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문제 정의
- 저자 등은 탄산칼슘을 원료로 하여 산성아미노산(aspartic acid)과 반응시킨 결과, 탄산가스가 발생되어 휘발되어 없어짐으로 황산나트륨과 같은 간섭이온이 형성되지 않을 뿐 아니라 전기적으로 중성인 형태의 아미노산 칼슘킬레이트 화합물을 얻을 수 있었으며, 이 용액에 황산철을 첨가할 경우 철과 칼슘이 치환되어 철과 아미노산 사이에 킬레이트가 형성되는 반면, 칼슘은 황산염 형태로 전환되어 불용성의 황산칼슘으로 치환되어 침전 분리되어 아미노산과 킬레이트 결합된 철분만을 쉽게 얻을 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 이렇게 제조된 아스파르트산 킬레이트 철분의 흡수 및 철분 결핍 상태에 대한 효과를 확인하여 새로운 기능성 철분제의 소재로 사용이 가능한지를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 사육기간 중 무기질의 오염을 방지하기 위하여 사육이 시작하기 전에 질산으로 물통 및 대사 cage를 세척 후 3차 증류수로 완전히 수세한 후 건조한 후 사용하였다. 7일의 투여기간 중 각 군의 시료섭취량과 체중 변화를 관찰하였다.
- 채취한 혈액의 혈구로 CBC(complete blood cell: red blood cell, RBC; white blood cell, WBC; hematocrits, HCT; hemoglobin, Hb)를 측정하였으며, 혈청으로는 철분의 농도 및 TIBC(total iron binding capacity)를 측정하였다. CBC는 자동 분석기(ADVIA120, Bayer, Tarrytowm, NY, USA)로 측정하였으며, CBC 측정에 사용된 Isoton III, Coulter clenz, Lyse S III, 4% sodium hypochloride solution, 4C-plus 및 Scatter Pak는 Beckman Coulter(Fullerton, CA, USA) 제품을 사용하였다. 혈청 중 철분 함량은 Nitrose-PSAP 직접법에 따라 자동 생화학분석기(HITACHI 7150, Tokyo, Japan)와 SICDIA Fe-750 reagent(Shinyang Chemical Co.
- , Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. TIBC는 TIBC kit(RM 176-K, Eiken, Tokyo, Japan)와 생화학분석기(HITACHI 7150)을 이용하여 측정하였다.
- 5% EDTA K3가 들어있는 vacutainer에 담아 혈구를 분리하였고, 나머지 반은 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 각 장기는 trimming 후 생리식염수에 세척하여 여과지로 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였다.
- 철분 결핍 상태가 유도된 흰쥐(iron deficient rat, ID)에 heme-Fe 투여군(ID＋heme-Fe), Asp-Fe 투여군(ID＋Asp-Fe) 및 증류수 투여군(ID＋C)으로 나누었다. 경구투여 시 보충제의 농도는 한국인 영양소 기준치(15 mg/60 kg/day)(12)를 기준으로 수치의 10배 수준으로 실험동물의 평균 체중으로 하여 0.5 mg/kg/day로 투여하였으며, 투여 시 오차를 줄이기 위하여 강제 경구투여 방식으로 7일간 수행하였다.
-
변에 함유된 철분의 함량을 측정하기 위하여 시료(변) 0.25g에 HNO3 5 mL과 H2O2 2 mL을 넣고 400 W, 15 min, 800 psi, 200℃에서 전 처리한 후 ICP-AES(Inductively Coupled
Plasma Atomic Emission Spectrometer, model: Jobin Yvon 138 Ultrace, Longjumeau, France)로 흡수되지 못하고 배출된 철분 함량을 분석하였다. - 동물사육 종료 전 일주일 간 실험동물을 metabolic cage에 옮겨 적응시킨 후 마지막 3일 동안 대변을 수집하였다. 사육 마지막 날 체중을 측정하고 에테르 마취하에 개복하여 복부 대정맥으로부터 혈액을 채취하고, 간장, 신장, 비장 등 주요장기를 적출하였다. 혈액의 반은 7.
- 정상대조군(normal control; NC)은 철분 결핍쥐와 동일한 환경에서 사육하면서 Table 1과 같이 AIN-76 mineral mixture를 첨가한 정상식이를 조제하여 투여하였다. 실험 식이를 조제할 때와 동물을 사육하는 동안 급여한 물은 모두 3차 증류수를 사용하였으며, 식이는 24시간 자유급식 방식으로 급식하였다.
- 실험동물은 사육케이지(42×28 cm)를 이용해 사육하였으며, 온도 22～24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark)가 자동조절장치에 의해 조절되는 사육 환경에서 사육하였다.
- 일개월간의 철분 결핍식이를 급여한 후, 일주일간 철분 보충제를 투여한 실험동물의 사육기간 중 사료섭취량 및 체중 및 주요 장기의 무게 변화를 측정하였다. Table 2의 결과를 보면 식이섭취량, 체중의 변화 및 주요 장기의 변화에서 모든 투여군 간에서 유의적 차이가 없었다.
- 정상대조군(normal control; NC)은 철분 결핍쥐와 동일한 환경에서 사육하면서 Table 1과 같이 AIN-76 mineral mixture를 첨가한 정상식이를 조제하여 투여하였다. 실험 식이를 조제할 때와 동물을 사육하는 동안 급여한 물은 모두 3차 증류수를 사용하였으며, 식이는 24시간 자유급식 방식으로 급식하였다.
- 채취한 혈액의 혈구로 CBC(complete blood cell: red blood cell, RBC; white blood cell, WBC; hematocrits, HCT; hemoglobin, Hb)를 측정하였으며, 혈청으로는 철분의 농도 및 TIBC(total iron binding capacity)를 측정하였다. CBC는 자동 분석기(ADVIA120, Bayer, Tarrytowm, NY, USA)로 측정하였으며, CBC 측정에 사용된 Isoton III, Coulter clenz, Lyse S III, 4% sodium hypochloride solution, 4C-plus 및 Scatter Pak는 Beckman Coulter(Fullerton, CA, USA) 제품을 사용하였다.
- Transferrin saturation(TS)은 혈청 철분 농도를 TIBC치로 나눈 값을 말하는 것으로 철분 결핍성 빈혈의 진단에 유용하게 이용되는 biomarker 중의 하나이다(17). 철분 결핍 상태가 유도된 실험동물에게 7일간 철분보충제를 투여한 후, 혈액 중 철분 농도와 TIBC를 측정하고 TS를 환산하였다. 그 결과(Table 3), 철 결핍 상태에서 7일간 Asp-Fe를 투여한 군(ID＋Asp-Fe)의 혈액 중 철분의 농도는 175.
- 철분 결핍이 유도된 실험동물은 난괴법에 따라 6마리씩 4군으로 분류하였다. 철분 결핍 상태가 유도된 흰쥐(iron deficient rat, ID)에 heme-Fe 투여군(ID＋heme-Fe), Asp-Fe 투여군(ID＋Asp-Fe) 및 증류수 투여군(ID＋C)으로 나누었다. 경구투여 시 보충제의 농도는 한국인 영양소 기준치(15 mg/60 kg/day)(12)를 기준으로 수치의 10배 수준으로 실험동물의 평균 체중으로 하여 0.
- 철분 결핍 유도는 Table 1과 같이 식이를 제조하였으며 이때 mineral mixture 대신 철분이 제거된 Fe-free mineral mixture로 식이를 조제하여 1개월간 투여하여 철분 결핍상태를 유도하였다. 철분 결핍이 유도된 실험동물은 난괴법에 따라 6마리씩 4군으로 분류하였다.
- 철분 결핍 유도는 Table 1과 같이 식이를 제조하였으며 이때 mineral mixture 대신 철분이 제거된 Fe-free mineral mixture로 식이를 조제하여 1개월간 투여하여 철분 결핍상태를 유도하였다. 철분 결핍이 유도된 실험동물은 난괴법에 따라 6마리씩 4군으로 분류하였다. 철분 결핍 상태가 유도된 흰쥐(iron deficient rat, ID)에 heme-Fe 투여군(ID＋heme-Fe), Asp-Fe 투여군(ID＋Asp-Fe) 및 증류수 투여군(ID＋C)으로 나누었다.
대상 데이터
- , aspartic acid는 Sigma Co.(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, 동물 실험 시 대조군으로 사용한 햄철(heme-Fe)은 유한양행(Seoul, Korea) 제품을 구입하여 사용하였다.
- 실험동물은 Sprague-Dawley계 3주령 수컷흰쥐를 (주)대한바이오링크(Seoul, Korea)로부터 구입하여 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 사육케이지(42×28 cm)를 이용해 사육하였으며, 온도 22～24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark)가 자동조절장치에 의해 조절되는 사육 환경에서 사육하였다.
데이터처리
- 각 군의 유의차 검증은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple comparison test에 의해 검증하였다.
- 실험을 통해 얻어진 모든 자료는 SAS program(version 9.1, SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 평균±표준 오차로 나타내었다.
이론/모형
- CBC는 자동 분석기(ADVIA120, Bayer, Tarrytowm, NY, USA)로 측정하였으며, CBC 측정에 사용된 Isoton III, Coulter clenz, Lyse S III, 4% sodium hypochloride solution, 4C-plus 및 Scatter Pak는 Beckman Coulter(Fullerton, CA, USA) 제품을 사용하였다. 혈청 중 철분 함량은 Nitrose-PSAP 직접법에 따라 자동 생화학분석기(HITACHI 7150, Tokyo, Japan)와 SICDIA Fe-750 reagent(Shinyang Chemical Co., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. TIBC는 TIBC kit(RM 176-K, Eiken, Tokyo, Japan)와 생화학분석기(HITACHI 7150)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 8%로 철분 결핍 대조군에 비하여 약 2배 증가하였으며 정상군 수준에 접근하는 결과를 보였다. 1개월간의 철 결핍사료 투여 후 7일간의 철분을 투여한 결과로 비교해볼 때 Asp-Fe 투여군이 heme-Fe 투여군에 비하여 혈청에서의 철분 함량, 트렌스페린 포화도 및 철분 결합능 모두에서 유의적으로 높은 정상화 경향을 나타내었으며, 완전히 정상식이 투여군 수준으로 정상화시키지는 못했지만 투여기간이 길어지면 충분히 정상화가 가능할 것으로 예측되었다.
- 7 μg/dL)와 유의적 차이가 없는 수준까지 정상화되었으며, heme-Fe을 투여한 군(ID＋heme-Fe)은 철 결핍 대조군보다 혈액 중 철분 함량은 증가하였으나 유의적 차이는 없었다. 각 실험군의 TIBC를 측정한 결과, Asp-Fe 투여군은 정상군 수준까지는 정상화되지는 못했지만 철 결핍 대조군에 비해 유의적 수준으로 정상화되었다. 반면 heme-Fe 투여군의 경우 철 결핍 대조군과 유의적 차이가 없었다.
- 그 결과(Table 3), 철 결핍 상태에서 7일간 Asp-Fe를 투여한 군(ID＋Asp-Fe)의 혈액 중 철분의 농도는 175.2±4.61 μg/dL로 철 결핍이 유도되지 않은 정상군(NC)의 혈액 중 농도(224.5±33.7 μg/dL)와 유의적 차이가 없는 수준까지 정상화되었으며, heme-Fe을 투여한 군(ID＋heme-Fe)은 철 결핍 대조군보다 혈액 중 철분 함량은 증가하였으나 유의적 차이는 없었다.
- Chen 등(15)은 44g의 어린 쥐에 철 결핍 사료를 투여한 후 정상식이 쥐와 체중증가 정도를 비교했을 때 사료섭취량의 차이로 인한 체중증가에 영향을 미치는 것으로 나타났으며 사료효율에서는 차이가 없는 것으로 보고하였다. 그러나 본 연구에서 사육하는 동안 섭취한 총 식이섭취량을 보면 정상군과 철분결핍 대조군 간에 차이는 나타나지 않았으며 그룹 간에도 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 따라서 동물의 주령 및 종간의 차이가 철 결핍에 대한 영향을 받는 정도가 다른 것으로 판단되며 어린 주령에서 철분의 결핍은 체중증가에 중요한 영향을 미치지만 성체에 해당하는 주령에 가까울수록 철 결핍이 식이섭취량 및 체중증가에 미치는 영향이 상대적으로 적은 것으로 판단된다.
- 비록 생산 과정이 복잡하기는 하지만 햄철은 비햄철에 비해 생체이용율이 높아 현재 빈혈 등의 치료나 예방을 위해 임상적으로 사용되고 있다. 본 연구는 아미노산 킬레이트 방식으로 제조된 철분인 아스파르트산 킬레이트 철분을 7일이라는 짧은 기간 동안 투여하기는 했지만 시중에서 판매되는 햄철과 유사한 생체이용률을 가지고 있음을 알 수 있었다. 아미노산 킬레이트 철분에 대한 안전성은 아직 심도 있게 연구되지는 못했지만 본 연구를 통해 그 이용 가능성은 충분히 입증되었으며 햄철을 대체해서 활용될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에 사용한 아미노산과 킬레이트 형태로 결합한 철분인 아스파르트산 킬레이트 철분은 비햄철의 형태이지만 상기의 연구결과를 보면 실험에 사용한 햄철보다 높은 흡수율(Table 3, 4)을 보였으며, 햄철에 비해 철 결핍성 빈혈을 회복시키는 것을 알 수 있었다(Fig. 1). 아미노산 킬레이트 철분은 일반적인 비햄철의 흡수경로를 통하여 체내로 들어간다고 보고되고 있다.
- 본 연구는 아미노산 킬레이트 방식으로 제조된 철분인 아스파르트산 킬레이트 철분을 7일이라는 짧은 기간 동안 투여하기는 했지만 시중에서 판매되는 햄철과 유사한 생체이용률을 가지고 있음을 알 수 있었다. 아미노산 킬레이트 철분에 대한 안전성은 아직 심도 있게 연구되지는 못했지만 본 연구를 통해 그 이용 가능성은 충분히 입증되었으며 햄철을 대체해서 활용될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구에서는 짧은 기간 연구된 관계로 유의적 수준의 효능을 확인하지는 못하였다.
- 아미노산 킬레이트 철분은 일반적인 비햄철의 흡수경로를 통하여 체내로 들어간다고 보고되고 있다. 이와 같은 결과를 뒷받침하는 결과로 글리신철 킬레이트가 비타민 C와 함께 투여될 경우 생체이용율이 증가하는 것(20), 그리고 아미노산철 킬레이트 흡수가 생체내의 철의 수준에 반비례적으로 작용하는 것을 통하여 비햄철의 흡수 경로를 통하여 흡수되는 것으로 확인되었다(21). Olivares 등(20)은 아미노산 킬레이트 철분의 경우, 햄철과 흡수 경로가 다르기 때문에 흡수되는 과정에서 햄철과 경쟁적으로 흡수되지 않는다고 보고하였다.
- 저자 등은 탄산칼슘을 원료로 하여 산성아미노산(aspartic acid)과 반응시킨 결과, 탄산가스가 발생되어 휘발되어 없어짐으로 황산나트륨과 같은 간섭이온이 형성되지 않을 뿐 아니라 전기적으로 중성인 형태의 아미노산 칼슘킬레이트 화합물을 얻을 수 있었으며, 이 용액에 황산철을 첨가할 경우 철과 칼슘이 치환되어 철과 아미노산 사이에 킬레이트가 형성되는 반면, 칼슘은 황산염 형태로 전환되어 불용성의 황산칼슘으로 치환되어 침전 분리되어 아미노산과 킬레이트 결합된 철분만을 쉽게 얻을 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 이렇게 제조된 아스파르트산 킬레이트 철분의 흡수 및 철분 결핍 상태에 대한 효과를 확인하여 새로운 기능성 철분제의 소재로 사용이 가능한지를 확인하고자 하였다.
- 철분 결핍쥐에 형태를 달리한 철분 보충제를 투여한 다음 3일간의 대변을 회수하여 실험동물의 대변 중 흡수되지 못하고 배설된 철분의 양을 측정한 결과(Table 4), heme-Fe 투여군의 경우 변으로 배설된 철분의 양이 1427.4 μg/3 day로 총 투여량 대비 21.3%의 흡수율을 보인 반면 Asp-Fe 투여군은 1000.6 μg/3 day로 50.5%의 흡수율을 보였다.
- 1A) 모든 실험군에서 유의적 차이는 없었다. 헤모글로빈의 농도를 측정한 결과(Fig. 1C)에서는 Asp-Fe 투여 시 철분 결핍 대조군에 비해 유의적 수준으로 증가하였으나, HCT를 측정한 결과 (Fig. 1D)에서는 Asp-Fe(39.33%)나 heme-Fe 투여군(36.11%)에서 철분 결핍 대조군보다 HCT가 증가하는 경향은 보였지만 정상 대조군(44.20%)에 비해 유의적으로 낮은 수치로 측정되었다.
후속연구
- 아미노산 킬레이트 철분에 대한 안전성은 아직 심도 있게 연구되지는 못했지만 본 연구를 통해 그 이용 가능성은 충분히 입증되었으며 햄철을 대체해서 활용될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 본 연구에서는 짧은 기간 연구된 관계로 유의적 수준의 효능을 확인하지는 못하였다. 따라서 투여기간의 연장에 의한 결과 및 안정성의 연구가 보강된다면 아스파르트산 킬레이트 철분은 철분 보충제로 활용 가능하리라 판단된다.
- 그러나 본 연구에서는 짧은 기간 연구된 관계로 유의적 수준의 효능을 확인하지는 못하였다. 따라서 투여기간의 연장에 의한 결과 및 안정성의 연구가 보강된다면 아스파르트산 킬레이트 철분은 철분 보충제로 활용 가능하리라 판단된다.
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