[논문]도사자(菟絲子)가 RANKL 유도 파골세포(破骨細胞)에 미치는 영향

김준연; 황귀서

[국내논문] 도사자(菟絲子)가 RANKL 유도 파골세포(破骨細胞)에 미치는 영향
The Effects of Cuscuta japonica Chois on Gene Expression in RANKL-induced RAW 264.7 Cell 원문보기

대한예방한의학회지 = Journal of Society of Preventive Korean Medicine, v.14 no.2, 2010년, pp.77 - 89

김준연 (경원대학교 한의과대학 예방의학교실) , 황귀서 (경원대학교 한의과대학 예방의학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was performed to evaluate the effect of CJ(Cuscuta japonica Chois) on osteoclast differentiation and gene expression. Methods : The osteoclastogenesis and gene expression were determined in RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)－stimulated RAW 264.7. The results were summarized as followes. Results : CJ decreased the number of TRAP positive cell in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. CJ decreased the expression of RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B), $TNF{\alpha}$, and IL-6 in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. CJ decreased the expression of iNOS and COX-2 in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. CJ decreased the expression of Cathepsin K in RANKL-stimulated RAW264.7 cell. Conclusions : It is concluded that CJ might decrease the bone resorption resulted from decrease of osteoclast differentiation and it's related gene expression.

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AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구는 토사자 추출물이 골 흡수 억제를 통하여 골다공증에 효과적인 파골세포의 분화와 관련, 유전자 활성화에 관여하는 인자들에 대한 효과를 평가하고자 하였다. 이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW 264.
7 cell에 RANKL과 TGFβ를 첨가한 배지로 배양한 경우 다수의 TRAP-positive 다핵세포가 형성되는 것이 관찰되었다. 이 세포를 파골세포로 하여 CJ 추출물이 파골세포 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 측정 결과, TRAP-positive 다핵세포 숫자는 50㎍/㎖의 농도를 가진 group은 Control에 비해 약 62% 감소하였고, 100㎍/㎖인 group은 Control에 비해 약 74% 감소하였다.
본 연구에서는 CJ가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 TNFα의 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
RANK 는 RANKL의 수용체로서 RANK/RANKL 복합체는 파골세포 분화 및 활성화에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 CJ가 파골세포 기능에 관여하는 유전자들에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 RANK의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 및 real time PCR system을 이용하여 평가하였다. Fig.
PKA는 cAMP 의존적 protein kinase로 파골세포 기능 활성화와 인산화와 활성 증가를 유발한다. 본 연구에서는 CJ가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, CJ는 200ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 농도에서는 억제 효과를 나타내었다(Fig.
이러한 증가된 NO는 파골세포형성과 골흡수를 억제한다. 본 연구에서는 CJ가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig.
본 연구에서는 우선적으로 골 흡수를 억제하여 골다공증에 효과적인 약재를 찾아내기 위하여, 토사자 추출물(CJ)이 RANKL 유도 RAW 264.7의 TRAP 양성 세포 생성을 억제하는지를 검색하였다. 이와함께 토사자가 파골세포의 단백질 합성에 미치는 구체적인 작용기전 밝히기 위하여, 유전자 발현에 대한 검색을 실시하였다.
7의 TRAP 양성 세포 생성을 억제하는지를 검색하였다. 이와함께 토사자가 파골세포의 단백질 합성에 미치는 구체적인 작용기전 밝히기 위하여, 유전자 발현에 대한 검색을 실시하였다. TRAP은 성숙한 파골세포에서 발현하는 것으로 TRAP 양성세포는 파골세포로 분화 여부를 판단하는 기준으로 이용될 수 있다.
1). 이를 바탕으로 파골세포 기능에 관련되는 단백질을 합성하는 유전자 발현을 측정하여 구체적인 기전을 밝히고자 하였다. RANK(receptor activator of nuclear factot kappa B)는 파골세포 표면에 존재하는 TNF receptor family 단백질로 알려져 있다.

제안 방법

이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW 264.7 cell에서의 TRAP(+) 생성능을 측정하였으며, 관련 유전자인 TRAP, OPG, RANK, Cathepsin K, COX-2, iNOS,TNFα 등의 발현을 측정하였다.
토사자 100g을 분말로 만들어 플라스크에 넣은 후, MeOH 500ml를 가하고 6시간 이상 가열하여 환류 추출하였다. 여과지를 이용하여 여과한 다음, 여액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축한 다음 농축액을 동결 건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 토사자 추출물(이하 CJ라 함)을 DMSO를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.
실험군은 (1) RANKL 유도 대조군(C), (2) 50㎍/㎖의 토사자 추출물을 투여한 군(CJ50), (3) 100㎍/㎖의 토사자 추출물을 투여한 군(CJ100), (4) 200㎍/㎖의 토사자 추출물을 투여한 군(CJ200)으로 하였다.
RANKL로 RAW 264.7 cell를 파골세포로 유도한 후, 성숙한 파골세포의 발현 marker로 알려진 TRAP를 염색하여 TRAP-positive 세포를 확인하였다. 분화시킨 세포를 PBS로 세포를 2회 세척하고, 3.
7% formaldehyde-citrateacetone 용액으로 10분 고정시키고 증류수로 2회세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive한 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO3 용액을 같은 비율로 섞어 만든 용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를 포함한 용액을 고정시킨 세포에 처리하고 상온에 30분 이상 방치하였다. 광학현미경으로 관찰하여 핵이 3개 이상인 TRAP-positive한 다핵세포(TRAP(+) MNCs)를 계수하여 파골세포의 생성지표로 하였다.
침전물을 75% EtOH로 2회 washing한 다음 건조시켰다. 유전자 발현에 필요한 RNA양을 대조군과 시험군에서 mRNA양이 같도록 조정한 다음, 전기영동으로 확인하여 사용하였다.
iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2 의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense 는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을사용하였다.
iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense 는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을 사용하였다.
oligo(dT)12-18(Promega, USA), reaction buffer (50mM Tris-HCl, 75mM KCl, 3mM MgCl₂,10mM DTT, pH 8.3), 1mM dNTP(Biotools, Spain)과 200unit M-MLV-RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15㎕에 10X PCR buffer, 0.
3), 1mM dNTP(Biotools, Spain)과 200unit M-MLV-RT(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, Promega)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 15㎕에 10X PCR buffer, 0.2mM dNTPs, 2pmole 의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25unit의 Taq polymerase (Biotools, Spain)을 넣어 PCR을 시행하였다.
Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 CAGC CTC GTC CCG TAG ACA AA이었으며, antisense는 CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC 이었다. PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동한다.
우선 시험관에 정량한 RNA 5ug, 50ng/㎕의 random hexamer 3㎕, 10mM dNTP 1㎕를 넣고 DEPC H2O를 가하여 10㎕의 RNA/primer mixture를 만들었다. 실험용 samPMe을 65C에서 5분간 incubation 시킨 후 1분 이상 얼음에 방치하였다.
RNase 1㎕를 가하고 다시 37℃에서 20분간 incubation 시킨 다음, 사용 시까지 -20℃에 보관하였다. 각각의 optical tube에 2배의 SYBR Green Mix 12.5㎕, cDNA 0.2㎕, 5pmol/㎕ primer pair mix 1㎕, 11.3㎕ H₂O를 넣고, 50℃ 2분 1cycle, 95℃ 10min 1cycle, 95℃ 15sec, 60℃ 30sec, 72℃ 30sec 40cycles, 72℃ 10min 1cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다.
3㎕ H₂O를 넣고, 50℃ 2분 1cycle, 95℃ 10min 1cycle, 95℃ 15sec, 60℃ 30sec, 72℃ 30sec 40cycles, 72℃ 10min 1cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다. SDS 7000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정했다. SDS 7000 software를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.
토사자 추출물(CJ)이 파골세포 분화 및 활성을 억제하여 골의 재흡수를 억제하는지를 평가하기 위하여, RANKL 유도 RAW 264.7 cell의 TRAP-positive 세포 형성에 미치는 영향을 측정하였으며, 골 흡수관련 인자들의 유전자 발현에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

대상 데이터

여과지를 이용하여 여과한 다음, 여액을 Evaporator (EYELA, Japan)을 이용하여 감압 농축한 다음 농축액을 동결 건조하여 실험 시까지 냉동보관 하였다. 실험 시에는 토사자 추출물(이하 CJ라 함)을 DMSO를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45um의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다.
실험에 사용된 파골세포 전구세포는 mouse myeloid 세포주인 RAW 264.7 세포에 RANKL를 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.
7 세포에 RANKL를 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하였다.
5M NaOH을 2ul 씩 가한 후 37℃에서 15분간 incubation하였으며, 2M HEPES buffer(free acid)를 10ul 가하여 중화시켰다. 각각의 시약은 Amersham Bioscience 에서 구입하였다.
RANK의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TRAP의 sense primer는 AGC AGC CAA GGA GGA CTA CGT T, antisense는 TCG TTG ATG TCG CAC AGA GG을 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다.
RANK의 sense primer는 GCA AAC CTT GGA CCA ACT GCA C이었으며, antisense는 AAT CCA CCG TGC TTT CAG TCC C을 사용하였다. TRAP의 sense primer는 AGC AGC CAA GGA GGA CTA CGT T, antisense는 TCG TTG ATG TCG CAC AGA GG을 사용하였으며, Cathepsin K의 sense primer는 TTA ATT TGG GAG AAA AAC CT, antisense는 AGC CGC CTC CAC AGC CAT AAT를 사용하였다. iNOS의 sense primer는 AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT, antisense는 GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC를 사용하였으며, COX-2 의 sense primer는 GGA GAG ACT ATC AAG ATA GT, antisense는 ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA, TNFα의 sense primer는 ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC, antisense 는 TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT을사용하였다.

데이터처리

PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (30초), 59℃ (30초), 72℃ (45초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% agarose gel에 전기영동한다. 전기영동 결과 나온 band를 density 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1(Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.
각 결과에 대한 유의성 검증은 student’s t-test를 이용하였다.

성능/효과

3) 분화한 파골세포는 NF-κB, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt 활성화 등을 통하여 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase), cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진한다.
이 세포를 파골세포로 하여 CJ 추출물이 파골세포 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 측정 결과, TRAP-positive 다핵세포 숫자는 50㎍/㎖의 농도를 가진 group은 Control에 비해 약 62% 감소하였고, 100㎍/㎖인 group은 Control에 비해 약 74% 감소하였다. 또한, 200㎍/㎖인 group도 Control 에 비해 약 88% 감소하였다.
실험 결과, Fig. 3과 같이 CJ는 200ug/ml, 100ug/ml 농도에서 TNFα 유전자 발현을 억제하였다.
본 연구에서는 CJ가 세포성을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 IL-6의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험결과, CJ는 200ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 농도에서는 억제 효과를 나타내었다(Fig. 4).
본 연구에서는 CJ가 유전자 발현을 조절하는 인자에 미치는 영향을 평가하는 일환으로 iNOS의 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 실험 결과, Fig. 6와 같이 CJ는 200ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 농도에서 iNOS 유전자 발현을 억제시켰다.
따라서, 파골세포의 활성화로 인한 재흡수과정은 세포에서 발현되는 Cathepsin K나 MMP-9, TRAP의 mRNA를 지표로 사용하여 측정할 수 있다. 실험결과, Fig. 7과 같이 CJ는 200ug/ml, 100ug/ml, 50ug/ml 농도에서 Cathepsin K 발현을 억제하였다.
관련된 실험결과에서 토사자 추출물(CJ)은 TNFα 유전자 발현 억제를 보였다.
그러나, 토사자는 TNFα의 발현을 억제하여 파골세포 발현을 억제하는 것으로 판단되었다.
또한, G-protein에 연계된 Adenylate Cyclase를 활성화시켜 cAMP -dependent PKA의 활성을 증가시키며, cAMP에 의존적인 RANKL과 OPG -osteoprotogerin의 작용을 거쳐 collagen을 분해하는 MMP의 유전 발현을 촉진하여 골의 재흡수에 관여한다. 실험결과, CJ는 파골세포에서 COX-2 유전자 발현을 억제하였다(Fig. 5).
²⁰⁾ 실험에서 IL-6의 발현을 억제하는(Fig. 4) 토사자 추출물은 cAMP 생성에 관여하는 adenylate cyclase의 활성이나 cAMP 의존적인 PKA의 활성을 조절할 수 있을 것으로 판단되었다. 이와는 별도로 파골세포의 활성 조절에는 COX-2 과정을 거쳐 생성되는 PGE₂가 관여하는데,²¹⁾ 토사자는 COX-2 유전자 발현을 럭제하였다(Fig.
^24-25) 이들의 작용을 통해 나타나는 Cathepsin K는 RANKL이나 M-CSF (macrophage colony stimulating factor)등을 처리하는 경우 발현되는 단백질로 알려져 있으 며, MMP-9, TRAP 등과 함께 골의 흡수에 직접적으로 관여하고 있다.²⁶⁾ 토사자는 파골세포의 활성화로 인한 재흡수과정은 세포에서 발현되는 Cathepsin K 발현을 억제하였다(Fig. 7). 이상의 결과, 토사자는 파골세포의 분화 및 기능을 증가억제 할 수 있는 것으로 평가되었으며, 이는 파골세포(OC)의 분화와 기능을 활성화시키는 유전자의 발현을 억제하여 나타나는 것으로 판단되었다.
7). 이상의 결과, 토사자는 파골세포의 분화 및 기능을 증가억제 할 수 있는 것으로 평가되었으며, 이는 파골세포(OC)의 분화와 기능을 활성화시키는 유전자의 발현을 억제하여 나타나는 것으로 판단되었다.
(2) CJ는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 RANK, TNFα, IL-6의 발현을 억제하였다.
(3) CJ는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하였다.
(4) CJ는 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 Cathepsin K의 발현을 억제하였다.
이상의 연구결과, 토사자 추출물(CJ)은 RANKL 유도 RAW 264.7 세포에서 파골세포로의 분화를 억제하였으며, 파골세포 분화 및 기능 활성화에 관련된 유전자 발현을 억제하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	파골세포는 무엇에 의해 분화되는가?	파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화된다.1-2) 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다.
	RANKL은 무엇을 유발하는가?	파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화된다.1-2) 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다.3) 분화한 파골세포는 NF-κB, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt 활성화 등을 통하여 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase), cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진한다.
	유전자 활성화에 관여하는 인자들에 대한 효과를 평가하고자 무엇을 진행했는가?	본 연구는 토사자 추출물이 골 흡수 억제를 통하여 골다공증에 효과적인 파골세포의 분화와 관련, 유전자 활성화에 관여하는 인자들에 대한 효과를 평가하고자 하였다. 이를 위하여 RANKL로 자극한 RAW 264.7 cell에서의 TRAP(+) 생성능을 측정하였으며, 관련 유전자인 TRAP, OPG, RANK, Cathepsin K, COX-2, iNOS,TNFα 등의 발현을 측정하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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