된 단백질을 Western blot ting detection system을 이용하여 측정하였으며 Kodak Scientific Imaging Film(Eastman Kodak Co., USA)에 감광하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), cleaved Caspase-3 antibody(1:1, 000, Cell Signaling), phospho-c-Jun antibody(1:1, 000, Cell Signaling)과 Actin(1:30, 000, MPbiomedicals)이었다.
먼저 96wellplate에 1×105개의 PC12 cell을 plating하고, 人蔘養榮湯 열수추출물을 각각 0.3, 0.5, 1 mg/ml의 농도로 처리한 후, 식염수만 처리한 군과 Aβ peptide 10 μM를 처리한 군으로 나누어, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
먼저 배양 PC12 세포에 대하여 Aβ의 처리에 의한 세포의 독성 효과를 세포의 기능적 변화 즉, 대사활성도의 변화, 형태적 변화, 그리고 생화학적 활성도의 변화 등의 방법으로 분석하였다.
따라서 본 연구에서는 Aβ 처리에 의한 해마나 대뇌피질의 조직학적 생화학적 변화를 조사하고 人蔘養榮湯 처리에 의하여 변화가 유발되는지 조사하였다. 먼저 신경세포의 조직학적 결체성을 조사하기 위하여 신경세포 특이적 단백질인 NF-200의 면역 형광염색을 통하여 신경세포의 가지가 뻗어나는 분포를 분석하였다. Aβ를 처리한 경우 정상동물에 비하여 해마나 대뇌피질의 신경세포에서 신경돌기의 확장이 상당히 제한되어 있었으나, galantamine을 처리한 양성대조군과 人蔘養榮湯을 처리한 실험군에서는 세포가지의 형태적 양상이 정상군과 유사하게 회복되었다(Fig.
2차 항체는 빛에 민감하기 때문에 반응 시간 동안 암실에서 수행하였다. 면역 염색된 세포들은 형광현미경(Zeiss fluorescentmicroscope)을 통해 관찰하고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop(version 5.5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다.
면역형광 염색법(double i mMunofluorescence staining)을 수행하기 위해, 유리 coverslip을 poly-L-ornithine(0.1 mg/ml, sigma, USA)과 laminin (0.02 mg/ml, Collaborate Research, USA)을 혼합하여 실온에서 precoating하였다. 1×10⁵개의 PC12 cell을 precoating된 coverslip에 plating하고, (i) 식염수만 처리한 정상군, (ii) Aβ peptide10 μM을 처리한 대조군, (iii) 0.
면역형광조직 및 H & E 염색조직은 Nikon 형광현미경을 이용하여 분석한 후 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다.
25% Hoechst33258 염료를 함유한 PBST 용액으로 처리 후 다시 PBST 용액으로 세척하였다. 모든 조직 시료는 형광현미경(Nikon fluorescent microscope)을 통해 관찰하였고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop(version5.5)을 이용하여 green과 red의 밝기와 강도를 같은 비율로 증폭시켜 관찰하였다. 그리고 Photoshopprogram의 Layerblending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다.
탈착된 세포는 5% FBS와 5% horse serum이 첨가된 DMEM 배양액 10ml에 부유시킨 다음 새로운 배양 flask에 옮겨 1:4의 split ratio로 CO₂ incubator(37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다. 신경돌기 성장을 비롯한 PC12 세포의 분화를 유도하기 위하여 신경성장인자(nerve growth factor; NGF)를 50ng/ml 농도로 1주일 이상 처리한 후 본 실험에 이용하였다.
주입 2일 후 실험군은 400 mg/kg의 人蔘養榮湯 열수추출물을, 양성대조군은 식염수 100 μl를 7일 동안 경구 투여하였다. 실험군은 3일간 방치하고, 양성대조군은 8일자부터 3일 동안 1일 1회 3 mg/kg의 galantamine을 복강 주사한 후, 모든 처리가 끝난 동일 시점에서 각 생쥐군의 뇌를 분리하였다.
이러한 과정을 마친 후 xylene에 1분간 담가 놓고, 마지막으로 gelatine mountmedium을 이용하여 coverslide를 부착하였다. 이러한 샘플들은 광학현미경(Bright-field microscope, Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.
대사활성도는 MTT분석을 이용하였는데, Aβ 처리에 의하여 PC12 세포의 생존율이 40%수준으로 감소하였으나 人蔘養榮湯을 처리한 실험군의 경우 세포의 생존율이 80% 수준으로 크게 개선되어 人蔘養榮湯이 PC12 세포의 생존율 향상에 기여한다는 것을 확인하였다. 이러한 세포생존 반응성의 변화와 세포의 형태적 변화의 상관성을 알아보기 위해 세포형태, 핵형태, 자멸 경로분석의 세가지 방법을 통하여 세포를 분석하였다. PC12 세포의 형태적 변화는 신경영양인자(nerve growth factor; NGF)의 처리에 의하여 신경돌기의 성장을 유도한 후 약재 처리에 의한 변화를 손쉽게 관찰할 수 있다⁵³⁾.
이러한 신경돌기는 Aβ 처리에 의하여 위축되었고, 신경세포에 특이적으로 존재하는 neurofilament단백질을 염색함으로써 유사한 형태적 변화를 확인 하였다.
생쥐 뇌조직은 -20℃에서 냉동시킨 후 Cryostat를 이용하여 20 μM의 두께로 잘라 슬라이드에 부착시켰다. 이중면역형광 염색법(doublei mMunofluorescence staining)을 수행하기 위해, 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 혼합된 PBS에 45분 동안 슬라이드를 넣어 조직을 고정하였다. 비특이적 결합을 막기 위해 blocking buffer에 담근 후 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.
주입 2일 후 실험군은 400 mg/kg의 人蔘養榮湯 열수추출물을, 양성대조군은 식염수 100 μl를 7일 동안 경구 투여하였다.

대상 데이터

PC12 cell은 한국생명공학연구원 장수연구센터로부터 분양 받아 예비배양을 거쳐 활성화 후 본 실험에 사용하였다. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 5% FBS, 5% horse serum, 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM(GIBCO, USA)배지 하에서 배양하였다.
본 실험에 사용한 β-amyloidpeptide는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였으며, 1 mM의 농도로 증류수에 녹여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.
, USA)에 감광하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell signaling), cleaved Caspase-3 antibody(1:1, 000, Cell Signaling), monoclonal anti-neurofilament 200(1:2, 000, Sigma-Aldrich)과 Actin(1:30, 000, MP biomedicals)이었다.
그리고 Photoshopprogram의 Layerblending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:800, Cell Signaling), Cleaved Caspase-3 antibody(1:500, Cell Signaling), monoclonal NF-200(1:400, Sigma-Aldrich)이었다.
그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 image를 중복시켜 관찰함으로서 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42 Erk1/2 kinase antibody(1:800, Cell Signaling), Cleaved Caspase-3 antibody(1:500, Cell signaling)와 monoclonal anti-neurofilament 200(NF-200, 1:400, Sigma-Aldrich)이었다.
, USA)에 감광하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 phospho-p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), p44/42Erk1/2 kinase antibody(1:4, 000, Cell Signaling), cleaved Caspase-3 antibody(1:1, 000, Cell Signaling), phospho-c-Jun antibody(1:1, 000, Cell Signaling)과 Actin(1:30, 000, MPbiomedicals)이었다.
본 실험에 사용한 人蔘養榮湯의 처방 구성은 東醫寶鑑²⁸⁾을 기준으로 하였고 약제는 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였다. 처방 1첩의 내용과 용량은 다음과 같다(TableⅠ).
본 실험의 치매 모델에 사용한 생쥐는 평균 체중 25 g의 10주령 albino ICR계열 총 12마리로 고형 사료와 물을 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22-24℃, 습도는 50±10%가 유지되도록 하고, 조명은 밤낮 주기 (12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다.
본 실험에 사용한 β-amyloidpeptide는 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였으며, 1 mM의 농도로 증류수에 녹여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. 양성대조군으로 이용된 galantamine triethiodide는 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 0.9 mg/ml이 되도록 증류수에 녹여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

데이터처리

실험 집단 간 수치 데이터는 One-way ANOVA를 이용하여 비교분석하였다. p값이 0.
면역형광조직 및 H & E 염색조직은 Nikon 형광현미경을 이용하여 분석한 후 현미경에 부착된 디지털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다. 중첩 이미지는 Photoshop 프로그램 상의 image blend 모드를 이용하여 분석하였다.

이론/모형

MTT[3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]환원법을 이용하여 측정하였다. 먼저 96wellplate에 1×10⁵개의 PC12 cell을 plating하고, 人蔘養榮湯 열수추출물을 각각 0.

성능/효과

1. MTT 분석과 세포조직학적 분석결과, 人蔘養榮湯은 Aβ를 처리한 PC12 세포와 생쥐 해마 조직의 dentate gyrus부위의 hilus 부위, CA3, CA1 pyramidal cell 층 및 생쥐 대뇌피질의 신경세포에서 세포의 생존율을 향상시켰고, 세포의 형태를 정상세포와 유사하게 회복시켰다.
2. 人蔘養榮湯은 Aβ를 처리한 PC12 세포와 생쥐 해마조직 및 생쥐 대뇌피질의 신경세포에서 Aβ의 처리에 의하여 증가된 세포의 자멸 유도 단백질인 caspase 3의 생성 수준을 억제시켰다.
3. 人蔘養榮湯은 Aβ를 처리한 PC12 세포와 생쥐 해마조직 및 생쥐 대뇌피질의 신경세포에서 Aβ의 처리에 의하여 감소된 세포의 생존에 관여하는 단백질인 phospho-Erk1/2의 생성 수준을 증가시켰다.
4. 人蔘養榮湯의 손상 신경세포에 대한 효과는 양성대조군으로 이용된 galantamine 처리군과 유사한 양상을 나타내었으며, 배양 PC12 세포와 해마 및 대뇌피질의 신경세포에서 유사한 방식의 효과를 나타내었다.
Aβ를 처리한 경우 정상동물에 비하여 해마나 대뇌피질의 신경세포에서 신경돌기의 확장이 상당히 제한되어 있었으나, galantamine을 처리한 양성대조군과 人蔘養榮湯을 처리한 실험군에서는 세포가지의 형태적 양상이 정상군과 유사하게 회복되었다(Fig. 3).
Erk1/2와 caspase 3 경로에 대한 결과를 종합하면, Aβ 처리에 의한 세포손상 혹은 손상 경로의 활성화가 人蔘養榮湯의 처리에 의하여 억제 효과를 나타낸 것으로 평가된다.
Aβ peptide 처리 대조군에서는 세포층세 부위에서 가지 성장이 제한되었다. Galantamine 양성대조군과 人蔘養榮湯 실험군의 경우 신경세포 가지들이 정상군과 유사한 양상으로 뻗어가는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
Hoechst33258으로 핵염색을 한 결과, 정상군에서 dentate gyrus의 granule cell 층과 pyramidal CA3 및 CA1세포층이 뚜렷이 관찰되었다. 동일 조직에 대하여 면역형광염색을 시행한 결과, caspase 3 단백질은 granule세포층과 CA3 및 CA1 pyramidal 세포층의 모든 부위에서 전혀 탐지되지 않은 반면 Aβ peptide 처리 대조군의 경우 해마조직의 CA3및 CA1 pyramidal 세포층에서 caspase 3 단백질 신호가 명확히 관찰되었다.
PC12 세포에 10 μM의 Aβ peptide를 처리한 결과 세포의 생존율은 식염수 처리군에 비하여 40% 수준으로 감소하였다.
caspase 3 는 해마조직과 대뇌피질의 Aβ 처리 대조군에서 면역 형광염색 결과 낮은 수준이지만 신호가 관찰되었으며, 人蔘養榮湯 처리에 의하여 신호가 감소하였다(Fig. 4A).
대사활성도는 MTT분석을 이용하였는데, Aβ 처리에 의하여 PC12 세포의 생존율이 40%수준으로 감소하였으나 人蔘養榮湯을 처리한 실험군의 경우 세포의 생존율이 80% 수준으로 크게 개선되어 人蔘養榮湯이 PC12 세포의 생존율 향상에 기여한다는 것을 확인하였다.
동일 조직에 대하여 면역형광염색을 시행한 결과, caspase 3 단백질은 granule세포층과 CA3 및 CA1 pyramidal 세포층의 모든 부위에서 전혀 탐지되지 않은 반면 Aβ peptide 처리 대조군의 경우 해마조직의 CA3및 CA1 pyramidal 세포층에서 caspase 3 단백질 신호가 명확히 관찰되었다.
면역형광염색 결과, 정상군에서는 뚜렷한 phospho-Erk1/2 단백질 신호가 관찰되었으나 Aβ peptide 처리 대조군에서는 phospho-Erk1/2 단백질의 생성이 감소하였다.
면역형광염색으로 관찰한 결과, Aβ peptide 처리 대조군에서는 정상군에 비하여 대뇌피질 부위에서 신경세포의 가지들은 다소 위축된 범위로 뻗어있는 것이 관찰되었다.
면역형광염색으로 관찰한 결과, 정상군 세포에서는 caspase 3 양성세포가 전혀 관찰되지 않았으나 Aβ peptide처리 대조군의 경우 일부 세포에서 뚜렷한 caspase 3 단백질 신호가 관찰되었다.
면역형광염색으로 관찰한 결과, 정상군에서는 dentate gyrus의 granule 세포층과 CA3, CA1 부위에서 신경세포의 가지 즉 수상돌기나 축삭이 세포체로부터 주변으로 뻗어나가는 것이 관찰되었다. Aβ peptide 처리 대조군에서는 세포층세 부위에서 가지 성장이 제한되었다.
반면 면역형광염색으로 caspase 3 단백질의 생성수준을 조사한 결과, 정상군의 경우 caspase 3 단백질 신호는 전혀 검출되지 않았으며 galantamine 양성대조군과 人蔘養榮湯 실험군의 경우에도 caspase 3 단백질 신호는 확인되지 않았으나, Aβ peptide 처리 대조군에서는 미약하지만 양성신호가 확인되었다.
본 연구 결과를 요약하면, Aβ 처리가 배양 PC12 세포와 생쥐의 해마조직 세포 및 대뇌피질의 신경세포를 손상시키는 결과를 초래하며 人蔘養榮湯은 손상으로부터 해당 세포를 회복시키는 효과를 나타냈다.
위상차현미경 하에서 형태적 변화를 관찰한 결과, 정상군의 일부 세포에서 확장하는 신경돌기를 관찰할 수 있었다. PC12 세포에 Aβ peptide를 처리한 경우 세포체의 위축이 관찰되었고 신경 돌기의 확장은 거의 보이지 않았다.
이러한 결과는 Aβ에 의한 세포 손상에 세포자멸(apoptosis)경로의 활성화가 크게 관여하지 않고 있다는 것을 암시하며, 동시에 다른 세포사멸 기전인 괴사가 활성화되었을 가능성을 암시한다.
해마조직의 경우 phospho-Erk1/2는 Aβ 처리 후 완전히 소멸되었으나 galantamine 양성대조군과 人蔘養榮湯 실험군에서 정상군 수준으로 회복되었다(Fig. 5).

후속연구

따라서 Aβ가 치매 환자의 뇌에서 생성되어 뇌조직의 퇴행에 관련된다는 사실을 고려하면 人蔘養榮湯은 신경조직 손상으로 인해 야기될 수 있는 AD 치료를 위한 약물로 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 人蔘養榮湯의 약리학적 기전 및 임상적 활용에 관한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
이상의 결과로 人蔘養榮湯은 Aβ를 처리한 AD 연계성 뇌조직에서 신경세포의 손상에 회복 효과를 갖는 것으로 평가되며, AD의 치료에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알츠하이머병이란?	알츠하이머병(Alzheimer'sdisease; AD)은 퇴행성 치매의 대표적인 원인 질환으로, 서서히 진행하는 기억력 장애로 시작하여 언어 장애, 시공간 기능 장애, 전두엽 기능 장애 등 여러 인지기능의 장애를 초래한다. AD는 미만성 신경세포 소실, 과인산화된 타우 단백으로 이루어진 신경 섬유 다발 또는 신경섬유농축제의 세포내 축적, 퇴행위축 신경돌기로 둘러싸인 amyloidβ protein(Aβ)의 세포외 축적 등의 중요한 구조적 변화가 동반된다1).
	알츠하이머병은 어떤 장애를 초래하는가?	알츠하이머병(Alzheimer'sdisease; AD)은 퇴행성 치매의 대표적인 원인 질환으로, 서서히 진행하는 기억력 장애로 시작하여 언어 장애, 시공간 기능 장애, 전두엽 기능 장애 등 여러 인지기능의 장애를 초래한다. AD는 미만성 신경세포 소실, 과인산화된 타우 단백으로 이루어진 신경 섬유 다발 또는 신경섬유농축제의 세포내 축적, 퇴행위축 신경돌기로 둘러싸인 amyloidβ protein(Aβ)의 세포외 축적 등의 중요한 구조적 변화가 동반된다1).
	알츠하이머병은 어떤 구조적 변화가 동반되는가?	알츠하이머병(Alzheimer'sdisease; AD)은 퇴행성 치매의 대표적인 원인 질환으로, 서서히 진행하는 기억력 장애로 시작하여 언어 장애, 시공간 기능 장애, 전두엽 기능 장애 등 여러 인지기능의 장애를 초래한다. AD는 미만성 신경세포 소실, 과인산화된 타우 단백으로 이루어진 신경 섬유 다발 또는 신경섬유농축제의 세포내 축적, 퇴행위축 신경돌기로 둘러싸인 amyloidβ protein(Aβ)의 세포외 축적 등의 중요한 구조적 변화가 동반된다1). 지난 수십 년간의 연구를 통해 Aβ가 조직에 독성을 부여함으로서 신경세포에 독성을 주는 것이 확인되면서, Aβ의 형성을 차단하는 것이 인간의 뇌에서 치매의 진행을 조절할 수 있을 것이라는 가정 하에 Aβ 생성과 관련된 대표적인 물질인 secretase에 대한 다양한 연구가 진행 중이다2-5).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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