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문제 정의
- 본 실험은 단기간에 아그로박테리움을 이용하여 재조합 플라스미드에 포함된 목표유전자를 식물세포 내에 도입하기 위해 하루 동안 액체배지에 침종한 종자를 이용하여 아그로박테리움과 공동배양을 시도하였고, 공동배양 과정의 배지조성 및 조건을 조절하여 좀 더 효율적으로 단기간에 식물체를 형질전환 시키고자 하였다.
제안 방법
- 5% gelrite가 포함된 2N6-AS 배지 위에 접종한 종자를 치상한 다음 25℃ 암조건에서 7일간 공동 배양하였다. 2N6-AS 배지에서 7일간 공동 배양한 종자를 아그로박테리움을 제거하기 위해 500 mg/L carbenicillin이 포함된 멸균수로 10회 이상 세척한 다음 멸균된 필터페이퍼로 간단히 수분을 제거한 뒤 캘러스 증식을 위해 400 mg/L carbenicillin이 포함된 N6D medium에 옮겨 32℃ 지속 광조건으로 1주일 동안 배양하였다. 접종 이후의 실험은 2,4-D 농도를 고려하지 않고 수행하였다.
- CIPK15 (CBL interacting serine/threonine protein kinase 15) 유전자의 도입여부를 확인하기 위한 PCR 반응은 50 ng의 주형 DNA를 사용하였고, 아래와 같이 primers를 합성하여 각각 이용하였다. Hygromycin 저항성 유전자 (HPT) 특이적으로 증폭하는 primer set (forward 5'-GGATTTCGGCTCCAATGTCCTGACGGA-3', reverse 5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3')으로 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension과정을 30 cycles 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하였다.
- CIPK15 유전자 도입을 보다 정확히 확인하기 위해 forward primer를 CaMV 35S 프로모터의 3’ 말단에서 디자인하였고, reverse primer는 목적유전자에서 디자인하였다.
- 배양액은 kanamycin 50 mg/L을 포함한 AB agar 배지에 200 μL를 피펫으로 떨어뜨려서 도말하고, 28℃ 항온기에서 petri dish에 2 ~ 3일 동안 배양하여 colony를 관찰하였다. Colony PCR 방법으로 형질전환여부를 확인하고, 확인된 균주의 배양은 kanamycin 50 mg/L이 첨가된 AB 액체배지에 접종한 후, 2~3일 동안 28℃ incubator에서 200 rpm으로 배양했다. 배양액은 50% glycerol을 동량 첨가하여 초저온 냉동고 (-80℃)에 저장하였다.
- Hygromycin 저항성 유전자 (HPT) 특이적으로 증폭하는 primer set (forward 5'-GGATTTCGGCTCCAATGTCCTGACGGA-3', reverse 5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3')으로 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension과정을 30 cycles 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하였다. DNA를 주형으로 하여 CIPK15 유전자 특이적으로 증폭하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 유전자의 도입을 보다 정확히 확인하기 위해 forward primer를 CaMV 35S 프로모터의 3’ 말단에서 디자인하였고, reverse primer는 목적유전자에서 디자인하였다.
- Hygromycin 저항성 유전자 (HPT) 특이적으로 증폭하는 primer set (forward 5'-GGATTTCGGCTCCAATGTCCTGACGGA-3', reverse 5'-CTTCTACACAGCCATCGGTCCAGA-3')으로 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension과정을 30 cycles 하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension을 실시하였다.
- 2D, 2E). 공동배양 기간 동안 아그로박테리움의 과도한 성장을 막고 아그로박테리움 도입에 따른 식물세포의 방어기작으로 생성될 수 있는 물질을 줄이기 위해 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3) 등을 배지에 포함하였다. 7일간의 공동 배양 후 호르몬에 따른 캘러스 형성률을 살펴본 결과는 Table 1과 같았다.
- 고품벼와 일품벼 종자를 70% 에탄올로 1 분간 세척한 후, 멸균수를 이용하여 1회 세척하였다. 그 후 5% sodium hypochlorite 용액을 이용하여 상온에서 10분씩 2회 살균한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 표면 살균하였다. 표면 살균한 종자를 0, 1, 2, 3, 4 mg/L 2,4-D가 포함된 N6(Chu et al.
- 다음과 같은 primer set (forward 5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3', reverse 5'-TTCCTTGCTGCATCTTCCTT-3')으로 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 2분간 extension 과정을 35 cycles로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 extension을 실시하였다.
- 일반적으로 아그로박테리움에 감염 후 캘러스 형성 및 생육은 그렇지 않았을 경우보다 효율적이지 못하다. 따라서, 좀 더 효율적인 캘러스 형성을 유도하고자 배지의 2,4-D호르몬을 농도별로 처리하였다. 그 결과, 아그로박테리움을 접종하지 않은 무처리구에 비해 캘러스형성율이 낮았으나, 2,4-D를 3 mg/L 처리구에서 캘러스 형성율이 가장 높은 결과를 보였으며, 또한 호르몬 처리 농도에 따라 캘러스 형성율도 다르게 나타났다 (Table 2, Fig.
- 배양액은 kanamycin 50 mg/L을 포함한 AB agar 배지에 200 μL를 피펫으로 떨어뜨려서 도말하고, 28℃ 항온기에서 petri dish에 2 ~ 3일 동안 배양하여 colony를 관찰하였다.
- 본 실험에 사용한 종자는 아직 캘러스 증식이 충분치 않은 상태이기 때문에, 건전한 상태의 캘러스를 증식시키고 아그로박테리움의 생장 억제를 위해 400 mg/L litter carbenicillin 만이 포함된 N6D medium에 옮겨 32 ℃ 지속 광조건으로 1주 동안 배양하여 캘러스를 증식하였다(Fig. 2F). 접종 이후의 실험은 2,4-D 농도를 고려하지 않고 수행하였다.
- 벼에 형질전환하기 위해 일반적으로 많이 이용되는 방법은 벼 종자에서 캘러스를 유기한 후 캘러스에 아그로박테리움균과 함께 접종하는 방법이 주로 이용되고 있는데 보통 형질전환체를 얻기까지 약 4개월이 소요된다. 본 실험에서는 벼 형질전환에 소모되는 시간을 단축시키고자 벼 성숙종자를 세척한 후 N6 액체배지에 24시간 침종한 후 배반 부분이 부풀어오르기 시작한 종자를 이용하여 아그로박테리움 접종을 시도하였다 (Fig. 2A). 표면 살균한 종자를 0, 1, 2, 3, 4 mg/L 2,4-D가 포함된 N6 (Chu et al.
- 이를 위해 효율적으로 아그로박테리움을 이용해 원하는 유전자를 식물체 내로 형질전환을 하기 위한 노력은 지금도 계속 진행되고 있다. 본 실험에서는 캘러스를 유기한 후 아그로박테리움을 이용해 접종하는 기존의 방법과 달리, 성숙 종자를 소독한 후 2,4-D가 포함된 액체배지에 24시간 침종하여 배 부분이 발아하기 시작하는 종자를 이용해 바로 아그로박테리움을 접종하여 체세포 변이의 발생을 최소화하고 유전자를 포함하고 있는 아그로박테리움이 식물 조직내로 침투할 수 있는 효율을 증가시키며, 그 후 캘러스를 유기하여 재분화 시킴으로써 형질전환 식물체를 얻는 방법을 새롭게 수립하였다. 배양과정 중 공동배양 배지에 아그로박테리움 성장억제물질인 silver nitrate와 항산화 물질인 DTT를 첨가하여 공동배양 기간을 7일 이상으로 늘림으로써 벼 형질전환효율을 증가시킬 수 있었고, PCR 분석을 통해 원하는 목표 유전자가 형질전환체에 안정적으로 도입이 되는 것도 확인할 수 있었다.
- 유전자가 형질전환된 벼 T0 식물체의 어린잎에서 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 목표유전자를 증폭하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. CIPK15 유전자 도입을 보다 정확히 확인하기 위해 forward primer를 CaMV 35S 프로모터의 3’ 말단에서 디자인하였고, reverse primer는 목적유전자에서 디자인하였다.
- 식물 형질전환용 운반체는 pCAMBIA1300 벡터를 모벡터로 사용하였고, 목표유전자의 발현을 검정하기 위하여 본 연구실에서 클로닝한 CIPK15 (CBL interacting serine/threonine protein kinase 15, LOC_Os07g48100) 유전자를 CaMV 35S 프로모터에 연결하여 제작하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 hygromicine 저항성 유전자를 이용하였다.
- 침종 24시간이 지난 후 배 부분이 부풀어 오르며 식물체가 분화가 되기 시작한 종자를 15 mL의 아그로박테리움 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 아그로박테리움을 접종한 종자를 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3), 0.5% gelrite가 포함된 2N6-AS 배지 위에 필터페이퍼를 깔고 그 위에 치상하여 25℃ 암조건에서 3일간 공동 배양하였고 (Fig. 2B, 2C), 그 후 배지 성분의 영향력을 높이기 위해 필터페이퍼를 제거한 배지에 치상하여 25℃ 암조건에서 4일간 공동 배양하였다 (Fig. 2D, 2E). 공동배양 기간 동안 아그로박테리움의 과도한 성장을 막고 아그로박테리움 도입에 따른 식물세포의 방어기작으로 생성될 수 있는 물질을 줄이기 위해 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3) 등을 배지에 포함하였다.
- 배반으로부터 왕성하게 증식하는 캘러스를 SF (shoot formation) 배지로 옮겨 식물체의 재분화를 유도하였다. 약 3주일의 배양기간 후 지상부가 재분화된 식물체를 RF (root formation) 배지로 옮겨 뿌리 발생을 유도하였으며 순화된 벼 형질전환 식물체를 온실에서 포트에 이식하여 재배하였다.
- 다음과 같은 primer set (forward 5'-CGCACAATCCCACTATCCTT-3', reverse 5'-TTCCTTGCTGCATCTTCCTT-3')으로 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 2분간 extension 과정을 35 cycles로 하였으며, 마지막으로 72℃에서 10분간 extension을 실시하였다. 얻어진 증폭 산물은 1.5% agarose gel상에 영동한 후 ethidium bromide로 10분간 염색하여 band를 확인하였다.
- 침종 24시간이 지난 후 배 부분이 부풀어 오르며 식물체 분화가 되기 시작한 종자를 15 mL 의 아그로박테리움 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 여분의 아그로박테리움을 제거한 후에 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3), 0.5% gelrite가 포함된 2N6-AS 배지 위에 접종한 종자를 치상한 다음 25℃ 암조건에서 7일간 공동 배양하였다. 2N6-AS 배지에서 7일간 공동 배양한 종자를 아그로박테리움을 제거하기 위해 500 mg/L carbenicillin이 포함된 멸균수로 10회 이상 세척한 다음 멸균된 필터페이퍼로 간단히 수분을 제거한 뒤 캘러스 증식을 위해 400 mg/L carbenicillin이 포함된 N6D medium에 옮겨 32℃ 지속 광조건으로 1주일 동안 배양하였다.
- 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하였다. 유전자가 형질전환된 벼 T0 식물체의 어린잎에서 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 주형으로 하여 목표유전자를 증폭하도록 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 유전자의 도입을 보다 정확히 확인하기 위해 forward primer를 CaMV 35S 프로모터의 3’ 말단에서 디자인하였고, reverse primer는 목적유전자에서 디자인하였다.
- 2002) 적절한 방법을 선택하는 것이 중요할 것으로 생각된다. 지상부가 재분화된 식물체를 RF (root formation) 배지 (Fig. 2J, 2K)로 옮겨 뿌리 발생을 유도하였으며 순화된 벼 형질전환 식물체를 온실에서 포트에 이식하여 재배하였다 (Fig. 2L). 고품벼는 형질전환 캘러스 115개 중 총 35 개의 형질전환 식물체를 얻어 30.
- 3이 되도록 하였다. 침종 24시간이 지난 후 배 부분이 부풀어 오르며 식물체 분화가 되기 시작한 종자를 15 mL 의 아그로박테리움 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 여분의 아그로박테리움을 제거한 후에 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3), 0.
- 침종 24시간이 지난 후 배 부분이 부풀어 오르며 식물체가 분화가 되기 시작한 종자를 15 mL의 아그로박테리움 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 아그로박테리움을 제거하였다. 아그로박테리움을 접종한 종자를 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3), 0.
- 그 후 5% sodium hypochlorite 용액을 이용하여 상온에서 10분씩 2회 살균한 후 멸균수로 10회 이상 세척하여 표면 살균하였다. 표면 살균한 종자를 0, 1, 2, 3, 4 mg/L 2,4-D가 포함된 N6(Chu et al. 1975) 액체배지에 침종하여 30 ℃ 암상태에서 24시간 동안 발아시켰다. 침종 24시간이 지나 배 부분이 부풀어 오르기 시작한 종자를 이용하여 아그로박테리움과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
- 식물 형질전환용 운반체는 pCAMBIA1300 벡터를 모벡터로 사용하였고, 목표유전자의 발현을 검정하기 위하여 본 연구실에서 클로닝한 CIPK15 (CBL interacting serine/threonine protein kinase 15, LOC_Os07g48100) 유전자를 CaMV 35S 프로모터에 연결하여 제작하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 hygromicine 저항성 유전자를 이용하였다. 실험에 사용된 운반체의 모식도는 Fig.
대상 데이터
- 1975) 액체배지에 침종하여 30 ℃ 암상태에서 24시간 동안 발아시켰다. 침종 24시간이 지나 배 부분이 부풀어 오르기 시작한 종자를 이용하여 아그로박테리움과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
이론/모형
- 유전자의 도입여부를 확인하기 위해 total DNA의 분리는 Cho 등 (2007, 2010)의 방법을 이용하였다. 형질전환체 및 대조 식물로부터 채취한 0.
- 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하였다. 유전자가 형질전환된 벼 T0 식물체의 어린잎에서 게놈 DNA를 분리하였다.
성능/효과
- 2L). 고품벼는 형질전환 캘러스 115개 중 총 35 개의 형질전환 식물체를 얻어 30.4%의 높은 형질전환 효율을 보였다. 일품벼는 형질전환 캘러스 97개 중 총 22개의 형질전환 식물체를 얻어 22.
- 따라서, 좀 더 효율적인 캘러스 형성을 유도하고자 배지의 2,4-D호르몬을 농도별로 처리하였다. 그 결과, 아그로박테리움을 접종하지 않은 무처리구에 비해 캘러스형성율이 낮았으나, 2,4-D를 3 mg/L 처리구에서 캘러스 형성율이 가장 높은 결과를 보였으며, 또한 호르몬 처리 농도에 따라 캘러스 형성율도 다르게 나타났다 (Table 2, Fig. 3). 이러한 결과는 고품벼와 일품벼에서 동일하게 나타났으며 이 결과를 종합해 볼 때 종자를 소독하여 캘러스 형성 액체 배지에 1 일간 침종 한 후 접종하는 형질전환법을 이용할 때는 2,4-D 농도가 3 mg/L인 것이 효율적인 것으로 판단되며 2,4-D를 적정하게 사용할 경우에는 균을 접종하지 않았을 때와 동일한 정도의 캘러스 형성이 가능할 것으로 생각된다.
- CIPK15 유전자 도입을 보다 정확히 확인하기 위해 forward primer를 CaMV 35S 프로모터의 3’ 말단에서 디자인하였고, reverse primer는 목적유전자에서 디자인하였다. 단기형질전환 방법을 이용하여 유도된 형질전환 고품벼 T0 식물체 35개 중 4개, 일품벼 T0 식물체 22개 중 4개를 무작위로 선발하여 PCR한 결과 모두 안정적으로 형질전환된 것으로 확인하였다(Fig. 4).
- Charles 등 (2001) 은 공동배양 시 아그로박테리움의 생장 억제를 위해 배지에 silver nitrate, silver thiosulfate 등의 물질을 첨가하면, 형질전환 효율을 높이고 삽입 유전자의 copy 수를 줄일 수 있다고 보고하였다. 따라서, 공동배양 시 아그로박테리움의 과도한 생육을 억제할 수 있는 항산화 물질의 첨가와 더불어 사용되는 호르몬의 적절한 조절은 공동배양 과정에서 효율적인 캘러스 형성 및 아그로박테리움에 의한 목표 유전자의 도입을 가능하게 할 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 실험에서는 캘러스를 유기한 후 아그로박테리움을 이용해 접종하는 기존의 방법과 달리, 성숙 종자를 소독한 후 2,4-D가 포함된 액체배지에 24시간 침종하여 배 부분이 발아하기 시작하는 종자를 이용해 바로 아그로박테리움을 접종하여 체세포 변이의 발생을 최소화하고 유전자를 포함하고 있는 아그로박테리움이 식물 조직내로 침투할 수 있는 효율을 증가시키며, 그 후 캘러스를 유기하여 재분화 시킴으로써 형질전환 식물체를 얻는 방법을 새롭게 수립하였다. 배양과정 중 공동배양 배지에 아그로박테리움 성장억제물질인 silver nitrate와 항산화 물질인 DTT를 첨가하여 공동배양 기간을 7일 이상으로 늘림으로써 벼 형질전환효율을 증가시킬 수 있었고, PCR 분석을 통해 원하는 목표 유전자가 형질전환체에 안정적으로 도입이 되는 것도 확인할 수 있었다. 또한, 이 방법은 형질전환 효율이 낮은 일품벼와 같은 품종에도 적용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 3). 이러한 결과는 고품벼와 일품벼에서 동일하게 나타났으며 이 결과를 종합해 볼 때 종자를 소독하여 캘러스 형성 액체 배지에 1 일간 침종 한 후 접종하는 형질전환법을 이용할 때는 2,4-D 농도가 3 mg/L인 것이 효율적인 것으로 판단되며 2,4-D를 적정하게 사용할 경우에는 균을 접종하지 않았을 때와 동일한 정도의 캘러스 형성이 가능할 것으로 생각된다. Charles 등 (2001) 은 공동배양 시 아그로박테리움의 생장 억제를 위해 배지에 silver nitrate, silver thiosulfate 등의 물질을 첨가하면, 형질전환 효율을 높이고 삽입 유전자의 copy 수를 줄일 수 있다고 보고하였다.
- 4%의 높은 형질전환 효율을 보였다. 일품벼는 형질전환 캘러스 97개 중 총 22개의 형질전환 식물체를 얻어 22.6%의 형질전환 효율을 나타냈다.
- 2A). 표면 살균한 종자를 0, 1, 2, 3, 4 mg/L 2,4-D가 포함된 N6 (Chu et al. 1975) 액체배지에 침종하여 30℃ 암상태에서 24시간 동안 발아시킨 결과 2,4-D 농도에 의한 차이는 아직 발견되지 않았다.
후속연구
- 배양과정 중 공동배양 배지에 아그로박테리움 성장억제물질인 silver nitrate와 항산화 물질인 DTT를 첨가하여 공동배양 기간을 7일 이상으로 늘림으로써 벼 형질전환효율을 증가시킬 수 있었고, PCR 분석을 통해 원하는 목표 유전자가 형질전환체에 안정적으로 도입이 되는 것도 확인할 수 있었다. 또한, 이 방법은 형질전환 효율이 낮은 일품벼와 같은 품종에도 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 실험을 통해 얻어진 새로운 공동배양 방법은 우수한 농업적 형질을 가진 벼 육종 소재 및 품종 개발시 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 또한, 이 방법은 형질전환 효율이 낮은 일품벼와 같은 품종에도 적용할 수 있을 것으로 판단된다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, 본 실험을 통해 얻어진 새로운 공동배양 방법은 우수한 농업적 형질을 가진 벼 육종 소재 및 품종 개발시 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 생각된다.
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