문제 정의

• 따라서 본 연구에서는 玉屛風散에 蒼耳子散을 가미한 옥병풍산합창이자산(玉屛風散合蒼耳子散(Okbyungpoongsan-Hap-Changijasan; KOB01)물추출물의 compound 48/80 유도 전신성 즉시형 알레르기 반응과 난알부민 유도 알레르기 비염 동물모델 및 비만세포에서의 항알레르기 효능을 조사하였다.
• 본 연구에서는 玉屛風散合蒼耳子散의 알레르기 비염 개선 효과를 확인하기 위해 compound 48/80에 의한 전신성 즉시형 알레르기 반응과 난알부민에 의한 알레르기 비염 동물모델 및 비만세포에서 항알레르기 효과를 평가하였다. 그 결과

  제안 방법

  • 1% OVA용액 2 ㎖을 분사함으로써 알레르기 비염을 유발하였다. 각 군은 OVA 용액 대신 생리식염수를 복강주사한 정상군(6마리), OVA 감작을 통해 알레르기 비염이 유발된 대조군(6마리), OVA 복강 감작 후 7일 동안 매일 1회 KOB01(100, 200 ㎎/㎏)을 경구투여한 실험군 및 DSCG(50 ㎎/㎏)를 경구투여 한 양성대조군으로 나누었다. 비점막 조직(nasal mucosa)의 변화를 관찰하기 위해 알레르기 비염 유발 후 동물을 희생시키고 머리를 분리한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다.
  • 흰쥐의 복강에 compound 48/80(8 ㎎/㎏)을 주사하여 전신성 알레르기 반응을 유발하였다. 각 군은compound 48/80 대신 생리식염수를 투여한 정상군(6마리), compound 48/80을 복강투여한 대조군(6마리), 대조군에 KOB01(100, 200 ㎎/㎏)을 경구투여 한 실험군(12 마리) 및 항히스타민제인 disodium cromoglycate(DSCG, 50 ㎎/㎏)를 경구투여한 양성대조군(6마리)으로 나누었으며, KOB01과 DSCG는 compound 48/80 투여 1시간 전에 경구투여하였다. 히스타민 농도를 측정하기 위해 난알부민(OVA) 1 ㎎을 PBS와 수산화알루미늄 겔(Al(OH)3 gel)을 1:1로 혼합한 용액 1 ㎖에 녹인 후 7일 간격으로 3회에 걸쳐 생쥐의 복강 내 주사함으로써 감작시켰으며, 마지막 복강 주사 7일 후 생쥐를 50×15×50 ㎝ 크기의 상자 안에 넣고 0.1% OVA용액 2 ㎖을 분사함으로써 알레르기 비염을 유발하였다.
  • 후)외부 자극에">외부자극에 의해 탈과립화되어 화학매개물질들의 분비하게 됨으로써 알레르기 반응을 유도하게 된다. 따라서 비만세포의 탈과립화 현상에 대한 KOB01의 억제효과를 확인하기 위해서 KOB01을 처리한 후 compound48/80를 통해 유도되는 탈과립현상을 현미경으로 관찰하였다.
  • 후)발색 정도를">발색정도를 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성정도는 세포만 배양한 대조군의 100%생존도를 기준으로 상대적인 세포생존도(cell viability; %)를 계산하였다.
  • 후)비만 세포에서의">비만세포에서의 KOB01의 독성정도를 평가하기 위해 HMC-1 세포에 다양한 농도(0.2~3㎎/㎖)의 KOB01을 처리한 후 MTT assay를 수행하였다.
  • 비만세포에서의 탈과립(degranulation) 현상을 관찰하기 위하여 HMC-1 세포(2 × 105 cells/㎖)를 6-well culture plate에 하룻밤 배양한 다음 여러 농도의 KOB01을 처리하여 1시간 동안 전처리하였다.
  • 후)양성대 조군으로">양성대조군으로 나누었다. 비점막 조직(nasal mucosa)의 변화를 관찰하기 위해 알레르기 비염 유발 후 동물을 희생시키고 머리를 분리한 후 비강을 둘러싸고 있는 골을 포함한 조직을 채취하였다.
  • 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리한 후 30분 동안 배양하여 탈과립을 유도하였으며 탈과립 정도를 광학현미경(x1000)으로 관찰하였다. 세포 형태가 원형 또는 난원형이거나 세포 윤곽이 뚜렷하고 세포질 내에 과립들로 채워진 상태를 정상세포로 보았으며, 세포질 한쪽 극이 볼록해지는 수포상 비만세포, 세포질 중간이 잘록한 표주박형 비만세포 및 세포 형태는 구형 또는 난형이지만 핵의 위치가 한쪽으로 치우쳐 있는 비만세포를 모두 변형된 비만세포로 관찰하였으며, 핵의 이동 없이 세포 윤곽이 불분명하고 세포질 내 과립이 세포표면으로 표출되거나 주위에 흩어져 있는 경우를 탈과립형 비만세포로 간주하였다.
  • 알레르기 비염에 대한 KOB01의 효과를 조사하기 위하여 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유도된 생쥐의 비강점막 형태변화를 H&E 염색으로 관찰하였다.
  • 후)탈과 립(degranulation)">탈과립(degranulation) 현상을 관찰하기 위하여 HMC-1 세포(2 × 10⁵ cells/㎖)를 6-well culture plate에 하룻밤 배양한 다음 여러 농도의 KOB01을 처리하여 1시간 동안 전처리하였다. 여기에 compound 48/80(10 ㎍/㎖)을 처리한 후 30분 동안 배양하여 탈과립을 유도하였으며 탈과립 정도를 광학현미경(x1000)으로 관찰하였다. 세포 형태가 원형 또는 난원형이거나 세포 윤곽이 뚜렷하고 세포질 내에 과립들로 채워진 상태를 정상세포로 보았으며, 세포질 옥병풍산합창이자산(KOB01)의 항알레르기 효과를 급성 알레르기 반응과 알레르기 비염 동물 및 비만세포에서 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
  • 조직절편의 형태학적 변화를 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin(H&E) stain kit로 염색을 수행하였으며, 염색된 조직절편을 광학현미경 하에서 상피세포층(epidermal sheet) 손상정도, 점막하 조직의 부종, 충혈, 선세포(glandular cell)의 확장 등을 살펴 형태학적 변화를 관찰하였다.
  • 후)즉시 형">즉시형 알레르기 반응에서 대한 KOB01의 효과를 조사하기 위하여 compound 48/80을 흰쥐의 복강내 투여한 후 치사율을 조사하였다
  • 후)즉시 형">즉시형 알레르기 반응에서 히스타민 분비에 대한 KOB01의 효과를 조사하기 위하여 흰쥐의 혈액으로 부터 분리된 혈청에서 효소면역반응법으로 히스타민의 농도를 측정하였다.
  • 채취한 비강조직 중 경구개의 절치유두 부위를 절단한 다음 4% formaldehyde 용액으로 24시간 고정한 다음 비중격 부위(nasal septum)를 노출시켜 13% formic acid 용액에서 24시간 탈회하였다. 이를 다시 파라핀으로 포매하여 블록을 만든 혈액으로부터 분리한 혈청 내 히스타민의 양을 histamine release assay kit를 이용한 효소면역 반응법으로 측정하였으며, 혈청 내 존재하는 히스타민의 농도는 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
  • 흰쥐의 복강에 compound 48/80(8 ㎎/㎏)을 주사하여 전신성 알레르기 반응을 유발하였다. 각 군은compound ">경구투여하였다. 히스타민 농도를 측정하기 위해 심장채혈 후 혈액으로부터 혈청을 분리하였으며, 치사율(mortality)의 측정은 전신성 알레르기 반응을 유발시킨 다음 5분 간격으로 3시간 동안 관찰한 후 다음과 같이 치사율을 구하였다. [치사율(%)

    대상 데이터

    • 본 실험에 사용된 옥병풍산합창이자산(KOB01) 처방(Table 1)의 구성약재는 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 정선한 후 사용하였다.
    • 사람의 비만세포주(human mast cell line)인 HMC-1 세포는 세명대학교 한의과대학 본초학교실로부터 분양받았으며, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 IMDM 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. HMC-1 세포에 대한 KOB01의 세포독성을 평가하기 위해서 MTT assay를 수행하였다.
    • 실험동물은 Sprague-Dawleyr계 180~210 g 수컷 흰쥐(rat)와 20~25 g 내외의 Balb/c계 수컷 생쥐(mouse)를 (주)코아텍(경기도, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 고형사료와 물은 제한 없이 공급하면서 23±3℃ 온도범위와 50±10% 상대습도를 유지하였고, 12시간 낮, 12시간 밤의 생활리듬을 주었으며 구입 후 항온항습상태에서 1주간 적응시킨 후 모델제작에 사용하였다.
    • 실험에 사용되어진 기기는 microplater reader (Asys, Sunnyvale, CA, USA), freeze-dryer(Daeil Bio Tech, Gyeongkido, South Korea), rotary evaporator(Eyela, Tokyo, Japan), UV-VIS spectrophotometer(Shimazu, Kyoto, Japan) 등이다.
    • 실험에 사용되어진 시약은 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louise, CA, USA), phorbol myristate acetate(PMA, Sigma-Aldrich), ionophore A23187 (Sigma-Aldrich), compound 48/80(Sigma-Aldrich), fetal bovineserum(FBS, Thermo HyClone, Seoulin Biosciences Co., Seoul, South Korea), Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM, Seoulin Biosciences Co.), ovalbumin(chicken egg albumin, grade V, Sigma- Aldrich), 3-4,5-dimethylthazol-2-yl-2,5-teterazolium bromide(MTT, Sigma-Aldrich), n-trityl-1,3-pro panediamine acetate(Sigma-Aldrich), Al(OH)3 gel(Sigma-Aldrich), histaminerelease assay kit(SPI Bio Bertin Pharma, Montigny-le-Bretonneux, France), Thermo hematoxylin & eosin stain kit(Seoulin Biosciences Co., Seoul, South Korea) 등이다.

  데이터처리

  • 결과는 3회 반복실험에 대한 평균과 표준편차로 나타내었으며, 통계학적 유의성 검증은 GraphPad Prism 5.0 분석프로그램의 Student t-test를 이용하였고 p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

  이론/모형

  • 사람의 비만세포주(human mast cell line)인 HMC-1 세포는 세명대학교 한의과대학 본초학교실로부터 분양받았으며, 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 IMDM 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. HMC-1 세포에 대한 KOB01의 세포독성을 평가하기 위해서 MTT assay를 수행하였다. 즉, HMC-1 세포(5 × 10⁴ cells/well)를 96-well culture plate에 100 ㎕ IMEM 배지와 함께 하룻밤 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양한 다음, 여러 농도의 KOB01을 처리하여 24시간 배양하였다.
  • Groups of rats(n=6 per group) were orally administrated with saline, KOB01(100 and 200 ㎎/㎏) or disodium cromoglycate(DSCG, 50 ㎎/㎏) and then intraperitoneally injected with compound 48/80(8 ㎎/㎏). The concentrations of serum histamine were measured by enzyme-immuno assay. ***P<0.