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문제 정의
- 7 세포에서 NF-κB 억제를 통한 항염증 효과로 세포 사멸을 억제 한다10)는 보고가 있으나, 현재까지 동물 모델에서 현지초의 진통 및 항염증 연구가 수행된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 玄之草 물 추출물의 진통 및 항염증 효과를 실험적 연구를 통해 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서 GHE의 진통 및 항염증 효과를 ICR mouse에서 확인하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 본 연구에서는 GHE의 진통 및 항염증 효과를 알아보기 위해 여러 가지 통증 및 염증 동물 모델에서 실험을 진행하였다. 열 자극을 이용한 tail-flick 법과 화학적 자극을 사용한 writhing 법을 통하여 GHE의 진통효과를 측정하였으며 xylene을 사용한 귀 부종 유발 실험과 carrageenan 투여에 의한 족 부종 유발 실험을 통하여 항염증 효과를 확인하였다.
제안 방법
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 carrageenan을 이용해 항염증 효과를 확인하였다. 1% carrageenan을 좌측 후지 족 척에 투여하였으며 오른쪽 족척은 대조군으로 사용하기 위해 아무런 처치를 하지 않았다. Carrageenan 투여 1시간, 2시간, 3시간 후에 각 개체의 양쪽 족척 두께를 micrometer를 사용해 측정하였다.
- Xylene 처리 2시간 후 희생시켜 양쪽 귀를 절제하였다. 8 mm 직경의 콜크 보러(cork borer)를 사용해 절제한 귀 조직의 같은 부분을 동일한 크기로 절제하여 미량 저울을 통해 무게를 측정하였다15).
- 1% carrageenan을 좌측 후지 족 척에 투여하였으며 오른쪽 족척은 대조군으로 사용하기 위해 아무런 처치를 하지 않았다. Carrageenan 투여 1시간, 2시간, 3시간 후에 각 개체의 양쪽 족척 두께를 micrometer를 사용해 측정하였다. Carrageenan을 투여한 좌측 족척의 두 께를 carrageenan 처리를 하지 않은 우측 족척의 두께에 대한 백분율로 표시하였다16).
- ICR계 자성 mouse (35 ± 1 g)는 일정한 조건(온도: 22 ± 1℃, 습도: 55 ± 3%, 12시간 light/dark 주기)으로 7일간 적응시켰으며, 각 군당 5마리씩 사용하였다. GHE는 0.9% 생리식염수에 현탁하여 100 mg/kg, 1000 mg/kg로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로서 ibuprofen 50 mg/kg을 경구 투여하였다. 대조군은 0.
- ICR계 자성 mouse (35 ± 1 g)는 일정한 조건(온도: 22 ± 1℃, 습도: 55 ± 3%, 12시간 light/dark 주기)으로 7일간 적응시켰으며, 각 군당 5마리씩 사용하였다.
- Xylene은 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽에 각각 30 ㎕를 처리하였으며 왼쪽 귀는 대조군으로 사용하기 위해 xylene 대신 생리식염수를 같은 방법으로 처리하였다. Xylene 처리 2시간 후 희생시켜 양쪽 귀를 절제하였다. 8 mm 직경의 콜크 보러(cork borer)를 사용해 절제한 귀 조직의 같은 부분을 동일한 크기로 절제하여 미량 저울을 통해 무게를 측정하였다15).
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 xylene으로 염증을 유발하여 GHE의 항염증 효과를 확인하였다. Xylene은 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽에 각각 30 ㎕를 처리하였으며 왼쪽 귀는 대조군으로 사용하기 위해 xylene 대신 생리식염수를 같은 방법으로 처리하였다. Xylene 처리 2시간 후 희생시켜 양쪽 귀를 절제하였다.
- 1 ml 기준으로 복강투여하여 writhing syndrome을 유발하는 방법이다. 개별 케이지에서 10분 간 writhing syndrome 횟수를 측정하였다.
- 본 실험 결과 GHE가 농도 의존적으로 염증성 부종 억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig 3). 다음으로 carrageenan 투여를 통한 족척 부종 유발을 통해 GHE의 항염증 효과를 살펴보았다. Carrageenan은 histamine과 serotonin 분비를 촉진시켜 bradykinin의 양을 증가시키는 물질로, prostaglandin의 분비가 촉진되어 염증 반응 및 부종20)이 발생한다.
- 9% 생리식염수에 현탁하여 100 mg/kg, 1000 mg/kg로 경구 투여하였으며, 양성대조군으로서 ibuprofen 50 mg/kg을 경구 투여하였다. 대조군은 0.9% 생리식염수를 동일 용량으로 경구 투여하였다.
- 두 번째로 acetic acid에 의한 histamine, prostaglandin, bradykinin 등의 분비 촉진을 통해 통증을 유발시키는 writhing법을 사용해 GHE의 진통효과를 측정하였다18). 이 실험 결과 GHE 1000 mg/kg 투여 군이 양성대조약물에 비견되는 진통 효과를 나타내었다(Fig 2).
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 carrageenan을 이용해 항염증 효과를 확인하였다. 1% carrageenan을 좌측 후지 족 척에 투여하였으며 오른쪽 족척은 대조군으로 사용하기 위해 아무런 처치를 하지 않았다.
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 xylene으로 염증을 유발하여 GHE의 항염증 효과를 확인하였다. Xylene은 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽에 각각 30 ㎕를 처리하였으며 왼쪽 귀는 대조군으로 사용하기 위해 xylene 대신 생리식염수를 같은 방법으로 처리하였다.
- 본 연구에서는 GHE의 진통 및 항염증 효과를 알아보기 위해 여러 가지 통증 및 염증 동물 모델에서 실험을 진행하였다. 열 자극을 이용한 tail-flick 법과 화학적 자극을 사용한 writhing 법을 통하여 GHE의 진통효과를 측정하였으며 xylene을 사용한 귀 부종 유발 실험과 carrageenan 투여에 의한 족 부종 유발 실험을 통하여 항염증 효과를 확인하였다.
- 이상의 다양한 통증 및 염증 유발 실험에서 GHE의 진통 및 항염증 효과를 확인하였다.
- 본 실험에서 사용한 玄之草는 경북 봉화에서 재배된 것을 이용하였으며 정도약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 잡 질을 제거한 玄之草에 15배의 증류수를 가하여 2시간 동안 환류추출한 후 감압여과(Whatman No.2)하였다. 여과액을 -60℃ 이하에서 얼려 동결건조 하였고(FDU-550R; Eyela Co, Tokyo, Japan) 17.
- 첫 번째로 tail-flick법을 시행하여 진통효과를 측정하였으며 그 결과 GHE 1000 mg/kg을 투여 한 군에서 유의성 있는 결과를 확인하였다(Fig 1). Tail-flick 법은 약물의 통증 억제 가능성 확인을 위해 in vivo 모델에서 주로 사용되는 실험법으로, 감각수용기-감각신경-반사중추-운동신경-반응기의 5개 요소로 이루어지는 척수반사(spinal reflex) 억제효과를 측정하는 방법이다17).
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 玄之草는 경북 봉화에서 재배된 것을 이용하였으며 정도약업사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 잡 질을 제거한 玄之草에 15배의 증류수를 가하여 2시간 동안 환류추출한 후 감압여과(Whatman No.
- 실험동물 및 사료는 (주) 대한 바이오링크(Eumseong, Korea)에서 구입하여 사용하였다. ICR계 자성 mouse (35 ± 1 g)는 일정한 조건(온도: 22 ± 1℃, 습도: 55 ± 3%, 12시간 light/dark 주기)으로 7일간 적응시켰으며, 각 군당 5마리씩 사용하였다.
- 실험에 필요한 ibuprofen, acetic acid, carrageenan, xylene 등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 본 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구의 통계처리는 GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) 프로그램을 사용하였으며, one-way ANOVA (Dunnett's multiple comparison test)와 t-test (Mann-Whitney)를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 미만의 한계로 조사하였다.
이론/모형
- 조직 손상을 막기 위해 10초의 제한시간 (cut-off time)을 두었다11),12). 본 실험에서 측정 장치는 tail flick analgesia meter model 33 (IITC life science Inc, California, USA)을 사용하였다.
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 Whittle 방법13),14)에 준하여 진통효과를 측정하였다. Whittle방법은 1% acetic acid 생리식염수를 10 g당 0.
- 시료를 경구 투여하고 30분 뒤에 tail-flick 법을 이용해 진통효과를 측정하였다. Tail-flick법은 실험동물을 tail flick 측정 장치에 올려놓고 꼬리 말단에서 약 15 mm 되는 부위에 열 자극을 가해 실험동물이 꼬리를 회피 할 때까지의 시간을 측정하는 방법이다.
성능/효과
- 1. Tail-flick 법에 의한 진통효과 측정 결과 GHE 1000 mg/kg 단회투여가 척추 반사에 의한 통증을 억제함을 확인하였다.
- 2. Writhing 법에 의한 진통효과 측정에서 GHE 1000 mg/kg 단회투여가 통증에 의한 writhing syndrome을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
- 3. Xylene에 의한 염증 반응 실험에서 GHE 1000 mg/kg 단회투여가 염증에 의한 귀 부종을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
- 4. Carrageenan에 의한 염증 반응 실험에서 GHE 1000 mg/kg 단회투여가 염증에 의한 족척 부종을 억제하는 것을 확인하였다.
- GHE 100 mg/kg를 투여한 군은 부종 억제 양상은 나타내었으나 유의성 있는 결과를 보여주지 못하였지만 GHE 1000 mg/kg를 투여한 군은 13.78 ± 1.82% 증가하여 양성대조약물의 효과에 준하는 염증 억제 효과를 보여주었다.
- Ibuprofen 50 mg/kg를 투여한 군에서는 13.37 ± 6.04% 증가하였으며 GHE 100 mg/kg를 투여한 군은 24.84 ± 2.14% 증가하였고, GHE 1000 mg/kg를 투여한 군은 20.63 ± 3.23% 증가하여 GHE가 농도 의존적인 염증 억제효과를 나타내었다.
- 대조군은 xylene 처리 2시간 후 생리식염수를 처리한 왼쪽 귀에 비해 오른쪽 귀의 무게가 34.28 ± 4.75% 증가하였다.
- 대조군은 족척 두께가 carrageenan을 처리하지 않은 오른쪽 족척에 비해 20.06 ± 3.66%가 증가한 양상을 나타내었으며, 양성대조군인 ibuprofen 50 mg/kg를 투여한 군은 13.65 ± 1.78% 증가하였다.
- 하며, 이로 인해 혈류량의 증가 및 손상부위에서 neutrophils 등의 응집이 일어나 부종이 발생한다. 본 실험 결과 GHE가 농도 의존적으로 염증성 부종 억제 효과를 나타냄을 확인하였다 (Fig 3). 다음으로 carrageenan 투여를 통한 족척 부종 유발을 통해 GHE의 항염증 효과를 살펴보았다.
- Tail-flick 법은 약물의 통증 억제 가능성 확인을 위해 in vivo 모델에서 주로 사용되는 실험법으로, 감각수용기-감각신경-반사중추-운동신경-반응기의 5개 요소로 이루어지는 척수반사(spinal reflex) 억제효과를 측정하는 방법이다17). 본 실험 결과 GHE가 척수 반사궁에서 발생하는 통증 반응을 억제하는 작용이 있는 것으로 나타났다.
- 이와 더불어, 玄之草의 活血祛瘀하는 작용이 風 濕에 의해 발생한 凝血 또는 瘀血에 대해 효과를 나타내어 浮 腫 억제 효과를 나타내는 것으로 사료된다. 본 실험에서 실험적 지표를 통해 위와 같은 한의학적 이론에 근거한 玄之草의鎭痛 및 抗炎症 효과를 증명하였으며, 본초학적으로 祛風除濕하는 약재가 염증성 통증에 효과를 보일 수 있다는 이론24)과 活血祛瘀하는 약재가 通脈絡하여 浮腫을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다25). 본 결과를 종합하면 관절염, 통풍 등과 같은 염증 및 통증 질환에 GHE가 후보약물이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 양성대조약물군인 ibuprofen 50 mg/kg 군에서는 34.0 ± 2.53회의 writhing 하였으며, GHE 100 mg/kg 군에서는 진통효과가 나타나지 않은 반면 GHE 1000 mg/kg을 투여 받은 군은 36.0 ± 2.41회의 writhing을 나타내어 양성대조약물에 준하는 진통효과를 확인할 수 있었다.
- 07초 동안 발열부위에 꼬리를 위치하고 있었다. 양성대조약물인 ibuprofen 50 mg/kg과 GHE 100 mg/kg 투여군은 대조군에 비해 tail-flick time이 증가하여 진통 작용은 나타냈으나, 통계적인 유의성은 보이지 않았다. 반면, GHE 1000 mg/kg를 투여한 군은 대조군에 비해 증가된 6.
- Carrageenan은 histamine과 serotonin 분비를 촉진시켜 bradykinin의 양을 증가시키는 물질로, prostaglandin의 분비가 촉진되어 염증 반응 및 부종20)이 발생한다. 위 실험 결과 GHE 1000 mg/kg를 투여한 군에서 대조군에 비해 부종 발생이 억제됨을 확인하였다(Fig 4). 玄之草에 함유되어 있는 kaempferol 이 NF-κB 조절을 통한 항염증 효과가 보고되어 있고21), 상기 염증 모델에 공통적으로 관여하는 기전이 histamine과 bradykinin22) 분비에 의한 것이므로 GHE가 염증 반응을 일으키는 내분비 물질 분비 억제를 통해 항염증 효과를 가지는 것으로 생각된다.
- 이 실험 결과 GHE 1000 mg/kg 투여 군이 양성대조약물에 비견되는 진통 효과를 나타내었다(Fig 2). 위의 결과로 부터 GHE가 통각 신경 활동에 작용할 뿐만 아니라 통증 연관 내 분비 물질 분비 조절 작용에도 영향을 주어 진통 효과를 나타내는 것으로 유추할 수 있었다.
- . 이 실험 결과 GHE 1000 mg/kg 투여 군이 양성대조약물에 비견되는 진통 효과를 나타내었다(Fig 2). 위의 결과로 부터 GHE가 통각 신경 활동에 작용할 뿐만 아니라 통증 연관 내 분비 물질 분비 조절 작용에도 영향을 주어 진통 효과를 나타내는 것으로 유추할 수 있었다.
후속연구
- 玄之草에 함유되어 있는 kaempferol 이 NF-κB 조절을 통한 항염증 효과가 보고되어 있고21), 상기 염증 모델에 공통적으로 관여하는 기전이 histamine과 bradykinin22) 분비에 의한 것이므로 GHE가 염증 반응을 일으키는 내분비 물질 분비 억제를 통해 항염증 효과를 가지는 것으로 생각된다. GHE가 항염증효과를 나타내는 정확한 기전은 향후 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 실험적 지표를 통해 위와 같은 한의학적 이론에 근거한 玄之草의鎭痛 및 抗炎症 효과를 증명하였으며, 본초학적으로 祛風除濕하는 약재가 염증성 통증에 효과를 보일 수 있다는 이론24)과 活血祛瘀하는 약재가 通脈絡하여 浮腫을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다25). 본 결과를 종합하면 관절염, 통풍 등과 같은 염증 및 통증 질환에 GHE가 후보약물이 될 수 있을 것으로 사료된다.
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