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문제 정의
- 본 연구에서는 여러 논문에서 항 알레르기 염증 반응에 유의한 효과를 입증한 牛蒡子가 아토피 피부염에 미치는 영향에 대해 알아보고자 실험을 시행하였다.
- 염증 유발된 등 조직을 떼어내 알레르기 반응의 중요한 지표인 IL-4와 IFN-γ의 RNA 발현 변화를 RT-PCR로 분석하여 牛蒡子의 항 알레르기 반응을 관찰한 결과를 보고하는 바이다.
- 이에 본 연구에서는 牛蒡子가 아토피 발진 억제에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 in vivo에서 DNFB 처리된 NC/Nga mice에게 우방자를 경구 투여하여 투약 전후의 Behavior를 관찰 비교하였다. 염증 유발된 등 조직을 떼어내 알레르기 반응의 중요한 지표인 IL-4와 IFN-γ의 RNA 발현 변화를 RT-PCR로 분석하여 牛蒡子의 항 알레르기 반응을 관찰한 결과를 보고하는 바이다.
가설 설정
- 1. 등 부위의 atopy dermatitis-like skin lesions에 대한 牛蒡子의 치료 효과는 없었다.
제안 방법
- 2) DNFB에 의한 AD(Allergic Dermatitis)-like skin lesions 유발 후 군 실험동물은 아래와 같이 각각 5마리씩 3군으로 분류하였으며 각 군의 실험동물은 사료와 물을 충분히 공급하였다.
- 2주간의 연구에서 지속적으로 DNFB를 도포한 NC/Nga mice는 증상의 악화를 보였으며 이들을 다시 세군으로 나누어 대조군, 1주간 Dex군, 1주간 牛蒡子군 간의 AD-like skin lesions의 호전효과를 비교하였다. 그 결과 牛蒡子군에서는 대조군에 비하여 피부염 회복 효과가 거의 관찰되지 않았다(Fig.
- 牛芳子의 아토피피부염에 미치는 효능을 알아보고자 NC/Nga mice에게 DNFB를 2주간 지속적으로 처치하여 피부염을 유발시킨 후 NC/Nga mice의 등 부위 AD-like skin lesions의 호전효과, 소양감 반응, RT-PCR을 통한 IL-4와 IFN-γ 발현량을 비교 관찰 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 2의 경우는 dexamethasone (1mg/kg) 투여 전후 사진을 나타내는데 dexamethasone (1mg/kg) 투여 후의 경우가 투여 전에 비해서 가피 형성이나 표피박리 등에서 호전 양상을 보였으며 이는 牛芳子의 경우보다 AD-like skin lesions의 억제에 더 효과적이었던 것으로 생각된다. 牛蒡子가 AD-like skin lesions에 크게 효과적이지 못하였던 이유는 이 20는 7일 간격으로 5회에 걸쳐 DNFB를 처리하였으나 본 실험에서는 이나가끼25 등의 방법을 사용하여 1주간 3회에 거쳐 아토피를 유발하였다. 본 실험에서 나타난 결과는 DNFB의 용량과 도포횟수의 차이로 인하여 과도한 병변 유발이 일어났을 가능성이 있으며, 과도한 병변에 비해 적은 양의 우방자를 사용해서 cytokines들에서의 변화가 관찰되지 못했을 것으로 생각된다.
- 피부염 유발을 위한 DNFB 처리 2주 후, 육안으로 피부염을 확인하여 대조군을 제외한 두 군에는 각각 dexamethasone(1mg/kg), 牛蒡子(300mg/kg) 을 1주간 매일 1회 경구 투여하였다. 試藥의 용해를 위해 3차 증류수를 사용하였으며 100% 용해가 쉽지 않아 vortex를 사용하여 최대한 녹인 후 원심분리하여 상층액 만 경구투여 시켰다. 경구방법은 끝이 호스로 된 주사기를 사용하여 최대한 실험동물의 식도 끝부분까지 밀어 넣어 시약을 천천히 주입하였다.
- 쥐들이 야행성인 것을 감안하여 매일 오후 4시-6시 사이에 실시하였으며 한 마리당 10분씩 관찰하였다. 결과는 긁는 횟수와 긁을 때 사용하는 부위를 관찰하여 기록하였다. 긁는 기준은 2초 이상 긁어야 하며, 긁을 때 사용하는 부위는 크게 7부위로 관찰하였다.
- 결과는 긁는 횟수와 긁을 때 사용하는 부위를 관찰하여 기록하였다. 긁는 기준은 2초 이상 긁어야 하며, 긁을 때 사용하는 부위는 크게 7부위로 관찰하였다.
- 생후 11-20주령의 수컷 NC/Nga mice(대한바이오, Korea)를 온도가 25±1℃, 습도 50±10% 유지되는 동물 사육실에 두었으며 사료(PMI Nutrition, USA)와 물은 충분히 주었다. 밤과 낮 조절을 위해서 오전 8시에 조명을 켜서 오후 8시에 조명을 끄는 것을 원칙으로 삼았다. 무게는 약 30g 정도로 다른 mice들에 비해 IgE항체가 높은 수준을 유지하고 있어 쉽게 알레르기를 일으키고 피부병 유발이 용이하였다.
- . 본 실험에서는 牛芳子의 아토피피부염에 대한 효과를 관찰하기 위하여 NC/Nga mice를 이용하였으며 2주간의 실험에서 DNFB를 지속 도포한 NC/Nga mice는 AD-like skin lesions 증상을 악화시켰다. DNFB 도포와 함께 牛蒡子 (300mg/1kg)를 1주간 경구 투여한 NC/Nga mice에서는 AD-like skin lesions이 다소 억제되는 소견을 보이긴 하였지만(Fig.
- 실험동물들을 모두 희생시킨 후 등 피부 조직만을 잘라 RiboEx_columnTM Total RNA (Geneall, Korea)제품을 사용하여, 정해진 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리 후 전기영동을 통해서 RNA band를 확인하였고, spectrophotometer (Beckman, USA)를 사용하여 RNA 순도를 확인하고 정량하였다.
- cDNA 합성 및 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) 과정은 다음과 같다. 분리한 RNA의 cDNA 합성을 위해 Random primer (Invitrogen, USA), M-MLV Reverse Transcriptase (molony murine lukemia virus reverse transcriptase, Invitrogen, USA), 10mM dNTP (deoxy-nucleotide tri-phosphate, Takara, Japan), 100mM DTT (Invitrogen, USA), DEPC (diethyl pyrocarbonate, Invitrogen, USA)를 각 시간대 별, 같은 양으로 정량되어 있는 RNA 1㎕를 기준으로 전체 용량이 20㎕가 되도록 첨가하여 PCR 기기 (TP-600, Takara, Japan)에 넣고 37℃에서 1시간, 94℃에서 10분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성 후, IL-4와 IFN-γ primer를 이용하여 각 시간별로 RNA의 전사율을 비교하였다.
- 실험동물들을 모두 희생시킨 후 등 피부 조직만을 잘라 RiboEx_columnTM Total RNA (Geneall, Korea)제품을 사용하여, 정해진 방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리 후 전기영동을 통해서 RNA band를 확인하였고, spectrophotometer (Beckman, USA)를 사용하여 RNA 순도를 확인하고 정량하였다.
- 약물의 경구 투여와 동시에 세 군의 itching behavior를 1주 동안 관찰하였다. 쥐들이 야행성인 것을 감안하여 매일 오후 4시-6시 사이에 실시하였으며 한 마리당 10분씩 관찰하였다.
- NC/Nga mice는 무균상태에서 DNFB를 국부에 반복하여 도포하면 AD-like skin lesions을 나타내는 것으로 알려져 있다. 염증 유발의 전처리 과정으로 우선 acetone/DNFB 용액(DNFB 농도 0.15%) 100㎕를 1주간 3회(월, 수, 금), 1일 1회, NC/Nga mice의 배 부위에 도포해주었다. 전처리 과정을 마친 1주일 후 다시 acetone/DNFB 용액(DNFB 농도 0.
- 우방자는 알레르기 피부염의 주요 임상증상인 itching과 관련하여 유의한 감소효과가 나타나 알레르기 피부염의 치료약으로 사용할 수 있는 근거를 제시하였다. 그러나 이러한 감소효과와 관련된 기전에서 IL-4나 IFN-γ 와는 무관한 것으로 결과를 보였다.
- 이에 저자는 牛蒡子의 아토피피부염에 대한 효과를 관찰하기 위하여 NC/Nga mice에 DNFB 용액을 (Acetone/DNFB, DNFB 농도 0.15%) 처리하여 아토피 피부염을 유발 시킨 후 대조군과, Dexamethasone 투여 군과 우방자 투여군으로 나누어 itching behavior의 측정과 조직에서의 RNA 추출 및 RT-PCR 시행 후 IL-4 발현량과 IFN-# 발현량의 변하를 관찰하였다.
- 전사 율은 internal control인 β-actin의 전사 율을 기준으로 비교 하였으며 PCR의 조건은 94℃에서 5분간 전 변성작업 후, 94℃에서 45초간 변성시켰다.
- 15%) 100㎕를 1주간 3회(월, 수, 금), 1일 1회, NC/Nga mice의 배 부위에 도포해주었다. 전처리 과정을 마친 1주일 후 다시 acetone/DNFB 용액(DNFB 농도 0.15%) 50㎕를 1주간 3회(월, 수, 금), 1일 1회, NC/Nga mice의 등 부위에 발라주었다.
- 약물의 경구 투여와 동시에 세 군의 itching behavior를 1주 동안 관찰하였다. 쥐들이 야행성인 것을 감안하여 매일 오후 4시-6시 사이에 실시하였으며 한 마리당 10분씩 관찰하였다. 결과는 긁는 횟수와 긁을 때 사용하는 부위를 관찰하여 기록하였다.
- 피부염 유발을 위한 DNFB 처리 2주 후, 육안으로 피부염을 확인하여 대조군을 제외한 두 군에는 각각 dexamethasone(1mg/kg), 牛蒡子(300mg/kg) 을 1주간 매일 1회 경구 투여하였다. 試藥의 용해를 위해 3차 증류수를 사용하였으며 100% 용해가 쉽지 않아 vortex를 사용하여 최대한 녹인 후 원심분리하여 상층액 만 경구투여 시켰다.
- 합성 후, IL-4와 IFN-γ primer를 이용하여 각 시간별로 RNA의 전사 율을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 牛蒡子(Arctii Fructus: AF) 물 추출 건조 액스 분말은 Sun Ten Pharmaceutial (Taipei, Taiwan)에서 생산한 약재로 경희대학교 한의과대학 생리학 교실에서 제공받아 사용하였다.
- 생후 11-20주령의 수컷 NC/Nga mice(대한바이오, Korea)를 온도가 25±1℃, 습도 50±10% 유지되는 동물 사육실에 두었으며 사료(PMI Nutrition, USA)와 물은 충분히 주었다.
데이터처리
- 결과는 평균±SEM으로 나타내었고, Bonferroni's Multiple Comparison Test를 포함한 One way ANOVA test로 유의성을 측정하였다.
- 통계 분석은 GraphPad Prism 4 program (for windows)으로 수행하였으며, 통계적 유의성 차이는 Control과 비교하여 *; p< 0.05, **; p<0.01 로 정의하였다.
성능/효과
- 2. Itching behavior 검사에서 牛蒡子는 유의한 감소 효과가 관찰되었다.
- 3. 등 조직에서 RNA 추출 및 RT-PCR을 수행한 결과 牛蒡子의 IL-4 발현량에 대한 억제 효과가 관찰되지 않았다.
- 4. 등 조직에서 RNA 추출 및 RT-PCR을 수행한 결과 牛蒡子의 IFN-γ 발현량에 대한 억제 효과가 관찰되지 않았다.
- 본 실험에서는 牛芳子의 아토피피부염에 대한 효과를 관찰하기 위하여 NC/Nga mice를 이용하였으며 2주간의 실험에서 DNFB를 지속 도포한 NC/Nga mice는 AD-like skin lesions 증상을 악화시켰다. DNFB 도포와 함께 牛蒡子 (300mg/1kg)를 1주간 경구 투여한 NC/Nga mice에서는 AD-like skin lesions이 다소 억제되는 소견을 보이긴 하였지만(Fig. 3) 대조군(Fig. 1)과 비교하였을 경우 그 호전 정도에 큰 차이가 없었으므로 牛蒡子의 경구투여가 AD-like skin lesions에 유의한 결과는 나타나지 않았다. Fig.
- DNFB로 AD-like skin lesions을 유발시킨 Nc/Nga mice의 긁는 횟수를 대조군, dex군, 牛蒡子군에서 비교한 결과 긁는 횟수가 대조군에 비해 dex 군과 牛蒡子군에서 유의하게 감소한 것을 볼 수 있었다. 따라서 본 실험 결과는 DNFB로 AD-like skin lesions을 유발시킨 Nc/Nga mice에서 牛蒡子군의 경우 소양감이 대조군에 비해 50%정도 감소하였으며 이는 牛蒡子가 아토피 피부염의 특징적인 증상 중 하나이며 진단의 필수 요소인 소양감 억제에 유의한 효과를 보였음을 나타내준다.
- 2주간의 연구에서 지속적으로 DNFB를 도포한 NC/Nga mice는 증상의 악화를 보였으며 이들을 다시 세군으로 나누어 대조군, 1주간 Dex군, 1주간 牛蒡子군 간의 AD-like skin lesions의 호전효과를 비교하였다. 그 결과 牛蒡子군에서는 대조군에 비하여 피부염 회복 효과가 거의 관찰되지 않았다(Fig. 1-3).
- DNFB로 AD-like skin lesions을 유발시킨 Nc/Nga mice의 긁는 횟수를 대조군, dex군, 牛蒡子군에서 비교한 결과 긁는 횟수가 대조군에 비해 dex 군과 牛蒡子군에서 유의하게 감소한 것을 볼 수 있었다. 따라서 본 실험 결과는 DNFB로 AD-like skin lesions을 유발시킨 Nc/Nga mice에서 牛蒡子군의 경우 소양감이 대조군에 비해 50%정도 감소하였으며 이는 牛蒡子가 아토피 피부염의 특징적인 증상 중 하나이며 진단의 필수 요소인 소양감 억제에 유의한 효과를 보였음을 나타내준다.
- 또한 화학물질 접촉으로 인한 알레르기 반응과 같은 지연형 과민성 반응은 Th1형 세포가 주로 관여하며 본 실험에서 사용된 화학물질인 DNFB의 유발성 접촉성 피부염 반응은 T세포가 중개한 염증반응으로 Th1형 세포의 활성과 깊이 관련된 면역반응이므로 Th1형 cytokines인 IFN-γ 발현량의 감소는 DNFB 유발성 NC/Nga mice의 AD-like skin lesions의 억제효과를 나타내는 중요한 의미가 된다.
- 미리 제작되어 있는 IFN-γ를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 IFN-γ 발현량을 확인한 결과 Dex군, 牛蒡子군 모두에서 유의한 IFN-γ 발현량억제 효과가 관찰되지 않았다.
- 미리 제작되어있는 IL-4를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 IL-4 발현량을 확인한 결과 Dex군, 牛蒡子군 모두에서 대조군과 비교하여 IL-4 발현량의 억제 효과가 관찰되지 않았다.
- 에서 DNFB+CY 500mg/kg 처치군에서 IL-4발현량이 오히려 증가함으로 淸熱潤膚湯은 림프절에서 채취하여 활성화 시킨 IL-4의 발현량을 유의성 있게 억제하지 못하였다. 반면에 當歸飮子加味方과 外治方19에서 혈청에서 채취한 IL-4 발현량을 관찰하여 그 결과 유의성 있는 감소를 보였으며, 當歸飮子와 三黃洗劑加味方21의 실험에서도 혈청 IL-4 발현량을 관찰하여 유의성 있는 감소를 보였다.
- 牛蒡子 투여군에서 대조군에 비해 소양감이 50%가량 감소하여 소양감의 효과적인 억제를 나타냈는데 이는 牛蒡子가 아토피 피부염에 유의한 효과를 나타낸 것으로 생각된다. 반면에 소양감 반응을 관찰하는데 있어서 mice의 긁는 부위(입, 손, 발, 입/손, 입/발, 손/발, 입/손/발)에 따라 더 많은 부위를 동시다발적으로 사용하여 긁으면 그만큼 소양감이 심한 것으로 간주하고 세 그룹 간 긁을 때 사용하는 부위를 나누어 살펴 비교한 결과 상관관계가 없는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 본 실험에서 dexamethasone 투여군, 우방자 투여군과 대조군을 일주일 동안 소양감 반응(Itching behavior)을 비교 관찰한 결과 dexamethasone 투여군(p<0.01)과 牛蒡子 투여군(p<0.05)의 경우 대조군에 비해 유의한 감소 효과를 나타내었다(Fig. 4).
- 牛蒡子가 AD-like skin lesions에 크게 효과적이지 못하였던 이유는 이 20는 7일 간격으로 5회에 걸쳐 DNFB를 처리하였으나 본 실험에서는 이나가끼25 등의 방법을 사용하여 1주간 3회에 거쳐 아토피를 유발하였다. 본 실험에서 나타난 결과는 DNFB의 용량과 도포횟수의 차이로 인하여 과도한 병변 유발이 일어났을 가능성이 있으며, 과도한 병변에 비해 적은 양의 우방자를 사용해서 cytokines들에서의 변화가 관찰되지 못했을 것으로 생각된다. 따라서 우방자의 적절한 용량에 대한 연구가 더 필요하다고 하겠다.
- 이중 IL-4는 T세포, NK세포, 비만세포, 호염기구, 호산기구에서 분비되며, 알레르기에 매우 본질적인 역할을 하는 사이토카인으로 알레르기 반응의 유발, B세포의 분화와 증식, IgE의 생성 등에 관여하여 염증 반응 분비 물질로 천식 유발과 아토피 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다26. 본 연구에서는 쥐의 등에서 채취한 조직으로 RT-PCR을 수행한 결과 IL-4의 발현량은牛蒡子를 투여한 군, dexamethasone을 투여한 군, 대조군, 세 그룹 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 결과를 얻지 못하였다(Fig. 6).
- 유사 실험에서 IL-4 발현량을 관찰한 결과를 살펴보면 “淸熱潤膚湯이 DNFB로 유발된 알레르기 피부염에 미치는 효과”20에서 DNFB+CY 500mg/kg 처치군에서 IL-4발현량이 오히려 증가함으로 淸熱潤膚湯은 림프절에서 채취하여 활성화 시킨 IL-4의 발현량을 유의성 있게 억제하지 못하였다.
후속연구
- 그러나 앞서 언급하였듯이 case와 추적 관찰 기간이 짧았기 때문에 향후 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. DNFB 유발 염증의 다른 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 예상된다.
- 그러나 이러한 감소효과와 관련된 기전에서 IL-4나 IFN-γ 와는 무관한 것으로 결과를 보였다. 그러나 앞서 언급하였듯이 case와 추적 관찰 기간이 짧았기 때문에 향후 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. DNFB 유발 염증의 다른 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 예상된다.
- 본 연구에서는 쥐의 등에서 채취한 조직으로 RT-PCR을 수행한 결과 IFN-γ 의 발현량은 牛蒡子군, Dex군, 대조군, 세 그룹 모두에서 대조군에 비해 유의한 결과를 관찰하지 못하였다(Fig. 7).
- 우방자를 단독으로 사용하는 대신 다른 發散風熱之劑 혹은淸熱解毒之劑 등을 같이 써주었으면 더 효과적이었을 것으로 예상된다. 아울러 향후 연구에서는 더 많은 case와 장기간의 관찰을 필요로 할 것으로 생각된다.
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