[논문]간헐적 침지 방식의 생물반응기 시스템을 이용한 유칼리 선발목 클론 대량증식

김선자; 박소영; 문흥규; 이위영

간헐적 침지 방식의 생물반응기 시스템을 이용한 유칼리 선발목 클론 대량증식
Use of the Temporary Immersion Bioreactor System for Mass Production of Eucalyptus pellita Plus Tree 원문보기

韓國林學會誌 = Journal of Korean Forest Society, v.99 no.1=no.188, 2010년, pp.125 - 130

김선자 (국립과천과학관) , 박소영 (국립산림과학원 산림생명공학과) , 문흥규 (국립산림과학원 산림생명공학과) , 이위영 (국립산림과학원 산림생명공학과)

초록
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식물대량증식에서 생물반응기의 이용은 규모를 대량화하고 자동화 할수 있다는 점에서 생산비를 절감할 수 있는 방법 중 하나이다. 본 연구에서는 유칼리 펠리타 선발목의 대량증식 체계를 확립하기 위해 4가지의 생물반응기 배양시스템에서 유칼리의 생장을 비교하였다. 배양기내에 지지물(net)을 설치하고 매 4시간마다 30분씩 액체배지를 공급한 TIN 배양(Temporary immersion with net)에서 식물체 생장이 가장 좋았다. TIN 시스템하에서 자란 식물체는 동일한 방식에 net가 없는 TIX 배양(Temporary immersion without net)에서 자란 식물체와 비교하여 초장이 3배 이상 증가하였다. 게다가 TIN 시스템에서 생산 된 식물체는 총 엽록소 함량, 엽록소 a/b, 그리고 건물중 등도 증가하였다. 위와 같은 결과는 기내 유칼리나무 생장에 중요한 요인이 식물체가 적당한 간격으로, 그리고 적당한 시간동안 배지에 노출되어야하고, net의 이용이 필수적임을 보여준다. TIN 시스템은 유칼리 클론묘의 대량생산을 위해 최적의 시스템으로 산업화를 위한 유칼리나무 대량생산시 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The application of bioreactor culture techniques for plant micropropagation is regarded as one of the ways to reduce production cost by scaling-up and automation. In an attempt to optimize mass proliferation systems in Eucalyptus pellita, four types of bioreator systems including temporary immersion system with or without net were tested. Highest growth was achieved with 30-min flushes of medium at every 4-h intervals in TIN (temporary immersion with net) system. Results indicate over three-fold increase in shoot growth with the TIN system when compared with TIX (control: temporary immersion without net) system which is without net in bioreactor. Furthermore, plants produced from the TIN system increased total chlorophyll content, chlorophyll a/b and dry matter, giving higher yields of acclimatized plants. Our findings suggest that plantlet growth increases with appropriate exposure to media at correct intervals, as well as use of net for maintaining aerobic condition in the vessels. The TIN system thus has great potential for in vitro mass production of Eucalyptus clones commercially.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구는 다양한 배양시스템의 생물반응기를 이용해 유칼리 펠리타를 배양하면서 배양 후 식물체 생장을 조사하고, 이와 관련된 여러 지표들을 분석하여 생물반응기에서 생장촉진에 영향을 미친 요인들을 해석하고자 하였다. 재료 및 방법
기내배양 중인 식물체는 잎이 작고 과습한 미세환경에서 생장한 탓에 일반공기중에 노출되면 쉽게 잎이 시들어 광합성을 측정하는 것은 매우 어렵다. 따라서 본 연구에서는 그러한 시스템하에서 생장한 식물체와 광합성을 설명하기 위해 배양기내 CO₂농도를 측정하여 간접적으로 배양기내 식물체의 광합성 정도를 조사하고자 하였다. 생물반응기 out-let 부분에 부착된 실리콘 튜브를 통해 배양 기내 공기를 채취하여 배양 1주 후부터 2주 간격으로 총 3회 CO₂를 채취, 분석하였다(Figure 4).
5배 이상, 신초생장 약 3배 증가하는 결과를 가져왔다. 본 연구에서는 net 유무, 배지공급 시간 등으로 생물반응기 배양방식을 달리하여 유칼리나무의 기내생장을 조사하였다.

제안 방법

CO2 농도는 생물반응기와 연결된 실리콘 튜브를 통해 내부공기를 3 mL씩 3반복으로 채취하여 gas chromatography(Trace Series, Thermo Electron Co., CA, USA) 를 이용하여 측정하였고, 이때 column은 Hayesep Q 80-100 column(4 m×3.18 mm×31 µm)을 사용하였고, detector 는 thermal conductivity detector를 사용해 230℃에서 검출하였다.
처리에 따라 net 설치가 필요한 배양시스템(TIN, CIN, TINC)을 위해서는 절편체가 액체배지에 침지되지 않도록 고압증기멸균이 가능한 플라스틱 net를 배양기 바닥에서 10 cm 높이로 설치하여 절편체가 net 위에서 자라게 하였다. 또한 간헐적으로 배지가 공급되는 배양시스템(TI, TIN, TINC)은 타이머(24시간)와 솔레노이드 밸브를 장착하여 4시에 한번씩 30분간(4회/1일) 배지를 공급하여 식물체가 배지에 접하도록 하였다.
또한 모든 처리에서 주입구(inlet)를 통해 필터(Mill-Seal, Millipore, Tokyo; pore size 0.5 µm)를 통과한 멸균 공기가 배양병내로 주입되게 하고 동시에 배출구(outlet)로 배양기내의 공기가 필터를 통해 빠져 나가도록 하였다.
배양은 광량 35-40µmol m⁻² s⁻¹ PPF(16h명/8h 암주기)와 24±1℃ 온도가 유지 되는 배양실에서 이루어졌다. 배양 5주 후 배양 시스템에 따라 생산된 식물체의 생체중, 건중, 엽록소와 카로티노이드 함량을 분석하였고 배양기간에 따라 배양기내 CO₂ 함량 변화를 분석하였다.
배양방식에 따라 생장한 식물체로부터 잎을 채취하여 엽록소 a, b와 카로티노이드 함량을 분석하였다(Figure 3). TIN에서 총 엽록소 함량(C_a+b)과 카로티노이드 함량이 가장 높았을 뿐만 아니라 광합성에 가장 유효한 엽록소 a/b 도 가장 높았다.
배양시스템이 생장에 미치는 영향을 구명하고자 Ebb & Flood 시스템이 가능하도록 7L 규모의 생물반응기를 주문제작하였다.
따라서 본 연구에서는 그러한 시스템하에서 생장한 식물체와 광합성을 설명하기 위해 배양기내 CO₂농도를 측정하여 간접적으로 배양기내 식물체의 광합성 정도를 조사하고자 하였다. 생물반응기 out-let 부분에 부착된 실리콘 튜브를 통해 배양 기내 공기를 채취하여 배양 1주 후부터 2주 간격으로 총 3회 CO₂를 채취, 분석하였다(Figure 4). 배양초기 각 배양 기내 CO₂ 함량은 950~1,000ppm으로 비슷하였다.
식물체의 엽록소 함량 측정을 위해 각 처리에서 자란 유 칼리에서 잎(생체중 0.5 g)을 채취하여 80% (v/v) 아세톤에 48시간 침지하여 엽록소를 추출하였다. 흡광도는 663.
우리는 이전 보고에서 생물반응기를 이용한 유칼리나무 펠리타 선발목의 기내 대량증식을 체계화하고자 1L 규모로 액체배양을 실시하였고, 이를 토대로 배양규모를 10L 로 확대하여 대량배양 가능성을 조사하였다. 그 결과 기존의 고체배양법에 비해 생물반응기를 이용한 액체배양에서 유칼리나무 생장이 월등히 증가하였다(Park 등, 2008).
처리에 따라 net 설치가 필요한 배양시스템(TIN, CIN, TINC)을 위해서는 절편체가 액체배지에 침지되지 않도록 고압증기멸균이 가능한 플라스틱 net를 배양기 바닥에서 10 cm 높이로 설치하여 절편체가 net 위에서 자라게 하였다. 또한 간헐적으로 배지가 공급되는 배양시스템(TI, TIN, TINC)은 타이머(24시간)와 솔레노이드 밸브를 장착하여 4시에 한번씩 30분간(4회/1일) 배지를 공급하여 식물체가 배지에 접하도록 하였다.

대상 데이터

Moon 등(2003)의 방법에 따라 재료를 표면살균하여 DKW 배지(Driver와 Kuniyuki, 1984)에 배양한 다음 배양 8주 후 무균묘를 얻었다. 신초를 BA가 0.1 mg/L 첨가 된 DKW 배지에서 4주 간격으로 반복적으로 2년간 계대배양하여 본 실험을 위한 재료로 이용하였다.
인도네시아 깔리만탄 지역의 코린도 조림지에서 선발된 유칼리 펠리타 선발목의 삽수를 국립산림과학원 산림 생명공학과 온실에서 삽목, 재배하였다. Moon 등(2003)의 방법에 따라 재료를 표면살균하여 DKW 배지(Driver와 Kuniyuki, 1984)에 배양한 다음 배양 8주 후 무균묘를 얻었다.

이론/모형

인도네시아 깔리만탄 지역의 코린도 조림지에서 선발된 유칼리 펠리타 선발목의 삽수를 국립산림과학원 산림 생명공학과 온실에서 삽목, 재배하였다. Moon 등(2003)의 방법에 따라 재료를 표면살균하여 DKW 배지(Driver와 Kuniyuki, 1984)에 배양한 다음 배양 8주 후 무균묘를 얻었다. 신초를 BA가 0.
5 g)을 채취하여 80% (v/v) 아세톤에 48시간 침지하여 엽록소를 추출하였다. 흡광도는 663.2와 646.8, 그리고 470 nm에서 각각 측정한 다음 Lichtenthaler(1987)의 방법에 따라 계산하였다.

성능/효과

배양방식에 따라 생장한 식물체로부터 잎을 채취하여 엽록소 a, b와 카로티노이드 함량을 분석하였다(Figure 3). TIN에서 총 엽록소 함량(C_a+b)과 카로티노이드 함량이 가장 높았을 뿐만 아니라 광합성에 가장 유효한 엽록소 a/b 도 가장 높았다. 엽록소 함량과 함께 TIN 배양 시스템하에서 생장한 식물체의 건물율도 가장 높았다는 것은 TIN 시스템하에서 생장한 식물체가 활발한 광합성을 하고 있다는 간접적인 결과라고 하겠다.
TIN에서 총 엽록소 함량(C_a+b)과 카로티노이드 함량이 가장 높았을 뿐만 아니라 광합성에 가장 유효한 엽록소 a/b 도 가장 높았다. 엽록소 함량과 함께 TIN 배양 시스템하에서 생장한 식물체의 건물율도 가장 높았다는 것은 TIN 시스템하에서 생장한 식물체가 활발한 광합성을 하고 있다는 간접적인 결과라고 하겠다.
배양초기에 TIN, 후기에 CIN으로 변경한 TINC 배양에서도유칼리 생육은 TIN보다 다소 저조하였다. 위의 결과로 미루어 유칼리 펠리타는 기내배양시 과습에 다소 약한 것으로 생각되고 따라서 전 배양기간 중 계속 강제환기를 하면서 간헐적으로 배지에 접하게 하는 것이 최적의 배양방식으로 판단된다.
Net 방식 중에서도 식물체가 얼마나 배지에 오랫동안, 얼마나 자주 접하는지가 시스템 효율을 결정짓는 가장 중요한 요인이다(McAlister 등, 2005). 이는 식물 종에 따라 다른데 본 실험결과에 따르면 유칼리나무는 지속적으로 배지에 접하게 한 CIN 배양보다는 1일 4회 30분 동안 배지에 접하게 한 TIN 시스템에서 생육이 가장 좋았다. 배양초기에 TIN, 후기에 CIN으로 변경한 TINC 배양에서도유칼리 생육은 TIN보다 다소 저조하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	생물반응기를 이용한 액체배양 방법은 기존 고체배양 방법과 비교했을 때 어떤 장점을 가지고 있을까?	생물반응기를 이용한 액체배양은 기존의 고체배양에 비해 배양규모를 쉽게 늘릴 수 있다(scale-up)는 점에서 무한한 가능성을 가지고 있다. 최근 생물반응기를 이용해 수백 개의 무균 절편체를 일시에 배양하는 대량배양 시스템 (large-scale culture system)이 보고되었다(Hahn과 Paek, 2005; Piao 등, 2003; Shohael 등, 2005).
	본 연구에서 적용한 배양시스템은 무엇이 있는가?	배양시스템이 생장에 미치는 영향을 구명하고자 Ebb & Flood 시스템이 가능하도록 7L 규모의 생물반응기를 주문제작하였다. 실험을 위해 적용된 배양시스템은 다음의 4가지이다: 1) TIX(Temporary immersion without net) -절편체를 간헐적으로 액체배지에 잠기게 하는 방법(30분/4시간, 1일 4회), 2) TIN(Temporary immersion with net) - net 위에 치상된 절편체를 간헐적으로 액체배지에 접하는 방법(30분/4시간, 1일 4회), 3) CIN(Continuous immersion with net) - net 위에 치상 된 절편체를 계속 액체배지에 접하게 하는 방법, 4) TINC(Temporary immersion with net following continuous immersion with net) - net 위에 치상 된 절편체를 간헐적(30분/4시간)으로 액체배지에 접하게 한 다음 배양 2주 후 계속 액체배지를 공급하는 방법.
	열대조림의 중요성이 증가한 이유는 무엇인가?	최근 기후변화에 따라 탄소배출권을 확보하고 안정적인 목재생산량을 확보하기위해서 인도네시아를 중심으로 한 열대조림의 중요성이 증가하고 있다. 그 일환으로 우수한 형질을 가진 열대 선발목의 클론증식에 대한 관심 또한 날로 증대되고 있다(Park 등, 2008).

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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