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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 성인 여성 환자에서 복부 지방 흡인술로 얻어진 지방조직에서 줄기세포를 분리, '배양하여 골 모세포로의 분화를 유도하고 BMP-2, alkaline phosphatase, cbfa-1, osteopontin 및 osteocalcin 등의 유전자 발현을 분석하였고 HA/TCP에 지방 줄기세포를 loading하여 nude mouse의 피하에 이식하여 5주 경과 후의 조직 학적소견을 관찰하여 골 형성 정도를 평가해 보아 골 결손부에서의 조직공학적 기법에의 적용이 가능한지 연구해보고자 하였다.,
- 본 연구에서는 구강내의 buccal fat pad와 같이 국소마취하에 용이하게 채취해서 사용이 가능한 지방조직 유래 줄기세포의 골모세포로의 분화가능성을 확인하고 지방조직 유래 줄기세포와 장골에서 추출한 골수 줄기세포를 osteogenic medium에서 배양하여 scaffold에 loading시키고 nude mouse의 subcutaneous pocket에 이식한 후골 형성 정도를 조직학적으로 비교 분석하여 골 조직공학에서 지방조직 유래 줄기세포가 골수 줄기세포의 대체 채취원으로서의 유용성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- Halvorsen 등의 방법에 의하여 줄기세포를 분리하는데 먼저 채취된 지방 조직을 Krebs-Ringer액으로 세척하고 collagenase를 이용하여 digestion을 시행하였다. 원심 분리를 시행하여 지방 조직과 혈관 조직을 분리하고 plastic adherence를 이용하여 단핵구 성분을 분리하였다. 분리된 세포를 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle s medium (DMEM) 을 maintenance medium으로 이용하여 culture expansion 을 시행하였다.
- 원심 분리를 시행하여 지방 조직과 혈관 조직을 분리하고 plastic adherence를 이용하여 단핵구 성분을 분리하였다. 분리된 세포를 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle s medium (DMEM) 을 maintenance medium으로 이용하여 culture expansion 을 시행하였다. 지방 줄기세포의 골모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 Ng/mL)와 100 mM ^-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하였다.
- 분리된 세포를 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle s medium (DMEM) 을 maintenance medium으로 이용하여 culture expansion 을 시행하였다. 지방 줄기세포의 골모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 Ng/mL)와 100 mM ^-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하였다. Osiris 사(Osiris Therapeutics, Inc, Baltimore, MD)에서 구입한 골수 줄기세포를 역시 같은 방법을 이용하여 배 양하고 골모세포로의 분화를 유도하였다.
- 지방 줄기세포의 골모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 Ng/mL)와 100 mM ^-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하였다. Osiris 사(Osiris Therapeutics, Inc, Baltimore, MD)에서 구입한 골수 줄기세포를 역시 같은 방법을 이용하여 배 양하고 골모세포로의 분화를 유도하였다.
- 줄기세포의 surface markei인 CD 105와 SCF-R의 발현을 분석하기 위하여 24 well plate에서 원형의 cover glass에서 80% confluent하게 배양된 지방 줄기세포를 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 glutaraldehyde 용액으로 실온에서 10분간 고정 후 PBS로 3회 세척하고 human IgG로 blocking을 시행하였다. 500 ul의 PBS에 10 ul의 fluorescein-conjugated anti-CD 105 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 투여하고 4"C에서 1시간 동안 부란한 뒤 슬라이드 글라스에 고정하여 형광현미경으로 관찰하였다.
- IgG로 blocking을 시행하였다. 500 ul의 PBS에 10 ul의 fluorescein-conjugated anti-CD 105 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 투여하고 4"C에서 1시간 동안 부란한 뒤 슬라이드 글라스에 고정하여 형광현미경으로 관찰하였다. SCF R의 발현은 anti human SCF R antibody (100 ug/ml, (R&D systems))를 1 차 항체로 사용하고 goat IgG의 rhodaminTabeled affinity purified antibody를 2차 항체로 사용하여 관찰하였다.
- 500 ul의 PBS에 10 ul의 fluorescein-conjugated anti-CD 105 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 투여하고 4"C에서 1시간 동안 부란한 뒤 슬라이드 글라스에 고정하여 형광현미경으로 관찰하였다. SCF R의 발현은 anti human SCF R antibody (100 ug/ml, (R&D systems))를 1 차 항체로 사용하고 goat IgG의 rhodaminTabeled affinity purified antibody를 2차 항체로 사용하여 관찰하였다.
- 지방 줄기세포와 골수 줄기세포를 10% FBS와 antibi- otics을 포함하는 DMEM을 maintenance medium으로 이용하여 culture expansion을 시행하였다. 골 모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 N dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 ㎍/mL)와 100 mM ^-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하였고 배양 7, 14, 21일에 배양세포를 0.
- 골 모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 N dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 ㎍/mL)와 100 mM ^-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하였고 배양 7, 14, 21일에 배양세포를 0.05% trypsin, 0.02% EDTA (Gibco)로 37℃에서 5분간 처리한 후 세포의 수를 hemocytometer를 이용하여 3회 반복하여 측정하였다.
- 24 well 배양용기에 줄기세포를 3주 동안 배양하고 7, 14, 21일에 cold PBS로 세포층을 2회 세척한 후 배양 세포층을 ACP mix (acetone:citrate solution:37% paraformaldehyde = 65: 25: 8)를 이용하여 고정하고 Sigma Diagnostics ALP staining kit를 이용하여 alka line phosphatase activity를 측정하였다. von Kossa staining은 역시 7, 14, 21일에 배양세포층을 실온에서 60 분간 4% parafbrmaldehyde로 고정하고 증류수로 세척한 후 빛을 차단한 상태로 1% (wt/vol) silver nitrite solu~ tiori에 30분간 고정하고 다시 몇 차례 증류수로 세척한 후 60분간 UV light를 조사하였다.
- phosphatase activity를 측정하였다. von Kossa staining은 역시 7, 14, 21일에 배양세포층을 실온에서 60 분간 4% parafbrmaldehyde로 고정하고 증류수로 세척한 후 빛을 차단한 상태로 1% (wt/vol) silver nitrite solu~ tiori에 30분간 고정하고 다시 몇 차례 증류수로 세척한 후 60분간 UV light를 조사하였다. 위와 같은 alkaline phos phatase staining과 von Kossa staining을 시행한 24 well plat쟌를 digital camera를 이용하여 촬영하고 염색 도를 Scionic PC image analysis software를 이용하여 분석하였다.
- von Kossa staining은 역시 7, 14, 21일에 배양세포층을 실온에서 60 분간 4% parafbrmaldehyde로 고정하고 증류수로 세척한 후 빛을 차단한 상태로 1% (wt/vol) silver nitrite solu~ tiori에 30분간 고정하고 다시 몇 차례 증류수로 세척한 후 60분간 UV light를 조사하였다. 위와 같은 alkaline phos phatase staining과 von Kossa staining을 시행한 24 well plat쟌를 digital camera를 이용하여 촬영하고 염색 도를 Scionic PC image analysis software를 이용하여 분석하였다.
- 세포배양 3, 7, 14, 21일에 RNA를 추출하여 BMP-2, osteopontin, osteocalcin, CbfaT과 ALP등의 골형성 관련 단백의 유전자 발현을 reverse transcription poly merase chain reaction (RT-PCR)을 이용하여 분석하였다. 모든 결과는 lactin과의 상대 비교를 시행하며 여기에 사용한 primer는 table 1 에 있다.
- 모든 결과는 lactin과의 상대 비교를 시행하며 여기에 사용한 primer는 table 1 에 있다. Tri-reagent (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)를 이용하여 Chomczynski와 Sacchi의 single-step method에 따라 total RNA를 추 줄하고 UV spectrophotometry (Phamacia, Gene Quant, LKB Biochrom, England)를 사용하여 농도를 측정하고 이중 3.5 ug으로 Superscriptreverse transcrip tase (LifeTechnologies, Inc., Gaithersburg, MD)와 oligo (dT)16 prims를 이용하여 first strand cDNA> 합성하였다. 100 M 용액을 제조하고 합성된 cDNA의 1/10 을 사용하여 PCR을 시행하였다.
- , Gaithersburg, MD)와 oligo (dT)16 prims를 이용하여 first strand cDNA> 합성하였다. 100 M 용액을 제조하고 합성된 cDNA의 1/10 을 사용하여 PCR을 시행하였다. BMP-2는 30 cycle (95 P 에서 1분간 d*i- enaturation 시행하고 cycle을 증가시키면서 95t)에서 45초, 60℃에서 45초, 7/C에서 2분간)을시행하고, /Retin은 40 cycle (94℃에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃게서 1분)을, osteopontin과 CbgaT은 40 cycle (94ti 에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 565C에서 1분, 72P에서 1분, osteocalcin-^ 40 cycle (94)0에서 3분간 초기 denatura tion, cycled 증가시키면서 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 7213에서 1분)의 조건으로 PCR을 시행하였다.
- BMP-2는 30 cycle (95 P 에서 1분간 d*i- enaturation 시행하고 cycle을 증가시키면서 95t)에서 45초, 60℃에서 45초, 7/C에서 2분간)을시행하고, /Retin은 40 cycle (94℃에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃게서 1분)을, osteopontin과 CbgaT은 40 cycle (94ti 에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 565C에서 1분, 72P에서 1분, osteocalcin-^ 40 cycle (94)0에서 3분간 초기 denatura tion, cycled 증가시키면서 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 7213에서 1분)의 조건으로 PCR을 시행하였다. 이중 HE 를 이용하여 ethidium bromide로 염색된 1, 5% agarose gel을 UV transillumination으로 관찰하고 digital cam™ era를 이 용하여 촬영하고 Scion image analysis software 를 이용하여 분석을 시행한다. β-actin에 대한 상대적인 irtensity를 구하여 R*CTR 결과를 분석하였다,
- 이중 HE 를 이용하여 ethidium bromide로 염색된 1, 5% agarose gel을 UV transillumination으로 관찰하고 digital cam™ era를 이 용하여 촬영하고 Scion image analysis software 를 이용하여 분석을 시행한다. β-actin에 대한 상대적인 irtensity를 구하여 R*CTR 결과를 분석하였다,
- 지 방 줄기세포와 골수 줄기세포를 osteogenic medium 을 투여하여 골모세포로의 분화를 유도하면서 3. 5, 7, 14, 21 일에 배양액을 추출하여 calcium 농도를 측정하였다.
- 골모세포로의 분화를 유도하면서 3. 5, 7, 14, 21 일에 배양액을 추출하여 calcium 농도를 측정하였다. 배양세포를 2회 PBS로 세척하고 4℃에서 0.
- 5, 7, 14, 21 일에 배양액을 추출하여 calcium 농도를 측정하였다. 배양세포를 2회 PBS로 세척하고 4℃에서 0.1N HC1 에 4시간 처리하고 원심분리를 시행하여 세포를 추출하고 Sigma calcium kit (Sigma-Aldrich) 를 이용하여 배양액으로부터 calcium의 농도를 3회 반복하여 측정하였다. Calcium의 농도는 전체 단백질 microgram 당 millimolar로 측정하였고 지방 줄기세포와 골수 줄기세포의 경우를 paired Student s t test를 사용하여 통계처리를 시행하였다.
- 본 연구에는 synthetic hydroxyapatite/tricalcium phosphate ceramic 60:40% (Zimmer. Warsaw, In) (HA/TCP 60:40)를 5 x 5 x 5 mm 크기의 블록 형태로 만들어 초음파 세척 후 250℃에서 4시간 동안 depyro- genation을 이용하여 소독을 시행하여 사용하였다.
- 5 X 1개의 지방 줄기세포를 투여 한 후 몇차례 뒤집어 가며 37X)에서 5시간동안 부란시킨다. 세포의 투여는 50 ml conical tube 와 3-way를 이용하여 suctiorr을 연결하여 음압을 가하며 지지체를 뒤집어 가며 투여하였다. 지방 줄기세포를 투여하지 않고 HA/TCP 만을 DMEM내에넣어 대조군으로 사용하였다 (N = 4).
- 세포의 투여는 50 ml conical tube 와 3-way를 이용하여 suctiorr을 연결하여 음압을 가하며 지지체를 뒤집어 가며 투여하였다. 지방 줄기세포를 투여하지 않고 HA/TCP 만을 DMEM내에넣어 대조군으로 사용하였다 (N = 4).
- paraformaldehyde0, ! 3시간 고정하고 탈회시킨 후 hematoxylin-eosin 염색을 시행하여 그 소견을 관찰하였다.
- 성인의 지방 조직에서 유래된 지방 줄기세포를 골 모세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 nM dexamethasone, ascorbate 2-phosphate (50 ug/mL)와 100 mM ^-glycerophosphate# 투여하여 28일간 배양하여 염색, RT-PCR, ALP 활성도, western blot analysis를 시행하여 분화 동안의 형태, 유전자 표현, 신호 전달 기전의 변화 양상을 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 24세 여자 환자의 동의 아래 복부 지방 흡인술을 통하여 채취된 복부 피하 지방 조직에서 줄기세포를 분리하였다. Halvorsen 등의 방법에 의하여 줄기세포를 분리하는데 먼저 채취된 지방 조직을 Krebs-Ringer액으로 세척하고 collagenase를 이용하여 digestion을 시행하였다.
데이터처리
- 1N HC1 에 4시간 처리하고 원심분리를 시행하여 세포를 추출하고 Sigma calcium kit (Sigma-Aldrich) 를 이용하여 배양액으로부터 calcium의 농도를 3회 반복하여 측정하였다. Calcium의 농도는 전체 단백질 microgram 당 millimolar로 측정하였고 지방 줄기세포와 골수 줄기세포의 경우를 paired Student s t test를 사용하여 통계처리를 시행하였다.
- 24 well plate에 3 x 1()4개의 줄기세포를 넣어 배양을 시행한 후 각 3, 5, 7, 14, 21일에 15 nM HEPES (pH 7.4)와 antibiotic을 포함하는 serum-free DMEM의 24 시간 conditioned medium을 이용하여 ELISA를 시행하여 mL 당 nanogram 단위로 3회 반복하여 측정하고 paired Student's t test를 사용하여 통계처리를 시행하였다.
이론/모형
- 분리하였다. Halvorsen 등의 방법에 의하여 줄기세포를 분리하는데 먼저 채취된 지방 조직을 Krebs-Ringer액으로 세척하고 collagenase를 이용하여 digestion을 시행하였다. 원심 분리를 시행하여 지방 조직과 혈관 조직을 분리하고 plastic adherence를 이용하여 단핵구 성분을 분리하였다.
- 지방 줄기세포를 osteogenic medium을 투여하여 골 모세포로의 분화를 유도한 군과 maintenance medium만을 사용하여 배양한 군 간의 osteocalcin의 차이를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbant assay) 를 이용하여 분석하였다. 24 well plate에 3 x 1()4개의 줄기세포를 넣어 배양을 시행한 후 각 3, 5, 7, 14, 21일에 15 nM HEPES (pH 7.
성능/효과
- 지방조직 유래 줄기세포를 분리, 배양한 결과, 줄기세포의 표지자로 알려진 CD 105, SCF R에서 염색을 확인하여 피하 지방 조직에서 Halvorsen등의 방법에 의하여 추출한 세포가 중간엽 줄기세포임을 확인하였다(Fig. 1).
- Proliferation assay 결과 골수 줄기세포와 지방조직 유래 줄기세포 모두에서 osteogenic medium 투여시 시간 경과에 따라 prolifbiation이 증가되는 양상이었고 특히 3주 소견에서 osteogenic medium 투여시 대조군에 비하여 세포의 수의 증가가 현저하였다(지방줄기세포: 대조군: 7.6 ± 0.8 X 105, OM: 11.8 ± 1.1 X 105, 골수줄기세포: 대조군: 7.8 ± 0.9 X 105, OM: 12.3 ± 0.7 105)(Fig. 2).
- 지방조직 유래 줄기세포를 배양하였을 때 ALP staining, von Kossa staing 모두에서 osteogenic medium을 넣었을 때 contr시의 경우보다 염색도가 증가되어 있는 것을 보여주고 있었다(Fig. 3). 골수 줄기세포와 지방조직 유래 줄기세포를 osteogenic medium을 넣어 배양하였을 때 시간 경과에 따른 ALP activity를 나타내는 결과로 시간 경과에 따라 ALP activity가 증가되는 양상이었었고 7일과 14일 소견에서 골수 줄기세포의 경우에 지방조직 유래 줄기세포보다 ALP가 현저하게 높게 발현되고 있었다(Fig.
- 3). 골수 줄기세포와 지방조직 유래 줄기세포를 osteogenic medium을 넣어 배양하였을 때 시간 경과에 따른 ALP activity를 나타내는 결과로 시간 경과에 따라 ALP activity가 증가되는 양상이었었고 7일과 14일 소견에서 골수 줄기세포의 경우에 지방조직 유래 줄기세포보다 ALP가 현저하게 높게 발현되고 있었다(Fig. 4).
- 골수 줄기세포와 지방조직 유래 줄기세포를 osteogenic medium을 투여하여 배양한 경우의 배양액에서의 칼슘 농도를 측정한 결과로 21일 소견에서 골수 줄기세포에서의 ca concentratiori이 지방조직 유래 줄기세포보다 높게 나타났지만 전반적으로 양측간에 큰 차이를 발견할 수 없었다 (Fig. 5).
- ELISA 를 이용하여 지방조직 유래 줄기세포의 osteocal cin 의 발현을 평가하였을 때 osteogenic medium을 넣어 배양하였을 때 osteocalcin의 발현이 높게 나타나고 있었다 (Fig. 6).
- 지방조직 유래 줄기세포에 osteogenic medium을 넣어 배양한 경우와 control medium만을 넣어 배양한 경우의 RT-PCR 결과로 BMP-2의 발현은 관찰되지 않았고 osteocalcin, osteopontin, cbfaT은 osteogenic medium 을 투여하였을 때 control에 비해 발현이 증가되어 있었고 alkaline phosphatase는 control 에서 발현이 증가되어 있는 양상이었다(Fig. 7).
- Mouse의 dorsal subcutaneous pocket에 이식된 scaf- fold의 조직소견에서 pore 내부에 woven bone의 형성이 관찰되고 있었으며 신생 혈관의 침투 및 dense connective tissue가 관찰되고 연골이나 지방조직의 형성은 관찰되지 않고 있었는데 지방줄기세포를 loading한 경우보다 골수줄기세포를 이용한 경우에 신생골 형성이 다소 우세한 것으로 보이고 있었다(Fig. 8).
- 또한 줄기세포의 분화 연구에서 transforming growth factor (TGF)-A tumor necrosis fector-«, interleukin (IL)-l, retinoic acid등의 물질들은 골모세포로의 분화를 촉진 시키고 지방세포 분화를 억제 하며, indomethacin, isobutyl-methylxanthin (IBMX), insulin, glucocor ticoids, thiazolidinediones (TZD) 등은 지방세포 분화를촉진시키고 골모세포로의 분화를 억제하는 것으로 알려지고 있다. 본 연구에서는 골형성 유도 배양액으로 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 10 N dexamethasone, ascorbate Aphosphase (50 恕/mL) 와 100 mM [但이yc『 erophosphate를 투여하여 배양을 시행하였으며 , 지방세포 유래 줄기세포의 골 세포의 분화능을 확인할 수 있는 ALP 염색 , von Kossa 염색 결과를 보면, 골 형성 유도 배양액을 넣고 28일간 배양한 결과, 시간이 경과함에 따라 염색 도가 현저히 증가됨을 확인하였다.
- OC의 경우에 있어서도 골형성 최종단계인 mineralization 시기뿐 아니라 초기 7일에서도 발현된다는 보고 등 다양한 보고 결과들로 미루어 보아 골형성 단계에서 발현되는 유전자에 대한 더 많은 연구가 필요하리라 사료된다. 본 연구에서 2주에서의 ALP staining이 양성으로 나타났고, osteo genic medium에서 3주 동안 배양한 훅 von Kossa stain ing 역시 같은 소견을 보여 Zuk 등의 연구에서와 동일한 결과를 보이고 있었다.
- 본 연구의 proliferation분석에서는 7, 14, 21일에서 골수 유래 줄기세포가 지방 유래 줄기세포보다 근소하나마 proliferation0] 증가되어 있고 ALP activity에서는 골수 유래 줄기세포가 지방 유래 줄기세포보다 특히 7일에서 통계학적으로 유의할 만한 차이를 보여주고 있어 지방 유래 줄기세포가 골 형성능에 있어 골수 유래 줄기세포보다 떨어짐을 나타내고 있었다. 그리고 Ca concentration assay에서도 미약하나마 골수 유래 줄기세포가 우위에 있어 in vit- ro에서 본 연구의 결과로 미루어보아 골수 유래 줄기세포의 대체 채취원으로서 지방 유래 줄기세포가 골수 줄기세포보다 골모세포로의 분화 및 골 형성능에 있어 약간 미흡함을 확인할 수 있었다.
- 나타내고 있었다. 그리고 Ca concentration assay에서도 미약하나마 골수 유래 줄기세포가 우위에 있어 in vit- ro에서 본 연구의 결과로 미루어보아 골수 유래 줄기세포의 대체 채취원으로서 지방 유래 줄기세포가 골수 줄기세포보다 골모세포로의 분화 및 골 형성능에 있어 약간 미흡함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Lee 등翻의 연구와는 상반되고 Im 등獭의 연구와는 비슷한 결과를 보여준다 할 수 있다.
- 1. 지방조직 유래 줄기세포는 osteogenic medium을 투여하면 골모세 포로 분화되고 시간 경과에 따라 miner- alization을 보였다.
- 2. 골기질 단백 관련 유전자 발현에서 OC, OP, Cbfa-1 등 골기질 유전자의 발현이 osteogenic medium을 투여한 경우 발현이 증가되어 있었다.
- 3. Osteogenic medium을 투여한 경우에 시간 경과에 따라 지방조직 유래 줄기세포는 Ca과 osteocalcin의 발현이 증가되어 있었다.
- 위의 연구 결과를 통하여, synthetic HA/TCP에 골수 줄기세포 및 지방 조직 유래 줄기세포를 loading하면 양호 한신 생골 형성을 보여 지방조직 유래 줄기세포가 조직공학적 기법을 이용한 골 결손부의 회복이나 골재생에 골수 줄기세포를 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 scaffold의 화학적 조성 및 그 형태에 따른 이식세포에 의한 신생골 형성에 대한 추가적인 연구 및 유전자 발현 비교 분석을 통하여 골재 생에 적용될 수 있는 조직공학적 기법의 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 줄기세포는 자가 증식력이 있고 장기간 배양에서도 생존하며 다양한 종류의 세포로 분화가 가능하다. 이와 같은 지방조직 유래 줄기세포는 용이하게 다량을 채취할 수 있어 줄기세포를 이용한 골 재생 등의 조직공학적 적용에 우수한 세포원으로 쓰일 수 있을 것으로 생각되는데 조직공학의 3대 요소인 세포, scaffold 및 신호물질의 상호 작용을 유도하고 이의 기전을 응용하기 위해서는 지방조직 기원 줄기세포의 골모세포로의 분화에 연관된 유전자 발현의 연구가 필요하리라 생각되며 일반적인 골조직 공학 기법의 적용에 널리 시도되고 있는 골수 줄기세포의 경우와 상호 비교, 분석이 필수적이라 사료된다.
- ") In vitro에서의 다른 연구에서와 마찬가지로 본 연구에서도 지방 유래 줄기세포를 osteogenic medium에 배양했을시 cbfa-1 과 OC, OP의 높은 발현을 보여 주었고 BMP-2는 osteogenic medium에서 배양했을 시와 대조군 모두에서 발현이 관찰돠지 않아 Zuk 등制의 연구와 동일하였다. 그러나 일반적으로 cbfa늬은 골모세포로의 분화 유도 초기에 발현되고 점차 발현이 감소되고 OC은 골모세포로의 분화 유도가 진행됨에 따라 증가되지만 본 연구의 결과에서는 cbfa-1 과 OC 의 발현이 비슷한 양상을 보이고 있어 알려진 것과는 다른 양상을 보이고 있어 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 1965년 Urist 등이 BMP가 골유도성을 가진다고 보고한 이후 가장 널리 연구된 골유도 인자 중의 하나인 BMP는 유전자 재조합 기술의 발달로 골유도능을 지닌 다양한 BMP의 생산이 가능하게 되었는데 재조합된 BMP 들은 줄기세포의 골모세포로의 분화에 작용하며 이의 역할이 보고되고 있다.
- 본 연구에서 특이할 만한 것은 imm- unohistochemistry에서 ALP의 발현은 관찰되지 않았고 오히려 osteogenic medium에서 배양하지 않은 대조군에서 발현이 나타났는데 이결과는 ALP staining에서 양성 인 것 과는 상반된 결과로서 소량의 유전자들을 증폭하는 과정에서 발생한 실험적인 오차가 아닐까 하는 생각이다. OC의 경우에 있어서도 골형성 최종단계인 mineralization 시기뿐 아니라 초기 7일에서도 발현된다는 보고 등 다양한 보고 결과들로 미루어 보아 골형성 단계에서 발현되는 유전자에 대한 더 많은 연구가 필요하리라 사료된다. 본 연구에서 2주에서의 ALP staining이 양성으로 나타났고, osteo genic medium에서 3주 동안 배양한 훅 von Kossa stain ing 역시 같은 소견을 보여 Zuk 등의 연구에서와 동일한 결과를 보이고 있었다.
- 많은 동물실험을 통한 골 재생 연구에서는 type 1 colla gen matrix gel, hyalouronic acid-based polymers, polylactide/polyglycolide sponge 그리고 hydroxyap- atite/tricalcium phosphate ceramic등의 다양한 scaffold 들이 사용되고 있는데 본 연구에서는 골 형성능이 뛰어난 것으로 알려진 HA/TCP를 scaffold로 사용하여 지방 유래 줄기세포와 골수 유래 줄기세포를 이식하고 5주후 조직학적 소견에서 미약하나마 골수 유래 줄기세포에서 더 많은 조직학적 골형성 소견을 보여주었는데 향후 in vivo에서 scaffold의 조성과 구조에 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과로 보아 synthetic HA/TCP 에 골수 줄기세포 및 지방조직 유래 줄기세포를 loading하면 양호한 신생 골 형성을 보여 지방 조직 유래 줄기세포가 조직공학적 기법을 이용한 골 결손부의 회복이나 골재생에 골수 줄기세포를 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 scaffold의 화학적 조성 및 그 형태에 따른 이식세포에 의한 신생골 형성에 대한 추가적인 연구 및 유전자 발현 비교 분석을 통하여 골재 생에 적용될 수 있는 조직공학적 기법의 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 대체할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 scaffold의 화학적 조성 및 그 형태에 따른 이식세포에 의한 신생골 형성에 대한 추가적인 연구 및 유전자 발현 비교 분석을 통하여 골재 생에 적용될 수 있는 조직공학적 기법의 개발에 도움이 될 수 있을 것으로 사료된다.
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