생물반응기 내 침지시간에 따른 백합나무 체세포배 발아 및 생화학적 변화 Somatic Embryo Germination and the Related Biochemical Changes of Liriodendron tulipifera by Bioreactor Immersion Time원문보기
본 연구는 백합나무의 효율적인 기내번식법 개발을 위하여 temporary immersion 방식의 생물반응기(TIB)를 이용한 체세포배 발아에 미치는 몇 가지 요인을 구명하고자 실시하였다. 사용된 생물반응기는 간헐적으로 배지가 식물체에 접촉되도록 설계되어 배지의 침지시간을 임의로 조절하였다. 본 방식을 통한 백합나무 체세포배 발아율은 배지의 침지시간이 상대적으로 길었던 매 4시간 마다 120분씩 침지시킨 처리구와 매 4시간 마다 60분씩 침지시킨 처리구에서 높게 나타났다(각각 91.64%, 85.67%). 하지만 식물체의 과수화 비율은 침지시간이 상대적으로 짧았던 매 6시간 마다 15분씩 침지시킨 처리구와 상대적으로 길었던 매 4시간 마다 120분씩 침지시킨 처리구에서 높게 나타났다(각각 51.61%, 34.28%). 매 4시간 마다 60분씩 배지를 침지시킨 처리구에서 과수화된 식물체가 가장 적게 나타났으며, abscisic acid (ABA), superoxide dismutase (SOD) 및 catalase의 함량이 가장 적은 것으로 나타났다. 본 실험에서 생물반응기내 배지 침지 시간은 체세포배 발아시 스트레스 요소로서 작용하여 발아 및 식물체 생장의 차이를 보여주었다. 이상의 결과는 TIB방식의 생물반응기를 통해 백합나무의 효율적인 발아가 가능함을 보여주었다.
본 연구는 백합나무의 효율적인 기내번식법 개발을 위하여 temporary immersion 방식의 생물반응기(TIB)를 이용한 체세포배 발아에 미치는 몇 가지 요인을 구명하고자 실시하였다. 사용된 생물반응기는 간헐적으로 배지가 식물체에 접촉되도록 설계되어 배지의 침지시간을 임의로 조절하였다. 본 방식을 통한 백합나무 체세포배 발아율은 배지의 침지시간이 상대적으로 길었던 매 4시간 마다 120분씩 침지시킨 처리구와 매 4시간 마다 60분씩 침지시킨 처리구에서 높게 나타났다(각각 91.64%, 85.67%). 하지만 식물체의 과수화 비율은 침지시간이 상대적으로 짧았던 매 6시간 마다 15분씩 침지시킨 처리구와 상대적으로 길었던 매 4시간 마다 120분씩 침지시킨 처리구에서 높게 나타났다(각각 51.61%, 34.28%). 매 4시간 마다 60분씩 배지를 침지시킨 처리구에서 과수화된 식물체가 가장 적게 나타났으며, abscisic acid (ABA), superoxide dismutase (SOD) 및 catalase의 함량이 가장 적은 것으로 나타났다. 본 실험에서 생물반응기내 배지 침지 시간은 체세포배 발아시 스트레스 요소로서 작용하여 발아 및 식물체 생장의 차이를 보여주었다. 이상의 결과는 TIB방식의 생물반응기를 통해 백합나무의 효율적인 발아가 가능함을 보여주었다.
To determine physical and physiological factors for Liriodendron tulipifera L. somatic embryo germination, temporary immersion bioreactor (TIB) system was investigated. It was designed to immerse liquid media with plantlets so that it was able to adjust the immersion time. Immersion of 120 minutes e...
To determine physical and physiological factors for Liriodendron tulipifera L. somatic embryo germination, temporary immersion bioreactor (TIB) system was investigated. It was designed to immerse liquid media with plantlets so that it was able to adjust the immersion time. Immersion of 120 minutes every 4 hours and 60 minutes every 4 hours was found to be effective in germination (91.64%, 85.67%, respectively). However, hyperhydricity of the plantlets was higher in short immersion time (15 minutes every 6 hours) and long immersion time (120 minutes every 4 hours) (51.61%, 34.28%, respectively). Immersion of 60 minutes every 4 hours showed the lowest hyperhydric plantlets, and also it showed the lowest activities of abscisic acid (ABA), superoxide dismutase (SOD), and catalase. The overall results implied that immersion time of media affected germination and growth of somatic embryo, and it was able to make use of germination and growth of L. tulipifera somatic embryos.
To determine physical and physiological factors for Liriodendron tulipifera L. somatic embryo germination, temporary immersion bioreactor (TIB) system was investigated. It was designed to immerse liquid media with plantlets so that it was able to adjust the immersion time. Immersion of 120 minutes every 4 hours and 60 minutes every 4 hours was found to be effective in germination (91.64%, 85.67%, respectively). However, hyperhydricity of the plantlets was higher in short immersion time (15 minutes every 6 hours) and long immersion time (120 minutes every 4 hours) (51.61%, 34.28%, respectively). Immersion of 60 minutes every 4 hours showed the lowest hyperhydric plantlets, and also it showed the lowest activities of abscisic acid (ABA), superoxide dismutase (SOD), and catalase. The overall results implied that immersion time of media affected germination and growth of somatic embryo, and it was able to make use of germination and growth of L. tulipifera somatic embryos.
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문제 정의
본 실험에서는 체세포배 발아 및 식물체 생장에서 액체배지의 침지시간을 조절함에 따라 형태적 및 생리적인 영향을 살펴보고자 하였다.
본 연구에서는 백합나무 체세포배를 순간침지 방식의 생물반응기를 이용하여 체세포배의 효율적인 발아 및 효율적인 건전묘 생산을 위한 침지시간을 구명하고, 이에 수반되는 내생 abscisic acid 함량 변화 및 항산화효소 활성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
체세포배의 배양 밀도는 6 g L−1로 접종하였다. TIB에서 총 14일간 배양 후 발아율, 식물체 길이, 생중량 및 과수화의 정도를 조사하였다. 과수화빈도(%)는 총 식물체 중에서 잎 혹은 줄기가 비정상적으로 비대하거나 뒤틀린 과수화된 식물체의 비율로 나타내었다.
catalase 활성 분석을 위하여 효소 추출액 30 µL와 10 mM H2O2 500 µL를 혼합하여 1분간 실온에서 반응시킨 후, 500 sodium azide로 반응을 멈추고 다시 반응액 20 µL와 HRP/Chromogen 2 mL를 첨가하고 10분 후에 520 nm에서 흡광도를 측정하였다(Fossati et al., 1980).
체세포배의 발아는 LM배지에 sucrose 2% (w/v)를 첨가한 액체배지 1 L를 A) 6시간 마다 15분, B) 6시간 마다 30분, C) 4시간 마다 60분, D) 4시간 마다 120분, E) 6시간 마다 30분간 1주일 배양 후 4시간 마다 120분으로 변경한 처리구와, F) 4시간 마다 120분간 1주일 배양 후 6시간 마다 15분간 식물체가 침지되도록 하였다. 그 후 배지가 반응기에 남아있지 않도록 30분씩 공기발생기를 통해 인위적으로 공기를 주입하였다. 공기압력은 1.
생물반응기 내에 들어가는 배지의 침지 시간을 조절하여 그에 따른 체세포배의 발아율과 식물체의 생장량을 조사하였다. 체세포배의 발아율은 배지 침지 시간이 길어질수록 증가하였으며, 초기에는 배지 침지시간을 6시간 마다 30분씩 침지시킨 후 1주일이 지난 후 4시간마다 120분이 침지되도록 침지시간을 조절한 처리에서 96.
유도된 배발생캘러스로부터 체세포배의 발달을 위해 1/2LM 배지에 gelrite 0.3mg L−1, sucrose 2% (w/v) 및 casein 0.8 gL−1이 포함된 배지로 계대배양하여 40일간 암배양 후 어뢰 모양으로 발달한 것을 사용하였다.
이 후 ethanol 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%와 100%에서 순차적으로 탈수시킨 후, Technovit 7100 (Kulzer, Germany)를 흡수시킨 후 매몰하였다.
이것들은 0.1% periodic acid, Schiff's solution과 0.05% toluidine blue O에서 염색하여 광학현미경(Leica, McBain Instrument, USA)으로 관찰하였다.
Figure 1은 간헐적으로 배지가 식물체에 침지되도록 설계된 생물반응기(TIB)이다. 체세포배의 발아는 LM배지에 sucrose 2% (w/v)를 첨가한 액체배지 1 L를 A) 6시간 마다 15분, B) 6시간 마다 30분, C) 4시간 마다 60분, D) 4시간 마다 120분, E) 6시간 마다 30분간 1주일 배양 후 4시간 마다 120분으로 변경한 처리구와, F) 4시간 마다 120분간 1주일 배양 후 6시간 마다 15분간 식물체가 침지되도록 하였다. 그 후 배지가 반응기에 남아있지 않도록 30분씩 공기발생기를 통해 인위적으로 공기를 주입하였다.
대상 데이터
배지는 Litvay (1981)배지(LM)에 sucrose 3%(w/v), 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) 2.0 mg L−1, 6-benzylaminopurine (BA) 0.25mg L−1, casein 0.8 g L−1, glutamine 0.8 g L−1과 gelrite 0.4mg L−1를 첨가하여 사용하였다.
Malondialdehyde (MDA)함량은 Heath와 Parker (1968)의 방법을 따랐다. 시료 0.
Superoxide dismutase (SOD) 활성은 nitro blue tetrazolium(NBT) 환원법을 이용하였으며, 분광광도계로 530 nm에서 120초 동안의 흡광도 증가를 측정하였다(Beauchamp and Fridovich, 1971).
Superoxide dismutase (SOD) 활성은 nitro blue tetrazolium(NBT) 환원법을 이용하였으며, 분광광도계로 530 nm에서 120초 동안의 흡광도 증가를 측정하였다(Beauchamp and Fridovich, 1971). 활성은 Asada 등 (1974)의 V/v-1의식에 의해서 계산하였다. V와 v는 각각 SOD가 없을 때와 존재할 때, NBT의 환원속도를 나타낸다.
성능/효과
4시간 마다 120분씩 침지된 처리구에서는 91.64%, 4시간 마다 60분씩 침지된 처리구에서는 85.67%로 높은 발아율을 나타냈지만, 침지시간이 짧은 처리구에서는 50% 미만의 발아율을 나타내 액체배지의 침지시간에 따라 발아율의 차이가 현저하였다.
이는 식물체 발아 및 생장에 있어서 배지의 침지에 대해 스트레스를 가장 적게 받는다는 것을 보여주는 한 요인이다(Figure 4). Catalase는 6시간과 12시간 처리구에서 낮게 나타났으나 12시간에서 3시간으로 변경한 처리구에서 높게 나타났으며(Figure 5), glutathion peroxidase (GPx)는 총 12시간을 침지한 처리구만 3배~ 4배 가량 높은 활성을 나타내었다. 침지시간에 따른 항산화 과정에서 가장 민감하게 작용하는 효소는 SOD로서 과수화 현상을 간접적으로 나타내었다(Figure 6).
대체적으로 발아율이 높게 나타난 총 6시간과 총 12시간 침지한 처리구에서는 ABA함량이 낮게 나타났으며, 발아율이 낮게 나타난 총 1시간과 총 3시간 처리구에서는 높은 함량을 나타내었다.
따라서 백합나무 체세포배 발아에서 temporary immersion bioreactor (TIB)를 이용하여 발아율 및 효율을 높이는 동시에 침지시간의 조절을 통해 식물체의 과수화 현상을 줄여서 형태적 및 생리적으로 건전한 식물체를 생산할 수 있을 것이라 사료된다.
67%로 높은 발아율을 나타냈지만, 침지시간이 짧은 처리구에서는 50% 미만의 발아율을 나타내 액체배지의 침지시간에 따라 발아율의 차이가 현저하였다. 본 실험에서 식물체의 길이와 생중량은 상관관계가 나타나지 않았지만, 과수화된 식물체의 비율은 4시간 마다 60분씩 침지시킨 처리구에서 가장 낮게 나타났다. 이상의 결과를 토대로 볼 때 백합나무 체세포배의 생물반응기를 이용한 발아 및 식물체 생산은 발아율이 양호한 4시간 마다 60분씩 배지를 공급하는 방식이 적절한 것으로 나타났다(Table 1, Figure 2).
, 2008; Zhang and Kirkham, 1996). 본 실험에서 침지시간에 따른 ABA 함량을 비교하였을 때 발아율이 높게 나타났던 4시간 마다 60분씩 배지를 공급한 처리구와 4시간마다 120분씩 배지를 공급한 처리구에서 2배~3배 가량 낮은 함량을 나타내었다. 이는 식물의 휴면에 있어서 발아억제 및 생육억제를 하는 ABA 함량이 적게 나타난 것도 발아율과 관련된 요소 중 하나로 사료된다(An et al.
본 실험에서도 침지 시간의 조절이 정상적인 배발달 및 과수화 빈도 억제의 중요요소로 작용하였으며, 발아율과 과수화 현상을 고려할 때 4시간 마다 60분씩 침지시킨 경우 비교적 높은 발아율과 상대적으로 적은 과수화를 가져올 수 있었다.
본 처리구에서는 카르테노이드의 함량에서 상관관계를 찾을 수 없었으나(Figure 7), 엽록소 a의 함량변화는 SOD의 활성과 비슷하게 총 6시간과 총 12시간을 침지한 처리구에서 낮게 나타났다.
산화 스트레스에 대한 방어 메커니즘으로 극도로 불안정적인 자유기(free radical)를 제거하기 위한 항산화 효소의 활성을 알아볼 수 있다(Larson, 1988). 상대적으로 발아율이 높으며 ABA함량이 높았던 6시간과 12시간을 침지한 처리구에서 SOD와 catalase의 활성이 적게 나타났다. SOD, CAT, APOX, GR과 glutathion과 ascorbate와 같은 비효소의 항산화 작용은 ABA 합성을 높게 하는 것으로 알려져 있다(Jiang and Zhang, 2001; 2002).
이상의 결과를 토대로 볼 때 백합나무 체세포배의 생물반응기를 이용한 발아 및 식물체 생산은 발아율이 양호한 4시간 마다 60분씩 배지를 공급하는 방식이 적절한 것으로 나타났다(Table 1, Figure 2).
생물반응기 내에 들어가는 배지의 침지 시간을 조절하여 그에 따른 체세포배의 발아율과 식물체의 생장량을 조사하였다. 체세포배의 발아율은 배지 침지 시간이 길어질수록 증가하였으며, 초기에는 배지 침지시간을 6시간 마다 30분씩 침지시킨 후 1주일이 지난 후 4시간마다 120분이 침지되도록 침지시간을 조절한 처리에서 96.27%로 가장 높았다. 4시간 마다 120분씩 침지된 처리구에서는 91.
한편 침지시간이 하루에 총 1시간으로 가장 적은 처리구에서 내생 ABA의 함량이 7.70 pmol/mL로 가장 높게 나타났으며 이 후 침지시간이 길어질수록 ABA의 함량이 적어져 총 6시간 침지하였을 때 3.83 pmol/mL로 가장 낮게 나타났고, 총 12시간 침지하였을 때 다소 증가하였다(Figure 3).
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유용 경제수종으로서의 육성을 위해 조림적지 선정 및 기술 개발 이전에 요구되는 기술은?
, 2005). 이와 같은 이유로 인해 유용 경제수종으로서의 육성에 있어서 조림적지 선정 및 기술 개발 이전에 우량 종자 확보를 통한 건전묘 생산기술이 요구된다.
백합나무는 어디에 분포되어 있는 수종인가?
백합나무(Liriodendron tulipifera)는 북아메리카에서 애팔레치아산맥 남부 지역에 걸쳐 분포되어 있는 수종으로(Merkle et al., 1993), 자생지는 가파른 경사지, 파괴된 임지의 경사지, 협곡 등에서도 발견되며 열악한 입지에도 제한을 받지 않고 잘 자란다(유근옥 등, 2008).
체세포배 유도기술의 유용성은?
이 방법은 약 50년 전에 Steward 등(1958)에 의해 처음 보고되었다. 이 기술은 접합자배를 연구하려는 유용도구로서 중요할 뿐만 아니라, 식물의 대량생산을 위한 도구로도 유용하다(Jiménez, 2001). 초기의 백합나무 체세포배유도 연구는 목질화되지 않은 절간에서 캘러스를 유도하였으나 계속되는 캘러스의 변질로 인해 실패하였다(Nitsch and Nitsch, 1969).
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