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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 염증반응으로 인해 사람동맥평활근세포의 migration 증가와 MMP-9의 발현이 증가한다는 보고(12)에 따라 염증성 cytokine인 TNF-α을 평활근세포에 처리하여 발현되는 동맥경화관련 지표인자인 MMP-9의 활성억제에 대해 연구하였다.
- 따라서 본 연구에서는 염증반응으로 인해 사람동맥평활근세포의 migration 증가와 MMP-9의 발현이 증가한다는 보고(12)에 따라 염증성 cytokine인 TNF-α을 평활근세포에 처리하여 발현되는 동맥경화관련 지표인자인 MMP-9의 활성억제에 대해 연구하였다. 이에 기존 개다래 추출물에 비해 초임계 박추출물의 기능성이 더욱 우수한 것으로 나타났기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 6 well plate에 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액을 이용하여 HASMC를 3×105 cells/well의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 시료와 TNF-α(100 ng/mL)를 처리하였다. 24시간 후 배양 상층액을 취하여 0.1% gelatin을 포함한 SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 gel은 SDS를 제거하기 위해 washing buffer(2.
- MMP-9의 활성을 알아보기 위해 gelatin zymography를 실시하였다. 6 well plate에 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액을 이용하여 HASMC를 3×105 cells/well의 농도로 24시간 동안 부착시킨 후 FBS가 없는 무혈청 배양액으로 갈아준 다음 시료와 TNF-α(100 ng/mL)를 처리하였다.
- Nitrite의 농도(μM)는 sodium nitrite(NaNO2)를 사용하여 얻은 표준 직선과 비교하여 산출하였다.
- 각 시료의 추출물 혹은 LPS를 처리한 배양액을 이용하여 TNF-α 측정에 사용하였다.
- 건조 상태의 개다래 1 kg을 구입하여 가볍게 수세하여 건조한 후, 개다래 무게의 10배량(w/v)의 70% 식용주정을 가하여 실온에서 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액을 여과지(Whatman No.
- 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동하고, 전기영동을 하여 분리한 단백질은 immobilon-P transfer membrane(Millipore, Bedford, MA, USA)과 transfer buffer(20% methanol, 25 mM Tris-Hcl, 192 mM glycine)를 사용하여 180 mA에서 90분간 전이시켰다. 계속하여 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체를 반응시키고 TTBS으로 세척한 후 마지막에 증류수로 세척하고 membrane에 ECL(enhanced chemiluminoesence) 용액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다.
- 이에 비해 초임계 오일 추출물이나 박 추출물을 각각 500 μg/mL, 100 μg/mL으로 처리하였을 때, 오일이나 박 추출물에서 70% 이상의 NO 소거활성을 보인 그룹은 11, 13, 14이었다(Table 3). 그 중 NO 소거활성이 우수하고 추출수율이 가장 좋은 박 11을 선택하여 다음 실험을 진행하였다. 또한 박 11추출물을 개다래 주정 추출물과 비교하기 위해 박 11 추출물을 10, 100 μg/mL을 처리하였을 때, 주정 추출물의 NO 소거율은 각각 4.
- 5)에 24시간동안 37℃ incubator에서 반응시켜 기질분해를 유도하였다. 반응한 gel을 0.2% Coomassie brilliant blue 용액으로 염색하고, 10% methanol과 10% acetic acid로 탈색하여 MMP-9의 활성 정도를 확인하였다.
- 배양 종료 후 상등액을 제거하고 각 well에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 microplate reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
- 초임계 추출을 하고 남은 부산물인, 개다래 박 무게의 10배량(w/v)의 70% 식용주정을 가하여 실온에서 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액을 여과지를 사용하여 2회 여과하고, 상등액은 rotary vacuum evaporator로 55oC에서 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.
대상 데이터
- 대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM(Gibco-BRL, Rockville, MD, USA) 배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다. 또한 사람의 대동맥 평활근 세포주인 Human Aortic Smooth Muscle Cells(HASMC)은 Bio-Whittaker사(Walkersville, MD, USA)로부터 분양받아 사용하였다.
- 7 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% antibiotics(penicillin/streptomycin)를 첨가한 DMEM(Gibco-BRL, Rockville, MD, USA) 배지를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ incubator에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다. 또한 사람의 대동맥 평활근 세포주인 Human Aortic Smooth Muscle Cells(HASMC)은 Bio-Whittaker사(Walkersville, MD, USA)로부터 분양받아 사용하였다. HASMC은 DMEM에 10% FBS와 1% antibiotics가 첨가된 배지에서 37℃의 5% CO2 배양기에서 2-3일에 한번 씩 계대 배양하였다.
- 세포 배양액 내의 PGE2 양을 측정하기 위해 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하여 실험하였다. 각 시료의 추출물 혹은 LPS 를 처리한 배양액을 이용하여 PGE2 측정에 사용하였다.
- 초임계유체추출장치(SFT-100XW, Supercritical Fluid Technologies, Inc., Newark, DE, USA)를 사용하여 Table 1의 조건으로 개다래를 추출하였다. 즉, 시료 40 g을 100 mL의 추출조에 넣고 일정한 온도와 압력의 추출조건(Table 1)에서 CO2의 유속은 2 mL/min로 dynamic mode에서 추출하였다.
데이터처리
- 대조군과 추출물 처리군의 실험결과에 대한 통계처리는 Student’s t-test로 비교하였다.
이론/모형
- Cells were treated with the indicated concentrations of extract for 24 h. Cell viability was determined by an MTT assay (A). Cells were treated with the indicated concentrations of extract in the presence of TNF-α (100 ng/mL) for 24 h.
- NO생성량 측정은 Griess Reagent System의 방법(13)에 따라 RAW 264.7 세포주를 1×105 cells/well로 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후 LPS(100 ng/mL)와 농도별 sample 처리하여 24시간 배양하였다.
- 2B). 또한 박 11 추출물의 MMP-9 활성 억제효과가 MMP-9의 단백질 발현의 감소에 의한 것인지를 조사하기 위해 western blotting 방법으로 MMP-9의 단백질 발현을 측정하였다. HASMC에 TNF-α를 단독 처리한 군에서는 MMP-9의 단백질 발현이 증가되었으며, 박 11 추출물 50, 100 μg/ mL 처리군에서 농도 의존적으로 MMP-9의 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다(Fig.
- 박 추출물의 MMP-9 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 western blot을 수행하였다. 먼저 배양된 세포를 회수하여 lysis buffer(50 mM tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.
- 세포 배양액 내의 cytokines의 양을 측정하기 위해 Enzymelikned Immunosorbent Assay(ELISA)를 수행하였다. 각 시료의 추출물 혹은 LPS를 처리한 배양액을 이용하여 TNF-α 측정에 사용하였다.
- 시료의 세포독성을 측정하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) assay를 실시하여 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
- HASMC에 TNF-α를 단독 처리한 군에서는 MMP-9의 단백질 발현이 증가되었으며, 박 11 추출물 50, 100 μg/ mL 처리군에서 농도 의존적으로 MMP-9의 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다(Fig. 2C).
- RAW 264.7 세포에 100 ng/mL의 LPS를 처리했을 때, PGE2의 생성량은 약 20배 증가되었으며, 개다래 박 11 추출물을 각각 10, 100 μg/mL로 처리했을 때 PGE2 함량은 약 740, 500 pg/mL의 농도를 보여 박 11 추출물이 90% 이상의 PGE2 생성 억제를 보였다(Fig. 1A).
- RAW 264.7 세포주에 개다래 초임계 박 추출물을 처리하고, LPS를 처리하여 염증을 유발한 후염증인자인 NO, PGE2의 생성, 그리고 proinflammatory cytokines인 TNF-α의 생성량을 측정한 결과, 개다래 박 11 추출물은 LPS로 유도된 염증 인자들을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다.
- 개다래 박 11 추출물의 MMP-9의 활성에 미치는 영향을 측정하기 위해 세포 생존율을 MTT assay로 관찰한 결과, 박 추출물 25, 50 100 μg/mL의 농도에서 HASMC에 대한 세포 생존율은 각각 94.6, 95.7, 87.3%로 나타났다(Fig. 2A).
- 개다래의 초임계 추출 수율은 Table 2와 같이 동일한 온도에서는 압력이 증가할수록 증가하는 것으로 나타났으며, 동일한 압력에는 온도가 증가할수록 감소하는 경향이었다. 또한 동일한 온도, 압력일 경우 추출시간이 길어질수록 증가하였다.
- 결론적으로 개다래 박 11 추출물은 LPS로 유도된 염증 인자들을 효과적으로 감소시켰으며, TNF-α에 의해 증가된 MMP-9의 활성을 억제하는 것으로 나타나 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨, 관절염 등의 만성 염증성 질환의 예방과 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 박 11 추출물은 TNF-α에 의해 증가된 MMP-9의 활성을 억제함으로써 평활근세포가 혈관의 내막으로 유주하여 증식하는 것을 막아줄 것이라 생각된다.
- 또한 LPS 처리시에 TNF-α는 효과적으로 유도되었으며, 박 11 추출물을 처리했을 때, 10 μg/mL의 농도에서는 별다른 영향을 미치지 못했으나, 100 μg/mL의 농도에서 TNF-α의 생성을 약 50% 이상 감소시켰다(Fig. 1B).
- 또한 박 11추출물을 개다래 주정 추출물과 비교하기 위해 박 11 추출물을 10, 100 μg/mL을 처리하였을 때, 주정 추출물의 NO 소거율은 각각 4.61, 19.00%을 나타내 NO 소거활성이 미미한 편이었으나, 초임계 박 11 추출물의 경우, 각각 36.63, 79.58%을 나타내 우수한 NO 소거활성을 보였다(Table 4).
- 박 11 추출물의 MMP-9 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 zymography를 실시한 결과, TNF-α를 단독으로 처리한 군에서 MMP-9이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
- 이에 박 추출물을 농도별로 처리한 결과, 25 μg/mL의 농도에서는 MMP-9 활성에 변화가 없었으나 50, 100 μg/mL의 농도에서 MMP-9의 활성이 효과적으로 감소됨을 확인하였다(Fig. 2B).
- 특히 45, 55℃에서 압력이 3,000 psi에서 4,500 psi로 증가할 경우 수율이 2배 정도 증가하는 경향을 나타내었으나 45℃, 4,500 psi의 경우 1시간 추출 시 0.65±0.03%에서 2시간 추출 시 0.72±0.04%로 시간이 증가하여도 추출수율이 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다.
- 활성질소종(reactive nitrogen species)의 하나이며, 염증반응의 중요한 작용인자로 알려진 nitric oxide(NO)에 대한 추출물의 소거 효과를 관찰한 결과, 대조구에서 LPS 유도에 의한 NO 생성량이 약 45 μM이었다.
후속연구
- 04%로 시간이 증가하여도 추출수율이 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 온도, 압력, 추출시간을 고려하여 볼 때 45℃, 4,500 psi에서 1시간 동안 추출하는 것이 가장 바람직할 것으로 판단되며 추후 연구에서는 4,500 psi 이상의 조건도 고려해 보아야 할 것이다.
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