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문제 정의
- 본 연구에서는 수질개선을 목적으로 조성된 자연정화시설에서 식물 및 미생물 등의 활동에 의해 수질이 정화되고 생태계에 안전한 방제수단으로 모기유충을 친환경적으로 방제할 수 있는지를 검토 하였다. 자연정화시설 내 모기유충의 발생양상을 조사하고, 국내 토양에서 분리한 신규 곤충병원성미생물인 B.
제안 방법
- 5 ml 튜브에 넣고, 2-mercaptoethnol이 포함된 buffer를 1:2 (w/w) 비율로 섞은 후 100℃에서 10분 동안 열처리하였다. 50V에서 전기영동 후, gel은 Coomassie brilliant blue 250으로 40분 동안 염색하였고, 12시간 탈색하여 결과를 확인하였다.
- Bt CAB199 균주의 Parasporal inclusion 단백질의 SDS-PAGE는 Laemmli의 방법을 수정하여 실험하였다(Laemmli, 1970). 균주들을 NA배지에 배양하여 위상차현미경으로 autolysis가 일어난 것을 확인한 후, 균을 모아 NaCl이 포함된 buffer를 넣어 10,000rpm에서 원심하여 일부 포자를 제거하고 parasporal inclusion을 얻었다.
- Bt CAB199의 효과적 사용하기 위하여 모기의 종과 유충의 영기에 따른 행동패턴에 나타나는 생태적 특성에 따라 효과적으로 방제할 수 있는 두 가지의 제형을 개발하였다. 행동패턴은 첫째 유충의 주요 분포하고 있는 위치를 시험하기 위하여 1L용량의 유리비이커에 습지물을 1L채운 후 각각의 비이커의 습지물에 1, 2, 3, 4령 유충을 무작위로 선발하여 각각 10마리씩 방사한 후 2시간 정도 적응하게한 다음, 시간대별로 수면층에 존재하는 모기유충의 비율과 수중에 존재하는 유충의 비율을 조사하였다.
- thuringiensis subsp. israelensis의 살충활성이 우수한 균주를 선발하고 대량 배양하여 습지에 적용할 수 있는 최적의 제형을 만들어 현장실험을 수행하였다.
- 국내에 서식하는 모기의 종에 따른 살충활성의 차이를 검토하기 위해 집모기 3종, 대전광역시 유성구 궁동에서 채집하여 실내에서 누대사육중인 지하집모기(Culex pipiens molestus)와 빨간집모기(Culex pipiens pallens), 충남 당진군 석문면 자연정화시설단지에서 채집한 이나도미집모기(Culex inatomii)와 서울대학교 농업생명과학대학에서 분양받아 실내사육중인 숲모기 1종인 이집트숲모기(Aedes aegypti)에 대해 Bt CAB199 균주의 최종 포자농도가 105cfu/ml로 처리하여 살충율을 조사하였다. 모든 실험은 500ml 유리비이커에 습지에서 채집한 물을 300 ml정도 채워 넣고, 각각의 비이커에 모기종별로 2령 유충을 30마리씩 넣고, 1일간 적응시킨 후 배양액을 동일한 농도로 처리하고 24시간과 48시간 후의 사망률을 조사하였다.
- Bt CAB199 균주의 Parasporal inclusion 단백질의 SDS-PAGE는 Laemmli의 방법을 수정하여 실험하였다(Laemmli, 1970). 균주들을 NA배지에 배양하여 위상차현미경으로 autolysis가 일어난 것을 확인한 후, 균을 모아 NaCl이 포함된 buffer를 넣어 10,000rpm에서 원심하여 일부 포자를 제거하고 parasporal inclusion을 얻었다. 12% separating gel과 5% stacking gel을 사용하였고, 각 균주의 parasporal inclusion을 1.
- CAB199균주의 살충활성을 나타내는 내독소단백질의 생성능력을 증가시키기 위해, 표 5에 제시한 배양조건과 배지조성에 따라 배양액을 확보하였다. 대량 배양한 배양액을 이용해 두 개의 제형, 즉 유효성분 10% 수화제와 50% 액상수화제로 제형화 하였다. 액상수화제는 50%의 유효성분에 습윤제 및 분산제로 Nonylphenol, ethoxylated monoether with sulfuric acid, sodium salt, sodium bis[20 ethylhexyl]sulfoccinate, polyoxyethylene nonylphenol이 사용되었으며, 수화제는 10%의 Bti에 흡습 제로 whitecarbon를 사용하였으며, 습윤제로 sodium bis[2-ethylhexyl] sulfosuccinate를, 분산제로 Lignosulfonic acid와 sodium salt를 표 6, 7과 같은 조성으로 제형화 하였다.
- 행동패턴은 첫째 유충의 주요 분포하고 있는 위치를 시험하기 위하여 1L용량의 유리비이커에 습지물을 1L채운 후 각각의 비이커의 습지물에 1, 2, 3, 4령 유충을 무작위로 선발하여 각각 10마리씩 방사한 후 2시간 정도 적응하게한 다음, 시간대별로 수면층에 존재하는 모기유충의 비율과 수중에 존재하는 유충의 비율을 조사하였다. 두 번째로 수면 위로 이동하는 횟수는 유충의 주요 분포위치 조사와 동일한 방법으로 수행하되 10분 동안 유충 10마리가 수면위로 올라오는 횟수를 측정하였다. 셋째로 모기유충의 수면위에 존재하고 있는 시간 측정도 위의 두 조사항목과 동일한 방법으로 수행하였으며, 정확한 행동분석모집단을 확보하기 위해 20마리의 유충이 수면에서 호흡하는 시간을 측정하였다.
- 또한 야외에서의 미생물제제의 제형에 따른 방제효과를 확인하기 위해, 당진 석문수질환경단지내 습지에서 처리전 모기유충의 밀도를 조사하고, 처리 후 매 1주일 간격으로 습지내 물 10L를 무작위로 채집하여 물속에 서식하고 있는 모기유충의 수를 측정하여 방제효과를 비교하였다.
- cfu/ml로 처리하여 살충율을 조사하였다. 모든 실험은 500ml 유리비이커에 습지에서 채집한 물을 300 ml정도 채워 넣고, 각각의 비이커에 모기종별로 2령 유충을 30마리씩 넣고, 1일간 적응시킨 후 배양액을 동일한 농도로 처리하고 24시간과 48시간 후의 사망률을 조사하였다. 매일 치어사료를 이용해 먹이를 공급해 주었으며, 먹이에 따른 수막이 생기는 것을 매일 제거해주었다.
- 물에서 서식하는 모기유충의 서식 습성에 의한 살충효과를 높이기 위하여 각각의 제형을 수면층위에서 확산과 분산성에 의하여 살충효과에 미치는 영향을 확인하였다. 알루미늄 사각용기(면적 896 cm2)에 습지에서 채집한 물 3.
- 이것은 기공주 위의 특수한 구조와 물의 장력에 의해 이루어지는데, 늪모기속(Mansonia)의 유충은 수서식물의 뿌리나 줄기에 호흡관을 찔러 넣어 식물로부터 산소를 얻는 것으로 보고되어 있다. 본 실험에서는 모기 종 및 영기에 따라 그들의 호흡시 수면으로 떠오르는 특이한 행동패턴에 대한 분석을 통해물 표면층에 오래 머물 수 있는 특수한 제형화을 만들어 방제효과의 극대화가 가능한지의 여부를 확인하고자, 이집트숲모기와 이나도미집모기 유충의 주요 분포위치와 수면 위로 이동하는 횟수, 수면위에 존재하는 시간을 측정하였다.
- 새로운 CAB199 균주의 제형화를 위해, (주)우진 B&G에서 대량배양하여 배양액을 만든 후 (주)경농 중앙연구소에서 수화제(wettable powder, WP)와 액상수화제(suspension concentrate, SC)로 형태로 제형화하였다(Table 5, 6).
- Obha박사에 의뢰하여 혈청형을 동정하였다. 새로운 곤충병원성미 생물 균주의 특성조사를 위해 포자형성기가 지난 포자와 내독소단백질 혼합물에서 이들의 형태를 위상차현미경(Olympus BX51)과 주사전자현미경(Philips XL30E SEM)을 이용하여 관찰하였다. 위상차현미경으로 관찰하기 위해 소량의 Bt CAB199 배양액을 slide glass에 떨어뜨린 후 1,000배로 관찰하였다.
- 두 번째로 수면 위로 이동하는 횟수는 유충의 주요 분포위치 조사와 동일한 방법으로 수행하되 10분 동안 유충 10마리가 수면위로 올라오는 횟수를 측정하였다. 셋째로 모기유충의 수면위에 존재하고 있는 시간 측정도 위의 두 조사항목과 동일한 방법으로 수행하였으며, 정확한 행동분석모집단을 확보하기 위해 20마리의 유충이 수면에서 호흡하는 시간을 측정하였다.
- 물에서 서식하는 모기유충의 서식 습성에 의한 살충효과를 높이기 위하여 각각의 제형을 수면층위에서 확산과 분산성에 의하여 살충효과에 미치는 영향을 확인하였다. 알루미늄 사각용기(면적 896 cm2)에 습지에서 채집한 물 3.5L를 채워놓고 2, 3, 4령 유충을 약 70마리씩 방사한 후 용기 가장자리에 제형별로 각각 처리하고 24, 48시간 후의 살충율을 조사하였다. 처리농도는 용기에 담긴 물 용량을 계산하여 최종농도 102과 103cfu/ml이 되도록 처리하였다.
- 새로운 곤충병원성미 생물 균주의 특성조사를 위해 포자형성기가 지난 포자와 내독소단백질 혼합물에서 이들의 형태를 위상차현미경(Olympus BX51)과 주사전자현미경(Philips XL30E SEM)을 이용하여 관찰하였다. 위상차현미경으로 관찰하기 위해 소량의 Bt CAB199 배양액을 slide glass에 떨어뜨린 후 1,000배로 관찰하였다. 주사전자현미경으로 관찰할 시료는 알루미늄 원반 시료대에 위에서 자연 건조시킨 후, 탄소로 coating하고 금으로 염색하여 10,000배로 관찰되었다(Kim et al.
- 제형에 따른 살충효과 및 방제효과를 확인하기 위해 Bt CAB199 균주를 대량 배양 할 수 있는 배양용 배지를 제공하였다. 이 균주의 배지조성은 일반적으로 Glucose 0.
- Bt CAB199의 효과적 사용하기 위하여 모기의 종과 유충의 영기에 따른 행동패턴에 나타나는 생태적 특성에 따라 효과적으로 방제할 수 있는 두 가지의 제형을 개발하였다. 행동패턴은 첫째 유충의 주요 분포하고 있는 위치를 시험하기 위하여 1L용량의 유리비이커에 습지물을 1L채운 후 각각의 비이커의 습지물에 1, 2, 3, 4령 유충을 무작위로 선발하여 각각 10마리씩 방사한 후 2시간 정도 적응하게한 다음, 시간대별로 수면층에 존재하는 모기유충의 비율과 수중에 존재하는 유충의 비율을 조사하였다. 두 번째로 수면 위로 이동하는 횟수는 유충의 주요 분포위치 조사와 동일한 방법으로 수행하되 10분 동안 유충 10마리가 수면위로 올라오는 횟수를 측정하였다.
대상 데이터
- 대량 배양한 배양액을 이용해 두 개의 제형, 즉 유효성분 10% 수화제와 50% 액상수화제로 제형화 하였다. 액상수화제는 50%의 유효성분에 습윤제 및 분산제로 Nonylphenol, ethoxylated monoether with sulfuric acid, sodium salt, sodium bis[20 ethylhexyl]sulfoccinate, polyoxyethylene nonylphenol이 사용되었으며, 수화제는 10%의 Bti에 흡습 제로 whitecarbon를 사용하였으며, 습윤제로 sodium bis[2-ethylhexyl] sulfosuccinate를, 분산제로 Lignosulfonic acid와 sodium salt를 표 6, 7과 같은 조성으로 제형화 하였다. 표 8에서 볼 수 있는 것 같이 제형의 종류에 따른 처리에서 살충율을 확인한 결과, 처리 후 1일차에서부터 수화제 형태의 기존 B제품 104cfu/ml농도는 96.
성능/효과
- israelensis로 동정되었으며, CAB199 균주를 NA배지에 27℃, 3∼4일 동안 배양하여 이들이 생성하는 parasporal inclusion을 위상차현미경과 주사전자현미경을 통해서 확인한 결과, spherical type의 parasporal inclusion을 형성하는 것을 확인하였다(Fig. 1).
- subsp. morrisoni PG-14, 그리고 모기유충 방제를 위해 제품화된 Bt product의 B.t.i 균주를 SDS-PAGE에서 130kDa, 70kDa, 28kDa의 사이의 주요 3종류의 단백질 밴드가 확인되었으며, 기준균주와 B.t.i.제품에서 분리한 균주와 유사한 단백질 밴드패턴을 나타내었다(Fig. 2)
- 국내에서 서식하는 몇 개의 모기종류에 따른 살충활성에 차이를 확인하기 위해 집모기인 지하집모기(Culex pipiens moletus), 빨간집모기(Culex pipiens pallens), 이나도미집모기(Culex inatomii) 등 3종류와 숲모기 1종인 이집트숲모기 (Aedes aegypti)에 대해 최종 포자농도 105cfu/ml농도로 처리하여 살충율을 조사한 결과, 실내시험에서는 4종 모두 100%의 살충율을 나타내었다. 따라서 습지내에 발생하는 다양한 모기종류의 유충을 방제하는데 이용할 가능성이 높음을 보여주었다.
- cfu/ml농도로 처리하여 살충율을 조사한 결과, 실내시험에서는 4종 모두 100%의 살충율을 나타내었다. 따라서 습지내에 발생하는 다양한 모기종류의 유충을 방제하는데 이용할 가능성이 높음을 보여주었다. 또한, 습지 내에 발생하는 모기유충을 효과적으로 방제하기 위한 적정 살포농도의 조사에서 농도별 살충활성을 확인한 결과, 이집트숲모기, 이나도미집모기 두 종 모두 104cfu/ml 농도부터 100%의 살충율을 보였는데 (Table 2), 습지나 방제대상구역의 면적 또는 물의 양을 추정하여 희석하여 104 농도 이하로 낮아지지 않게 처리함으로 방제효과를 높일 수 있을 것으로 보인다.
- 이는 처리 후 분산이 용이하게 이루어지지 못함으로 인해 방제효과가 감소한 것으로 여겨지며, 액상수화제제형의 CAB199은 처리 후 일자에 따른 차이가 거의 없는 것으로 보아, 처리 후 면적에 빠른 시간내에 고르게 분산된 것으로 보인다(Table 8). 또한 야외에서의 미생물제제의 제형에 따른 방제효과를 확인한 실험결과에서는, 액상수화제를 처리한 습지에서는 처리 후 밀도의 급격한 변화가 없이 습지내물 1L당 10~20 마리 유충의 밀도를 보였으나, 수화제 처리구 습지에서는 두 차례의 급격한 모기유충의 밀도 증가를 보여, 방제제의 습지내 전반적인 분산정도에 있어 차이를 보여 방제효과에 차이를 나타낸 것으로 여겨진다(Fig. 3).
- 또한, 습지 내에 발생하는 모기유충을 효과적으로 방제하기 위한 적정 살포농도의 조사에서 농도별 살충활성을 확인한 결과, 이집트숲모기, 이나도미집모기 두 종 모두 104cfu/ml 농도부터 100%의 살충율을 보였는데 (Table 2), 습지나 방제대상구역의 면적 또는 물의 양을 추정하여 희석하여 104 농도 이하로 낮아지지 않게 처리함으로 방제효과를 높일 수 있을 것으로 보인다.
- 모기종에 따른 행동패턴에 있어 차이를 확인하기 위해 이집트숲모기와 이나도미집모기 2령 유충을 이용해 위와 동일한 행동패턴실험을 수행하여 비교한 결과, 유충의 주요 분포위치는 역시 두 종 모두 수면위에 87.3과 100.0%로 주로 수면위에 위치하고 있었으며, 호흡을 위해 수면으로 이동하는 횟수에서는 이나도미집모기보다는 이집트숲모기가 더 빈번하게 이동하였으나, 두 종간에 통계적으로는 차이가 없는 것으로 확인되었다. 하지만, 수면 위에 존재하고 있는 시간을 측정한 결과에서는 이나도미집모기의 경우 조사한 개체 모두가 5분(300초)이상 존재하고 있었으며 이집트숲모기의 경우는 평균 21초 정도 수면에 존재하고 있어, 이나도미집모기 유충은 거의 수면위에 존재하고 있는 것으로 확인되었다(Table 4).
- 모기유충의 생물적 방제인자로서 활성을 갖는 새로운 Bt균주를 국내 토양으로부터 분리하였다. 분리한 Bt균주에서 spherical type의 내독소 결정성단백질을 생산하는 18개의 균주를 위상차현미경 검경 후 확인 선발하여 지하집모기에 선발된 18개 균주 중 CAB199 균주가 90%이상의 살충율을 나타내며 가장 높은 살충활성을 보여주었고, 대조균주로 사용된 B. thuringiensis subsp. israelensis와 B.
- i 제형에 따라 야외에서의 모기유충의 방제효과에 있어 차이를 나타내는지의 여부를 조사한 결과, 실내에서는 aqueous suspension(AS) 제형이 granular 제형보다 열대집모기 방제에 있어서는 효과적이라고 보고하였으나 야외에서는 두 제형간 방제효과에 있어 큰 차이를 보이진 않았다고 제시하고 있다. 우리 실험은 작은 면적에서 조차도 제형에 따른 방제효과의 차이는 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 제제의 습지 및 처리 공간 내에서의 분산이나 용해정도의 차이에 의해 살충효과에 차이를 보일 수 있음을 시사해준다. 실질적으로 이러한 문제를 해결하기 위해 일부 학자들은 Bti제제에 옥수수전분을 혼합하여 직경 약 2~6cm정도의 단단한 블록모양의 물에 뜨는 형태의 부리켓(Briquette)으로 제형화하여 입자가 서서히 방출되도록 하여 잔효기간을 늘리려는 연구도 수행된바 있다(Yu et al.
- 이집트숲모기 1, 2, 3, 4령 유충의 주요 분포위치와 수면위로 이동하는 횟수, 모기유충의 수면위에 존재하고 있는 시간을 측정한 결과, 1령보다는 2령, 3령 그리고 4령 유충이 수면위에 위치하는 경향을 보였으며, 노숙유충인 3, 4령유충이 어린유충보다 호흡을 위해 수면으로 이동하는 경향이 높았다. 하지만, 수면위에 존재하고 있는 시간을 측정한 결과, 영기에 따른 차이는 없는 것으로 나타났다(Table 3).
- 액상수화제는 50%의 유효성분에 습윤제 및 분산제로 Nonylphenol, ethoxylated monoether with sulfuric acid, sodium salt, sodium bis[20 ethylhexyl]sulfoccinate, polyoxyethylene nonylphenol이 사용되었으며, 수화제는 10%의 Bti에 흡습 제로 whitecarbon를 사용하였으며, 습윤제로 sodium bis[2-ethylhexyl] sulfosuccinate를, 분산제로 Lignosulfonic acid와 sodium salt를 표 6, 7과 같은 조성으로 제형화 하였다. 표 8에서 볼 수 있는 것 같이 제형의 종류에 따른 처리에서 살충율을 확인한 결과, 처리 후 1일차에서부터 수화제 형태의 기존 B제품 104cfu/ml농도는 96.3%로 새롭게 만들어진 액상수화제인 Bt CAB199 균주의 103cfu/ml, 104cfu/ml 농도처리에서 높은 사망률로 99.1%, 100.0%로 각각 나타내었다. 반면에 수화제 형태의 Bt CAB199 균주나 기존 Bt제품의 경우는 처리 후 1일차의 살충율이 동일 농도상에서 다소 낮게 나타남을 볼 수 있었다.
- 0%로 주로 수면위에 위치하고 있었으며, 호흡을 위해 수면으로 이동하는 횟수에서는 이나도미집모기보다는 이집트숲모기가 더 빈번하게 이동하였으나, 두 종간에 통계적으로는 차이가 없는 것으로 확인되었다. 하지만, 수면 위에 존재하고 있는 시간을 측정한 결과에서는 이나도미집모기의 경우 조사한 개체 모두가 5분(300초)이상 존재하고 있었으며 이집트숲모기의 경우는 평균 21초 정도 수면에 존재하고 있어, 이나도미집모기 유충은 거의 수면위에 존재하고 있는 것으로 확인되었다(Table 4). 위의 결과로 보아, 모기유충방제를 위해 곤충병원성미생물 제제를 살포시 수면에 좀 더장시간동안 부유하거나 잔류하고 있는 제형의 형태로 개발하여 사용하는 것이 모기유충과 제제와의 노출시간을 늘릴수 있으며 이에 따른 방제효과를 높일 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- (2000)의 연구결과에 의하면, 동일한 Bti 제형에 대해 방제대상 모기 종에 따른 살충율 뿐만 아니라 반수치사 농도 값도 다르게 나타난다고 하였는데, 열대집모기와 이집트숲모기에 비해 Anopheles stephensi모기에 대한 LC 50값이 높게 나타나고 살충활성도 다소 떨어진다고 보고하고 있다. 본 연구에서도 동일한 농도에서 이나도미집모기보다는 이집트숲모기에 대한 살충활성이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 방제대상 해충에 대한 정확한 실내살충활성검정 후 적정농도를 살포하는 것이 효과적인 방제결과를 얻을 수 있을 것이다.
- 하지만, 수면 위에 존재하고 있는 시간을 측정한 결과에서는 이나도미집모기의 경우 조사한 개체 모두가 5분(300초)이상 존재하고 있었으며 이집트숲모기의 경우는 평균 21초 정도 수면에 존재하고 있어, 이나도미집모기 유충은 거의 수면위에 존재하고 있는 것으로 확인되었다(Table 4). 위의 결과로 보아, 모기유충방제를 위해 곤충병원성미생물 제제를 살포시 수면에 좀 더장시간동안 부유하거나 잔류하고 있는 제형의 형태로 개발하여 사용하는 것이 모기유충과 제제와의 노출시간을 늘릴수 있으며 이에 따른 방제효과를 높일 수 있을 것으로 생각된다. 또한 노령유충으로 갈수록 수면 위에 존재하는 시간이 높았는데, 일반적으로 미생물제제에 의해 모기유충을 생물학적으로 방제할 때 주요 방제대상 영기가 2령, 3령 유충이라는 것을 고려해 볼 때, 효과적인 모기유충 방제에 있어 제제의 올바른 선택과 개발이 필수적이라 볼 수 있다.
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