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문제 정의
- 이 연구의 목적은 수퇘지 정자의 운동성, 생존성 및 체외수정 능력에 대한 시판 액상 정액 보존액과 보존 기간의 영향을 검토하기 위한 것이다. 보존액 간의 정액 보존성을 비교하기 위해서 총 5가지의 정액 보존액이 사용되었으며, 희석정액을 10일 동안 보관하면서 정자의 운동성, 생존성 및 체외수정 능력의 변화를 분석하였다.
제안 방법
- 채취된 난자는 실체현미경 하에서 세포질이 균질하고 난구세포가 균일한 난자만을 선별하여 난자 체외성숙용 배양액 (TCM-199; Gibco-BRL, Grand Island, NYZ USA)으로 수회 세척 후 성숙배양을 실시하였다. 난자의 체외성숙은 기본배양액 TCM-199 에 10% pFF(porcine follicular fluid), 5 ug/ml LHZ 0.5 ug/mlFSH 10 lU/ml hCG, 0.01 ug/ml EGF를 첨가한 IVM-1 용액을 사용하였으며, 인큐베이터 내에서 5% COz, 39℃ 온도 조건으로 22시간 동안 1차 성숙 배양 후 TCM-199에 10% pFF와 0.01 ug/ml EGF만을 첨가한 IVM-2 용액을 이용해 동일한 배양 조건(5% CO2, 39℃)으로 22시간 동안 추가로 성숙배양을 실시하였다.
- 정자의 최종농도를 2x 106 spermatozoa/ml로 맞준 다음' 난자가 들어있는 체외수정용 소적에 정자를 투입하여 체외수정을 한 후 인큐베이터 내에서 5% CCh, 39℃ 온도 조건으로 배양을 실시하였다. 배양 6시간 후 수정된 난자 주위에 붙어 있는 난구세포와 정자를 제거한 다음 PZM-3(108 mM NaCl, 10.00 mM KC1, 0.35 mM KHzPQ 0.40 mM MgSO4-7H2O, 25.07 mM NaHCO3, 1 mM glutamine, 2 mM Ca(lac- tate)2 - 5HzO, 5 mM hypotaurine, 0.05 mg/ml gentamicin sulfate) 에 0.03% BSA(bovine serum albumEn)를 첨가한 체외배양액을 이용해 5% CO2, 39℃ 인큐베이터 내에서 배양하며 난자의 발달을 관찰하였다.
- 영향을 검토하기 위한 것이다. 보존액 간의 정액 보존성을 비교하기 위해서 총 5가지의 정액 보존액이 사용되었으며, 희석정액을 10일 동안 보관하면서 정자의 운동성, 생존성 및 체외수정 능력의 변화를 분석하였다.
- 우리는 시판 중인 5가지 액상 정액 보존액으로 희석된 돼지정액을 10일 동안 보관하면서 각 보존액의 정액 보존성(정자의 운동성, 생존성 및 수정 능력)을 검토하였다. 정자의 운동성은 수퇘지 정자의 품질을 판단하는 매우 중요한 기준이다(Britt et cd.
- 정액의 운동성을 검사하기 위해서 15 ml conical tube (Coming, USA) 에 5 ml 씩 sample을 취하여 37 ℃ 항온 수조에서 30분간 가온하였으며, 정자자동분석기(CASA; computer-assisted semen analysis, Medical Supply, Korea) 를이용하여 활력을 측정하였다. 정자의 생존율 검사를 위해서는 SYBR-14와 propidium iodide(PI)로 구성되어 있는 Live/Dead kit(Mawvell과 Johnson, 1997)를 이용흐]j 정자를 형광염색하는 방법을 사용하였으며, Flow-cytometry (FACS ARIA, B.
- 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였으며, 정액 필터를 통해 1차적으로 걸러진 정액을 37℃의 가온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하였다. 채취된 원정액은 Androhep plus, BTS(Beltsville Thaw Solution), Modena, Seminark 및 Vitasem LD 총 5개의 액상 정액보존액과 1:1의 비율로 1차 희석한 다음, 각각의 보존액을 이용하여 정자의 농도가 30><106 spermatozoa/ml이 되도록 2차 희석을 실시하였다.
- 활력을 측정하였다. 정자의 생존율 검사를 위해서는 SYBR-14와 propidium iodide(PI)로 구성되어 있는 Live/Dead kit(Mawvell과 Johnson, 1997)를 이용흐]j 정자를 형광염색하는 방법을 사용하였으며, Flow-cytometry (FACS ARIA, B.D., Sanzose Ca., USA)를 이용해 형광의 발현차를 분석하였다.
- 정자의 운동성, 생존성 및 체외수정 능력에 대한 액상 정액 보존액의 종류와 보존 기간의 영향을 평가하기 위해서 듀록종 수퇘지 3두에서 채취된 원정액을 개체별로 각각 5개의 용기에 나누어 담은 후 실험대상인 5개 보존액(Androhep plus, BTS, Modena, Seminark 및 Vitasem LD)과 희석을 실시하였다 이때 1차적으로 1:1 희석을 실시한 후, 각각의 보존액을 이용하여 정자의 농도가 30x 106 spermatozoa/ml가 되도록 2차 희석을 실시하였다. 희석을 마친 정액은 17℃ 액상 정액 보관고에서 10일 동안 보관하면서 1, 3, 5 및 10일차에 보관된 액상 정액의 정자 운동성 (CASA)교 생존성 (flow-cytometry)을 즉정하였으며, 보관 3일 및 10일차의 액상 정액을 이용해 체외수정을 실시한 후 상실배(moluar)와 배반포(blastocyst)까지의 발달율을 검사하는 방법으로 체외 수정률을 즉 정하였다 N
- 02% BSA(Sigma A-6003)가 첨가된 mTBM 소적으로 옮겼다. 정자의 최종농도를 2x 106 spermatozoa/ml로 맞준 다음' 난자가 들어있는 체외수정용 소적에 정자를 투입하여 체외수정을 한 후 인큐베이터 내에서 5% CCh, 39℃ 온도 조건으로 배양을 실시하였다. 배양 6시간 후 수정된 난자 주위에 붙어 있는 난구세포와 정자를 제거한 다음 PZM-3(108 mM NaCl, 10.
- 채취된 난자는 실체현미경 하에서 세포질이 균질하고 난구세포가 균일한 난자만을 선별하여 난자 체외성숙용 배양액 (TCM-199; Gibco-BRL, Grand Island, NYZ USA)으로 수회 세척 후 성숙배양을 실시하였다. 난자의 체외성숙은 기본배양액 TCM-199 에 10% pFF(porcine follicular fluid), 5 ug/ml LHZ 0.
- 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였으며, 정액 필터를 통해 1차적으로 걸러진 정액을 37℃의 가온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하였다. 채취된 원정액은 Androhep plus, BTS(Beltsville Thaw Solution), Modena, Seminark 및 Vitasem LD 총 5개의 액상 정액보존액과 1:1의 비율로 1차 희석한 다음, 각각의 보존액을 이용하여 정자의 농도가 30><106 spermatozoa/ml이 되도록 2차 희석을 실시하였다. 희석을 마친 액상 정액은 시험에 이용될 때까지 17℃ 액상 정액 보관고에서 보관하였다.
- 희석을 마친 정액은 17℃ 액상 정액 보관고에서 10일 동안 보관하면서 1, 3, 5 및 10일차에 보관된 액상 정액의 정자 운동성 (CASA)교 생존성 (flow-cytometry)을 즉정하였으며, 보관 3일 및 10일차의 액상 정액을 이용해 체외수정을 실시한 후 상실배(moluar)와 배반포(blastocyst)까지의 발달율을 검사하는 방법으로 체외 수정률을 즉 정하였다 N
대상 데이터
- Qiemical Co.(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 액상 정액 보존액 제조용 희석제는 Androhep plus(Minitube of America. INC, USA), BTS(KRUUSE), Mo-dena(Cambridge, IA 50046 USA), Seminark(Noah Biotech., Korea), Vitasem LD(Magapor S.L., Spain) 등 총 5종류를 사용하였다.
- 농촌진흥청 국립축산과학원 양돈과에서 사육중인 듀록종 수퇘지 3두가 시험을 위한 공시동물로 이용되었다. 정액의 채취는 의빈대를 이용한 수압법을 이용하였으며, 정액 필터를 통해 1차적으로 걸러진 정액을 37℃의 가온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하였다.
- 도축장에서 도살된 암퇘지로부터 난소를 회수하여 30~35℃의 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하여 직경 2~6 mm 난포로부터 18 게이지 주사침이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난자를 채취하였다. 채취된 난자는 실체현미경 하에서 세포질이 균질하고 난구세포가 균일한 난자만을 선별하여 난자 체외성숙용 배양액 (TCM-199; Gibco-BRL, Grand Island, NYZ USA)으로 수회 세척 후 성숙배양을 실시하였다.
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체외수정 및 체외배양
체외수정을 위한 기본배양액은 mTBM(113.1 mM Na-Cl, 3 mM KC1, 7.5 mM CaQseHzO, 11 mM glucose, 5 mM pyruvic add, 0.57 mM L-cysteine, 20 mM Tris, 20 mM penicillin G, 3.4 mM streptomycin sulfate)을 사용하였다. 성숙된 난자는 0.
데이터처리
- 실험에서 얻어진 결과는 SAS 9.1 을 이용하여 최소 유의차 검정(Least Significant test; LSD test)과 General linear model(GLM)을 적용하여 Duncan의 multiple range test에 의하여 유의차(p<0.05)를 검정하였다.
성능/효과
- 나타났다. 또한, 정지*의 생존성의 경우는 시험에 이용된 모든 보존액에서 10일차까지 높은 수준의 생존율을 나타내는 것으로 확인되어 단기 보존액으로 알려진 보존액의 경우도 장기 보존액으로 알려진 보존액과 유사한 수준의 양호한 액상 정액 보관능력을 가지고 있는 것으로 사료된다.
- 정자의 생존성을 분석한 결과, 모든 액상 정액보존액에서 차이를 보이지 않았으며, 보관 10일차까지 모든 보존액에서 65% 이상의 생존성을 유지하고 있는 것으로 확인되었다 (Table 2). 보존액 종류와 보존 기간에 따른 정자의 수정 능력을 평가하기 위해서 체외수정 후 상실배 (rnoluar) 와 배반포(blastocyst)까지 발달한 난자의 비율을 검토한 결과, 정자의 체외수정 능력에 대한 보존액 종류 및 보존 기간에서의 차이는 관찰되지 않았다 (Fig. 2).
- 시판 중인 5개 보존액으로 각각 희석한 돼지 정액 샘플의 운동성은 정액의 보관일자(1~10일차)가 연장됨에 따라 점차 감소하는 경향을 보였다. 보관 5일차까지 Androhep plus에서 보관된 정액의 경우 타 보존액에 비해 운동성이 낮게 나타났지만(p<0.
- 이와 관련하여 Boe-Hansen 등(2005)은 보존액에 따른 정자의 생존성이 수퇘지 품종에 따라 영향을 받는다고 보고한 반면, Marco 등(2006)은 품종에 따른 차이를 발견할 수 없다고 보고하였다. 우리의 실험 결과에서 단기 보존액으로 알려진 BTS에서조차 보관 10일차까지 66.5%의 정자생존성이관찰되어 정자생존성은 보존액의 종류에 따른 영향을 받지 읹7는 것으토 사료되다
- , 2004). 우리의 실험에서 17莒 보관고에 보관했던 액상 정액을 37℃ 항온 수조에서 30분 동안 가온한 후 보존액별로 운동성을 측정하였는데, 그 결과 장기 보존액으로 알려진 Androhep에서 운동성이 낮게 나타났다. 이는 17℃ 에 보관되었던 정액이 적정한 정자운동성을 회복하는데 필요한 가온시간이 보존액마다 다르기 때문일 것으로 추측된다.
- Britt 등(1999)은 60% 이하의 운동성을 가진 정자에서 수정율 저하를 보고하였으며, Johnson 등(2000)은 60% 이상의 정자운동성이 적절한 수태를 위해 필수적이라고 보고하였다. 우리의 연구에서 정자의 운동성은 희석정액의 보관 기간이 연장됨에 따라 감소하는 경향을 보였다 우리의 예상과 달리 장기 보존액으로 알려진 Androhep에서 보관 5일차까지 운동성이 낮게 나타났지만, 대부분의 다른 보존액의 경우 서로 간에 운동성 차이를 보이지 않았으며, 보관 5일차까지 60% 이상의 정자운동성이 관찰되었다. 한편, 흥미롭게도 단기 보존액으로 알려진 BTS의 경우, 시험의 전 구간에 걸쳐 양호한 수준의 정자운동성을유지시키는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과를 종합하면, 인공수정용 액상 정액을 보존하기 위해 사용되는 보존액 중 단기(short&rm) 보존액으로 알려진 보존액의 경우도 장기(long-tenn) 보존액으로 알려진 보존액과 비교해 정자의 운동성, 생존성 및 체외수정 능력에서 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다. 또한, 정지*의 생존성의 경우는 시험에 이용된 모든 보존액에서 10일차까지 높은 수준의 생존율을 나타내는 것으로 확인되어 단기 보존액으로 알려진 보존액의 경우도 장기 보존액으로 알려진 보존액과 유사한 수준의 양호한 액상 정액 보관능력을 가지고 있는 것으로 사료된다.
- 05), 타 보존액들 사이에서는 정자운동성에 대한 유의적인 차이가 관찰되지 않았다(Table 1). 정자의 생존성을 분석한 결과, 모든 액상 정액보존액에서 차이를 보이지 않았으며, 보관 10일차까지 모든 보존액에서 65% 이상의 생존성을 유지하고 있는 것으로 확인되었다 (Table 2). 보존액 종류와 보존 기간에 따른 정자의 수정 능력을 평가하기 위해서 체외수정 후 상실배 (rnoluar) 와 배반포(blastocyst)까지 발달한 난자의 비율을 검토한 결과, 정자의 체외수정 능력에 대한 보존액 종류 및 보존 기간에서의 차이는 관찰되지 않았다 (Fig.
후속연구
- 이는 17℃ 에 보관되었던 정액이 적정한 정자운동성을 회복하는데 필요한 가온시간이 보존액마다 다르기 때문일 것으로 추측된다. 따라서, 17℃ 온도 조건하에서 보관 중인 정 액의 운동성에 영향을 미치는 요인에 대한 검토와 보존액별 적정 가온필요 시간 등에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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