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문제 정의
- 그러나 성게 생물검정에 대한 연구가 주로 미국에서 시행되었기 때문에, 주로 미국 연안의 종으로 국한되어 있다. 이에 본 연구에서는 주로 극동아시아 연안에 서식하는 북쪽말똥성게, Strongylocentrotus intermedius 종을 대상으로 하여, 각 화학물질이 성게의 발생이 미치는 영향을 조사하였다.
- 본 연구는 북쪽말똥성게를 이용한 해양독성 시험법을 체계적으로 개발하기 위한 연구의 한 과정으로 먼저 선행연구에서 최적의 발생조건에 대하여 조사하였고(Ryu et al., 2007), 그 조건을 바탕으로 우리주변의 환경시료나 산업폐수 속에 많이 존재하면서, USEPA에서 Priority pollutant로 규정되어 있는 중금속 중에서 구리, 아연, 은, 카드뮴, 크롬, 니켈을 북쪽말똥성게의 유생에 단기간 노출시켜 그 독성 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 실험실로 옮긴 성게 성체는 자연적인 산란을 억제하기 위하여 18℃로 유지하여 순치하였다. 준비된 성체로부터 알과 정자의 방출을 유도하기 위하여 0.5 M KCl 1 mL을 주입한 후 체내에 골고루 퍼지도록 흔들어주었다. 수컷은 생식공에서 방출된 흰색의 정자를 소형 원심분리용 튜브(1.
- 수정란은 125 μm의 망목의 나일론 망을 통과시켜 이물질과 비정상적인 난을 제거하고, 50 μm 망목의 나일론 망을 이용하여 약 7차례 정도 세척하여 정자 및 작은 이물질들, 그리고 크기가 작은 미성숙란을 제거하였다.
- 발생이 끝나면 10% 중성 포르말린 100 μL로 고정을 한 후, 현미경으로 관찰을 하였다.
- 5 mL)에 모아 냉장보관(4℃)을 하였다. 암컷은 생식공에서 노란색 알을 방출하므로 100 mL 비커에 여과해수를 가득 채운 뒤 생식공을 아래로 향하게 하여 올려놓아 방출된 알이 비커 바닥으로 가라앉게 하였다. 채집된 알과 정자는 혼합하여 약 20분간 방치함으로써, 수정을 유도하였다.
- 실험 원액들은 실험시작 하루 전에 중금속염을 3차 증류수로 녹여 준비하였다. 민감도 결정 실험(Definitive test, 이하 DF test) 농도구는 원액을 희석하여 결정된 농도보다 10배 더 높은 용액으로 준비하였고, 농도 구배는 1/2배 간격으로 희석하여 사용하였다. 각 실험간의 변이를 최소화하기 위하여 실험은 3번 반복하였다.
- 북쪽말똥성게 발생과정에 있어 영향을 보기 위하여 농도범위결정시험을 통하여 범위를 결정하였고, 결정된 범위에서 더 세분화하여 민감도 결정 실험을 하였다. 최적의 발생조건을 유지하기 위하여 발생온도는 15℃, 시간은 72 hr, 밀도는 100 cells/mL, 염분농도는 32 psu로 하였다(Ryu et al.
- 각각의 실험에서 여과해수로 대조실험을 실시 하였다. 대조구는 염분농도 변화에 대한 영향을 배제해 주기 위해 실험구와 같은 조건을 맞춰주기 위해 FSW 4.
- 비정상적인 유생에는 미수정난, 발생 과정이 늦어진 유생, 변형된 플루테우스 유생은 비정상 유생으로 분류하였으며, A자 형태의 모양을 하고 있었으며, 앞뒤에 각각 1쌍의 팔이 있는 것을 정상적인 플루테우스 유생으로 간주하였다. 정상적인 플루테우스 유생의 백분율로 계산된 발생률로 EC50을 계산 하였다. EC50은 정상적인 플루테우스 유생의 발생률을 백분율로 계산하여 산출하였다.
- 정상적인 플루테우스 유생의 백분율로 계산된 발생률로 EC50을 계산 하였다. EC50은 정상적인 플루테우스 유생의 발생률을 백분율로 계산하여 산출하였다. EC50은 TOXSTAT(Gulley and WEST Ind.
- 일반적으로 생물검정에 많이 이용되고 있는 생물종들의 발생률로 민감도 결과(Table 3)를 비교하였다. 먼저 각각의 생물종에 따라 발생시간이 다르다는 것을 알 수 있었다.
- 북쪽말똥성게와 가장 많이 연구되어 온 성게류에 대한 민감도를 구리노출에 따른 발생률 EC50값으로 비교해 보았다(Table 4). Diadema setosum, Lytechinus variegates와 민감도를 비교하였을 때, 실험결과와 거의 유사한 민감도를 보였다.
대상 데이터
- 실험생물인 북쪽말똥성게(S. intermedius)의 성체는 강원도 고성 앞바다 조하대에서 채집하였다. 실험실로 옮긴 성게 성체는 자연적인 산란을 억제하기 위하여 18℃로 유지하여 순치하였다.
- 실험에 사용된 중금속은 6종이며, 은(AgNO3, 99%), 카드뮴(CdCl2, 99%), 크롬(K2Cr2O7, 99%), 구리(CuCl2 ∙ 2H2O, 99%), 아연(ZnCl2, 98%) 그리고 니켈(NiCl2, 99%)을 사용하였다.
- , 99%)을 사용하였다. 모든 중금속들은 A.C.S. reagent grade였고, Aldrich사에서 구입하였다. 실험 원액들은 실험시작 하루 전에 중금속염을 3차 증류수로 녹여 준비하였다.
이론/모형
- EC50은 정상적인 플루테우스 유생의 발생률을 백분율로 계산하여 산출하였다. EC50은 TOXSTAT(Gulley and WEST Ind., 1996)프로그램의 Trimmed Spearman-Karber method (Hamilton et al., 1977)를 이용하여 계산하였다.
성능/효과
- 현재 ASTM, USEPA, OECD에서 생물검정용으로 사용되는 종은 Arbacia punctulata, Dendraster excentricus, Echinocardium cordatum, Lytechinus pictus, Strongylocentrotus droebachiensis, Strongylocentrotus purpuratus 6종이며(ASTM, 1995; USEPA, 1995; OECD, 1998), 이들 중 세 기관 모두에서 선정된 종은 A. punctulata, D. excentricus, S. purpuratus 세 종이다. 그러나 성게 생물검정에 대한 연구가 주로 미국에서 시행되었기 때문에, 주로 미국 연안의 종으로 국한되어 있다.
- 스포이드로 일정량을 취해 Sedgewick-Rafter Chamber (1 mL)에 옮긴 후, 최소 100개체를 개수하였다. 100개체 중 정상적으로 발생한 개체와 그렇지 못한 개체들을 구분하여 개수를 하였고, 결과는 전체 중 정상적인 플루테우스 유생과 비정상적인 유생의 비로 나타냈다. 비정상적인 유생에는 미수정난, 발생 과정이 늦어진 유생, 변형된 플루테우스 유생은 비정상 유생으로 분류하였으며, A자 형태의 모양을 하고 있었으며, 앞뒤에 각각 1쌍의 팔이 있는 것을 정상적인 플루테우스 유생으로 간주하였다.
- 대조구에서 수정률(mean±SD)은 첫번째 실험에서 93.3±1.4, 두번째 실험에서 93.9±1.5, 세번째 실험에서 94.2±2.0 μm이었다.
- 정상발생 비율을 계산한 결과에서 NOEC는 6.3 μg/L이었으며, 세 실험의 평균 EC50은 32.1±9.4μg/L였다.
- 실험 결과에서 계산된 NOEC는 10 μg/L, 세 실험의 평균 EC50은 25.6±3.5 μg/L로 나타났다.
- 300 μg/L 이상의 고농도에 노출된 시험군에서는 내장 기관이 밖으로 돌출된 형태인 exo-gastrula의 기형으로 발생되는 것이 관찰되었다.
- EC50값으로 민감도를 평가하면, 구리의 EC50은 25.63 μg/L로 성게 배아에 있어 가장 민감한 것으로 나타났다.
- 니켈은 1, 10, 100, 1,000 μg/L의 범위에서 3회 반복해서 실험을 하였고, 그 결과 정상발생 비율로 산출된 EC50값은 각각 29.3, 55.1, 32.3 μg/L였으며, 평균 38.9±14.1 μg/L였다.
- 정상발생 비율을 계산한 결과에서 NOEC는 93.8 μg/L 세 실험의 평균 EC50은 1,855±582 μg/L였다.
- 평균 EC50값 역시 5,000±1,700 μg/L로 가장 둔감한 것으로 나타났다.
- 1F). 또한 저농도에서 기형이라는 형태로 영향을 보여 EC50값이 낮았지만, 고농도에서도 치사율은 낮았다.
- 시험물질의 노출농도 범위에서 농도가 증가함에 따라 정상발생률은 급격하게 감소하는 경향을 나타내었다. EC50값으로 민감도를 평가하면, 구리의 EC50은 25.
- 값에서 차이를 보이는데, 이는 각 실험군이 서로 다른 성체를 이용하였기 때문에 나타나는 결과로 판단되었다. 이러한 차이 때문에 변동계수를 산출하였고, EC50값의 변동계수(Coefficient of Variation, CV) 범위는 약 13.7~45.8%였다(Table 2). 같은 성게종인 S.
- 이렇게 변동계수의 차이가 큰 이유는 각 실험별로 한 개체만을 사용했기 때문에 개체간 차이에 의해 일어나는 현상이라고 추정되었다. 따라서, 정자와 알을 여러 성체에서 얻은 후, 그것들을 혼합하여 사용하면 변동계수의 폭은 줄이고 보다 안정적인 결과를 얻을 수 있으리라 예상되었다.
- 일반적으로 생물검정에 많이 이용되고 있는 생물종들의 발생률로 민감도 결과(Table 3)를 비교하였다. 먼저 각각의 생물종에 따라 발생시간이 다르다는 것을 알 수 있었다. 북쪽말똥성게 배아의 구리에 대한 민감도는 이매패류인 Mytilus galloprovincialis, Mytilus edulis, Ruditapas docussatus보다는 덜 민감한 것으로 나타났다.
- 먼저 각각의 생물종에 따라 발생시간이 다르다는 것을 알 수 있었다. 북쪽말똥성게 배아의 구리에 대한 민감도는 이매패류인 Mytilus galloprovincialis, Mytilus edulis, Ruditapas docussatus보다는 덜 민감한 것으로 나타났다. 같은 이매패류인 Crassostrea gigas와는 비슷한 민감도를 나타내었고, 이매패류인 Crassostrea iradalei, 갑각류인 Scylla seratta, 멍게류인 Clona intestinals보다는 더 민감하였다.
- 북쪽말똥성게 배아의 구리에 대한 민감도는 이매패류인 Mytilus galloprovincialis, Mytilus edulis, Ruditapas docussatus보다는 덜 민감한 것으로 나타났다. 같은 이매패류인 Crassostrea gigas와는 비슷한 민감도를 나타내었고, 이매패류인 Crassostrea iradalei, 갑각류인 Scylla seratta, 멍게류인 Clona intestinals보다는 더 민감하였다.
- 북쪽말똥성게 배아와 같은 성게류인 A. punctulata와 민감도를 비교했을 때, 구리에 대해서는 비슷하였고, 나머지는 북쪽말똥성게 배아가 더 민감하다는 결과를 보였다. 반면 OECD나 ASTM에 모두 포함된 S.
- 하지만, 실험기간에 있어서 96시간보다 더 짧은 시간이 소요되는 장점을 가지고 있었다. 다른 종인 Paracentrotus lividus와 비교하면 아연과 크롬은 비슷한 민감도를 보였으나 카드뮴에 대해서는 둔감하였고, 나머지 중금속에 대해서는 더 민감하다는 것을 알 수 있었다.
- 값으로 비교해 보았다(Table 4). Diadema setosum, Lytechinus variegates와 민감도를 비교하였을 때, 실험결과와 거의 유사한 민감도를 보였다. 그리고, USEPA, ASTM에서 시험생물로 정해진 성게류와 비교했을 때 P.
- Diadema setosum, Lytechinus variegates와 민감도를 비교하였을 때, 실험결과와 거의 유사한 민감도를 보였다. 그리고, USEPA, ASTM에서 시험생물로 정해진 성게류와 비교했을 때 P. lividus보다는 더욱 민감한 것으로 나타났고, S. purpuratus보다는 둔감한 것으로 나타났다. 반면, A.
- droebachiensis와는 비슷한 민감도를 보였다(Table 4). 이상의 결과를 바탕으로 해양환경평가에서 북쪽말똥성게의 발생과정을 이용한 평가는 시험기간적인 측면이나 민감도에 있어서 검정생물로 충분히 대체 가능하다는 결론을 얻을 수 있었다.
- 정상발생 비율을 계산한 결과에서 NOEC는 10 μg/L, 세 실험의 평균 EC50은 49.3±22.6 μg/L였다.
- punctulata와 민감도를 비교했을 때, 구리에 대해서는 비슷하였고, 나머지는 북쪽말똥성게 배아가 더 민감하다는 결과를 보였다. 반면 OECD나 ASTM에 모두 포함된 S. purpuratus와 비교했을 때, 북쪽말똥성게 배아는 모든 중금속에 대해서 민감도 값이 떨어진다는 결과를 확인 할 수 있었다. 하지만, 실험기간에 있어서 96시간보다 더 짧은 시간이 소요되는 장점을 가지고 있었다.
후속연구
- 비록 USEPA, ASTM, OECD에서 제시하고 있는 생물과 비교했을 때 훨씬 민감한 종은 아니더라도 비슷한 민감도를 보였고, 물질에 대한 영향을 평가할 때 외국종이 아닌 국내종으로 평가할 수 있는 기초적인 자료를 확보했다는 것에 더 의미를 둘 수 있다고 판단된다. 더 나아가 국내산 성게를 이용하여 단순한 화학물질이 아니라 실질적인 해양환경에서 생물에게 미치는 환경오염물질의 영향에 대한 지침을 확립할 수 있을 것이고, 또한 앞으로 정부에서 해양환경을 보존하고 관리하는데 있어서 강력한 생물검정 도구로 사용할 수 있으리라 판단되었다.
- 비록 USEPA, ASTM, OECD에서 제시하고 있는 생물과 비교했을 때 훨씬 민감한 종은 아니더라도 비슷한 민감도를 보였고, 물질에 대한 영향을 평가할 때 외국종이 아닌 국내종으로 평가할 수 있는 기초적인 자료를 확보했다는 것에 더 의미를 둘 수 있다고 판단된다. 더 나아가 국내산 성게를 이용하여 단순한 화학물질이 아니라 실질적인 해양환경에서 생물에게 미치는 환경오염물질의 영향에 대한 지침을 확립할 수 있을 것이고, 또한 앞으로 정부에서 해양환경을 보존하고 관리하는데 있어서 강력한 생물검정 도구로 사용할 수 있으리라 판단되었다.
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