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문제 정의
- 본 연구에서는 백두옹의 항산화 활성을 측정하고 메탄올 추출물을 분획하여 각 분획층 중에 어떤 분획층의 항산화 효능이 가장 뛰어난지를 검증하였다. 산화에 중요한 인자인 ROS와 RNS의 소거에 대한 백두옹 분획층의 효과를 측정하기 위하여 DPPH radical, superoxide radical, nitric oxide, peroxynitrite의 소거활성을 측정하였다.
- 이러한 실험의 결과를 바탕으로 항산화 효과가 가장 뛰어난 분획층을 선정하였다. 본 연구의 결과로 백두옹 분획층의 항산화 활성에 관하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 96 well plate에 1×104 cells/well의 RAW 264.7 세포를 분주하고 약재를 농도별 (0, 10, 30, 50, 70, 100 μg/ml)로 18 시간 동안 처리하였다.
- 그 후 PBS buffer로 2회 washing한 다음 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광강도의 증가율은 대조군과 비교해서 배수 (fold)로 계산하였다.
- Mouse의 Macrophage인 RAW 264.7에 대한 백두옹 분획층의 세포독성을 측정하기 위해 MTS assay를 실시하였다. 분획층을 농도별 (0, 10, 30, 50, 70, 100 μg/ml)로 18시간 처리한 결과, 모든 분획층에서 50μg/ml의 농도에 75% 이상의 생존률을 나타내었다.
- RAW 264.7 세포에 각 분획층별로 50 μg/ml를 전처리한 다음, LPS를 처리하여 세포의 산화적 손상을 유발한 후 DCF 형광강도를 관찰하였다.
- Superoxide anions 소거활성은 Gotoh와 Niki의 방법15)을 일부 수정하여 측정하였다. 먼저 분획 층별 시료 30 ㎕에 30 mM EDTA (pH 7.
- 7 세포를 분주하고 약재를 농도별 (0, 10, 30, 50, 70, 100 μg/ml)로 18 시간 동안 처리하였다. Well당 20㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader(DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
- Well당 20㎕의 MTS solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader(DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다. 각 농도별 약재가 갖는 흡광도는 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교해서 보정하였다.
- 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS로 1회 세척한 후, PBS buffer로 희석된 10 μM DCFH-DA를 가하고, 45분간 배양하였다. 그 후 PBS buffer로 2회 washing한 다음 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다. DCF 형광강도의 증가율은 대조군과 비교해서 배수 (fold)로 계산하였다.
- 3). 그 후 동일 농도로 분획층을 처리하였을 때의 결과를 비교하였다 (Fig. 4). 그 결과 EA 분획층이 세포의 산화손상을 가장 효과적으로 보호하는 결과를 나타냈다.
- 먼저 MTS assay를 실시하여 모든 층에서 세포 독성이 없는 농도인 50 μg/ml을 선정하였다 (Fig. 3).
- 4) 130 ㎕와 혼합한 다음, 40 mM SNP 10 ㎕ 및 DAF-2 용액 50 ㎕를 첨가하였다. 반응용액을 실온에서 10분간 배양한 다음, DAF-2와 NO의 반응에 의해 생성되는 triazolofluorescein의 형광강도를 fluorescence microplate reader (SPECTRA MAX GEMINI EM, Molecular Devices Corp., USA)를 사용하여, excitation 파장 495 nm 및 emission 파장 515 nm에서 측정하였다.
- 4)로 총 용량을 3 ml로 맞췄다. 반응용액을 실온에서 20분간 배양시킨 후, 560 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 결과는 superoxide radical에 의한 NBT reduction의 IC50값으로 환산하여 표시하였다.
- 반응은 10 μM peroxynitrite를 10 ㎕ 넣으면서 시작되는데, 실온에서 10분간 배양한 다음, DHR 123과 peroxynitrite의 반응에 의해 생성되는 형광강도를 fluorescence microplate reader를 사용하여, excitation 파장 480 nm 및 emission 파장 530 nm에서 측정하였다.
- 백두옹 메탄올 추출물과 그 분획층별 추출물 간의 전자 공여능을 상호 비교하기 위하여 DPPH radical에 대한 소거활성을 측정하였다. 본 실험의 결과, 백두옹 메탄올 추출물은 83.
- 본 연구에서는 백두옹을 메탄올 추출하여 그 추출물을 Hexane, Dichloromethane, Ethyl acetate, Butanol의 네 가지 유기용매로 분획하여 각각의 추출물들의 in vitro 상에서 항산화 활성을 비교하였고, 마우스의 대식세포인 RAW 264.7을 이용하여 LPS로 ROS를 유도시킨 후 세포내의 ROS의 생산을 측정하였다. 이러한 실험의 결과를 바탕으로 항산화 효과가 가장 뛰어난 분획층을 선정하였다.
- 본 연구에서는 백두옹의 항산화 활성을 측정하고 메탄올 추출물을 분획하여 각 분획층 중에 어떤 분획층의 항산화 효능이 가장 뛰어난지를 검증하였다. 산화에 중요한 인자인 ROS와 RNS의 소거에 대한 백두옹 분획층의 효과를 측정하기 위하여 DPPH radical, superoxide radical, nitric oxide, peroxynitrite의 소거활성을 측정하였다. DPPH radical은 안정적인 free radical로 전자나 hydrogen radical을 받아서 안정적인 반자성 (diamagnetic) 분자가 되는 특성이 있어 비교적 간편하면서도 재현성 있게 항산화력을 측정할 수 있다24,25).
- 산화적 스트레스에 중요한 역할을 담당하는 대표적인 활성질소종인 nitric oxide (NO)에 대한 소거능을 관찰하였다. 이를 위해 in vitro상에서 sodiumnitroprusside (SNP)로 NO의 생성을 유도한 후, 특이적인 NO의 indicator인 4,5-diaminofluorescein (DAF-2)을 이용하여 형광강도를 측정하였다.
- 3%)을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 Fig. 1에서 도식한 바와 같이 유기용매인 hexane (H), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EA), buthanol (B)로 분획하고, 분획 후 남은 aqueous extract (A)를 수득하였다.
- 이러한 결과를 바탕으로 백두옹 분획층의 항산화효과를 보다 명확히 분석하기 위하여 마우스의 대식세포인 RAW 264.7에서 intracellular ROS를 측정하였다. Intracellular ROS radical 소거능을 측정하기 위해서는 DCF-DA assay가 사용된다.
- 산화적 스트레스에 중요한 역할을 담당하는 대표적인 활성질소종인 nitric oxide (NO)에 대한 소거능을 관찰하였다. 이를 위해 in vitro상에서 sodiumnitroprusside (SNP)로 NO의 생성을 유도한 후, 특이적인 NO의 indicator인 4,5-diaminofluorescein (DAF-2)을 이용하여 형광강도를 측정하였다. 본 실험의 결과, 백두옹 메탄올 추출물은 15.
- Peroxynitrite는 nitric oxide와 마찬가지로 RNS로 NO에 비하여 짧은 반감기를 가져 산화적 스트레스 (oxidative stress)의 강한 유도체로 알려져 있다. 이에 대한 소거활성을 측정하기 위해 in vitro상에서 peroxynitrite를 직접처리한 후 DHR123을 이용하여 형광강도를 측정하였다. 본 실험의 결과, 백두옹 메탄올 추출물은 9.
대상 데이터
- Louis, USA)에서 구입하였다. Dihydrorhodamine 123 (DHR 123)은 Molecular Probes사 (Eugene, USA)에서 구입하였고, Peroxynitrite는 Cayman Chemical사 (Ann Arbor, USA)에서 구입하였다. Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) kit, tris base는 Promega사 (Madison, USA)에서 구입하였다.
- 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 백두옹은 (주) 휴먼허브 (경북, 경산)에서 구입하여 사용하였으며, 백두옹 300g에 2000ml의 100% methanol을 가한 다음 70℃에서 24시간 추출하는 과정을 3번 실시하여 총 6000ml의 메탄올을 수득하였다. 수득한 메탄올을 여과하여 농축 및 동결건조하여 153.
- 세포배양액인 Dulbecco's Modifide Eagle Medium(DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 등의 세포배양용 시약들은 Gibco BRL사 (Grand Island, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 시약 중 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), EDTA, hypoxanthine, nitro blue tetrazolium (NBT), xanthine oxidase, sodium nitroprusside (SNP), lipopolysaccharide (LPS), 4,5-diaminofluorecein (DAF-2), 6-carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA) 등은 Sigma사 (St. Louis, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 결과는 means±SEM으로 나타내었으며, 통계분석법은 GraphPad Prism 4.0을 이용하여 one-way ANOVA followed by Duncan's multiple range tests를 실시한 후, P 값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- DPPH radical에 대한 소거활성은 Gyamfi 등의 방법14)에 따라 측정하였다. 먼저 백두옹 분획 층별 시료 50 ㎕에 0.
- Nitric oxide의 소거활성은 Sutherland 등의 방법16)에 의하여 측정하였다. 먼저 1 mg의 DAF-2를 0.
- 백두옹 분획층의 세포에 대한 독성 측정은 5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt (MTS) assay 방법18)으로 분석하였다. 이는 mitochondrial dehydrogenases에 의하여 MTS가 formazan으로 전환되는 것을 측정하는 것이다.
- 백두옹 분획층이 LPS에 의한 RAW 264.7 세포의 산화 손상을 보호하는 효과를 검토하기 위하여 DCF-DA assay를 실시하였다. RAW 264.
- 백두옹의 Peroxynitrite 소거활성은 Kooy 등의 방법17)에 의하여 측정하였다. 분획 층별 시료 10 ㎕를 4 ㎕의 5 mM DTPA와 0.
- 백두옹의 분획물이 LPS에 의한 RAW 264.7 세포의 산화적 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCF-DA assay를 실시하였다19,20). 먼저 세포를 96 well plate에 1×104 cells/well로 분주하고, 분획층별로 50 μg/ml 을 처리하였다.
성능/효과
- 그러므로 과도한 NO의 생성을 저해하고, peroxynitrite를 소거하는 물질은 산화손상을 억제 하는데 유용할 것으로 기대된다27). NO를 소거하는 작용도 EA 분획층이 가장 강력하였으며, peroxynitrite의 경우에는 DCM과 EA 분획층이 가장 소거능력이 좋았다 (Fig 2C, 2D). 이러한 실험결과를 종합하여 보면 백두옹의 분획층들 중에서 EA 분획층이 가장 좋은 수소공여능, ROS와 RNS 소거능을 가지고 있다고 판단되었다.
- 각 분획층을 50 μg/ml의 농도로 처리하였을 때, 대조군과 비교하여 methanol 층은 1.99배, hexane 층은 2.11배, DCM 층은 1.72배, EA 층은 1.49배, butanol 층은 1.67배, aqueous 층은 1.66배로 나타났다.
- 4). 그 결과 EA 분획층이 세포의 산화손상을 가장 효과적으로 보호하는 결과를 나타냈다. 이는 백두옹의 EA 분획층이 세포 내의 ROS를 효과적으로 억제하여 세포의 산화손상을 방지하는데 가장 좋은 효과가 있음이 증명된 것이다.
- 7 세포에 각 분획층별로 50 μg/ml를 전처리한 다음, LPS를 처리하여 세포의 산화적 손상을 유발한 후 DCF 형광강도를 관찰하였다. 그 결과, 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여, LPS 만을 처리한 실험군에서는 평균 3.53배 증가하여 유의할 만한 형광강도의 증가를 나타내었다. 이는 LPS의 처리가 RAW 264.
- 염증을 일으키는 원인으로는 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) 뿐만 아니라 ROS와 RNS가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다23). 따라서 기존에 항염증 효능이 검증된 한약재는 항산화 효과를 나타낼 수 있는 가능성이 있다고 사료되었다. 송7)은 백두옹 추출물의 항염증 효과에 관하여 규명하면서 NO와 염증성 사이토카인의 생산을 조사하는 방법을 선택한 바 있으나 항산화 효능을 규명하기 위해서는 다양한 종류의 ROS와 RNS의 소거능을 측정하는 작업이 필요하였다.
- 백두옹 분획층의 항산화 효과를 검증하기 위하여 free radical의 소거능을 측정하고, 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 실험을 진행한 결과 백두옹은 free radical을 효과적으로 소거하고 마우스의 대식세포에서 산화 손상을 보호하는 효과가 있으며, 그 분획층 중에는 EA 분획층이 가장 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 이는 백두옹이 차후 천연 항산화 물질을 개발할 때 유효한 기반 한약재라는 것을 의미하며, 차후 심화 연구나 실용화 연구를 할 때 EA 분획층을 대상으로 하는 것이 가장 효율적일 것으로 사료된다.
- 본 실험의 결과, 백두옹 메탄올 추출물은 15.38±2.06 μg/ml에서 50%의 NO 소거능을 나타내었고, 분획층의 경우에는 hexane층은 13.13±0.93 μg/ml, DCM 층은 1.95±0.13 μg/ml, EA 층은 1.44±0.23 μg/ml, butanol 층은 23.06±4.72 μg/ml, aqueous 층은 11.37±0.48 μg/ml의 농도에서 50%의 소거활성을 나타내었다.
- 본 실험의 결과, 백두옹 메탄올 추출물은 83.52±4.93 μg/ml의 농도에서 50%의 DPPH radical을 소거하였다.
- 분획층을 농도별 (0, 10, 30, 50, 70, 100 μg/ml)로 18시간 처리한 결과, 모든 분획층에서 50μg/ml의 농도에 75% 이상의 생존률을 나타내었다.
- DPPH radical은 안정적인 free radical로 전자나 hydrogen radical을 받아서 안정적인 반자성 (diamagnetic) 분자가 되는 특성이 있어 비교적 간편하면서도 재현성 있게 항산화력을 측정할 수 있다24,25). 실험결과 백두옹의 EA 분획층이 DPPH radical을 가장 효과적으로 소거하는 것으로 나타났다 (Fig. 2A). Superoxide radical은 산화적인 산화의 과정 중에 생성되며 다른 ROS로 전환되어 직접적 혹은 간접적으로 세포손상을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 항산화 방어체계에 문제가 생겨 전환이 원활하지 못하면 산화스트레스의 중요한 요인이 된다26).
- NO를 소거하는 작용도 EA 분획층이 가장 강력하였으며, peroxynitrite의 경우에는 DCM과 EA 분획층이 가장 소거능력이 좋았다 (Fig 2C, 2D). 이러한 실험결과를 종합하여 보면 백두옹의 분획층들 중에서 EA 분획층이 가장 좋은 수소공여능, ROS와 RNS 소거능을 가지고 있다고 판단되었다.
- 항산화능을 측정하기 위하여 널리 행해지는 Superoxide radical에 대한 소거활성의 경우에는, 백두옹 메탄올 추출물의 경우 483.9±38.84 μg/ml의 농도에서 50%의 소거활성을 나타내었고, 분획층의 경우에는 hexane층과 DCM 층은 50%의 소거활성을 계산할 수 없었고 EA 층은 25.88±2.10 μg/ml,butanol 층은 211.4±3.77 μg/ml, aqueous 층은 235.0±4.79 μg/ml의 농도에서 50%의 superoxideanions 소거능을 나타내었다.
후속연구
- 7 세포에서 실험을 진행한 결과 백두옹은 free radical을 효과적으로 소거하고 마우스의 대식세포에서 산화 손상을 보호하는 효과가 있으며, 그 분획층 중에는 EA 분획층이 가장 효과가 뛰어남을 알 수 있었다. 이는 백두옹이 차후 천연 항산화 물질을 개발할 때 유효한 기반 한약재라는 것을 의미하며, 차후 심화 연구나 실용화 연구를 할 때 EA 분획층을 대상으로 하는 것이 가장 효율적일 것으로 사료된다.
- 이러한 결과로 미루어 볼 때, 백두옹에서 항산화 물질을 찾기 위한 추가적인 연구를 실시할 때는 백두옹의 EA 분획층을 우선시해야 할 것이다.
- 송7)은 백두옹 추출물의 항염증 효과에 관하여 규명하면서 NO와 염증성 사이토카인의 생산을 조사하는 방법을 선택한 바 있으나 항산화 효능을 규명하기 위해서는 다양한 종류의 ROS와 RNS의 소거능을 측정하는 작업이 필요하였다. 하지만 기존에는 백두옹의 ROS와 RNS의 소거능에 관하여 총괄적으로 연구된 바가 없어 추가적인 연구가 필요하다고 판단하였다.
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