포유동물 수정란의 동결보존기술은 최근 기후 변화에 따른 생물종 다양성을 보존하기 위해서 중요하게 여겨지는 연구 분야이다. 따라서 멸실 위험에 처한 동물의 개량과 증식, 보존과 복원 및 생명공학의 분야에 이르기까지 응용 기술은 다양하게 이용되어진다. 본 연구에서는 한우 수정란의 동결 후 생존성 향상을 위해서 동결 방법에 따른 체내 외수정한의 내동성을 조사하였다. 완만동결에 따른 체내 외수정란의 동결 융해 후 수정란의 재확장률은 89.6%와 81.5% 그리고 72시간 배양하였을 때 부화된 수정란은 76.9%와 43.4%, 생존수정란의 총세포수는 136${\pm}$3.6개와 107${\pm}$3.8개의 결과를 보여 동결 융해 후 생존율에서는 차이를 보이지 않았으나, 수정란의 부화율과 세포수 조사에서는 체내수정란이 유의적으로(p<0.05) 높은 결과를 보였다. 체내수정란의 완만동결 후 배반포 회복률은 91.3% 그리고 12시간 이상 배양하였을 때 확장배반포까지의 발달률은 71.4%의 결과를 보였으며, 초자화 동경에서는 85.7%와 75.0%의 결과를 보였다. 결과적으로 본 연구에서 수행된 체내 외 수정란의 동결기술을 이용한다면 수정란이식 현장에서도 효과적인 활용이 가능할 것으로 사료된다.
포유동물 수정란의 동결보존기술은 최근 기후 변화에 따른 생물종 다양성을 보존하기 위해서 중요하게 여겨지는 연구 분야이다. 따라서 멸실 위험에 처한 동물의 개량과 증식, 보존과 복원 및 생명공학의 분야에 이르기까지 응용 기술은 다양하게 이용되어진다. 본 연구에서는 한우 수정란의 동결 후 생존성 향상을 위해서 동결 방법에 따른 체내 외수정한의 내동성을 조사하였다. 완만동결에 따른 체내 외수정란의 동결 융해 후 수정란의 재확장률은 89.6%와 81.5% 그리고 72시간 배양하였을 때 부화된 수정란은 76.9%와 43.4%, 생존수정란의 총세포수는 136${\pm}$3.6개와 107${\pm}$3.8개의 결과를 보여 동결 융해 후 생존율에서는 차이를 보이지 않았으나, 수정란의 부화율과 세포수 조사에서는 체내수정란이 유의적으로(p<0.05) 높은 결과를 보였다. 체내수정란의 완만동결 후 배반포 회복률은 91.3% 그리고 12시간 이상 배양하였을 때 확장배반포까지의 발달률은 71.4%의 결과를 보였으며, 초자화 동경에서는 85.7%와 75.0%의 결과를 보였다. 결과적으로 본 연구에서 수행된 체내 외 수정란의 동결기술을 이용한다면 수정란이식 현장에서도 효과적인 활용이 가능할 것으로 사료된다.
The objective of this study was to evaluate the efficiency of the conventional slow freezing and vitrification methods for cryopreserving in vivo and in vitro-produced bovine embryos. Morphology of post-thawed embryos was evaluated and normal embryos were used for successive culture for 72 h. In exp...
The objective of this study was to evaluate the efficiency of the conventional slow freezing and vitrification methods for cryopreserving in vivo and in vitro-produced bovine embryos. Morphology of post-thawed embryos was evaluated and normal embryos were used for successive culture for 72 h. In experiment I, In embryo viability, There was no significant differences in blastocyst re-expansion rates were found between in vivo and in vitro embryos(89.6% vs. 81.5%). whereas hatched-BL and total cell number rates was significantly higher (p<0.05) for in vivo-derived embryos (76.9%, 136${\pm}$3.6 vs. 43.4%, 107${\pm}$3.8). In experiment II, There was no significant differences in blastocyst re-expansion and Expansion-BL rates were found between in slow freezing and vitrification methods (91.3% vs. 85.7% and 71.4% vs. 75.0%, respectively). in conclusion, These results suggested that the field application for bovine embryo transfer is in part supported by improvements of technologies in embryo conventional slow freezing and vitrification cryopreservation.
The objective of this study was to evaluate the efficiency of the conventional slow freezing and vitrification methods for cryopreserving in vivo and in vitro-produced bovine embryos. Morphology of post-thawed embryos was evaluated and normal embryos were used for successive culture for 72 h. In experiment I, In embryo viability, There was no significant differences in blastocyst re-expansion rates were found between in vivo and in vitro embryos(89.6% vs. 81.5%). whereas hatched-BL and total cell number rates was significantly higher (p<0.05) for in vivo-derived embryos (76.9%, 136${\pm}$3.6 vs. 43.4%, 107${\pm}$3.8). In experiment II, There was no significant differences in blastocyst re-expansion and Expansion-BL rates were found between in slow freezing and vitrification methods (91.3% vs. 85.7% and 71.4% vs. 75.0%, respectively). in conclusion, These results suggested that the field application for bovine embryo transfer is in part supported by improvements of technologies in embryo conventional slow freezing and vitrification cryopreservation.
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문제 정의
수정란의 동결과 융해에 따른 생존율 개선을 위해서 많은 연구자들이 연구를 수행 등, 1996; Vajta 등, 1998; Lane 등, 1999; Cho 등, 2002; Misumi 등, 2003; Cremades 등, 2004;Kuwayama 등, 2005)하였으며, 특히 난자와 수정란의 초 자화 동결 시 다양한 기구들을 활용하여 연구를 진행하기도 하였다 (Rios 등, 2010). 따라서 본 연구는 소 체내 . 외에서 생산된 수정란의 동결성 비교를 통한 산업적 활용의 기초 자료를 얻기 위해서 실시하였다.
따라서 본 연구는 소 체내 . 외에서 생산된 수정란의 동결성 비교를 통한 산업적 활용의 기초 자료를 얻기 위해서 실시하였다.
제안 방법
1% PVA(polyvinyl alcohol)가 첨가된 D-PBS(Sigma) 배양액에서 약 10초간 vortexing 후 수정 배양액인 50“1 Ⅳ.F 100 (IFP, Japan) 50 1 미소적에 약 20개의 체외성숙된 난포란 과 정자를 공동 배양하여 38.5℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 체외수정을 유도하였다.
Ⅳ.MD(IFP, Japan)와 난구세포로 공동 배양을 2일간 실시하였으며, 그 이후CRlaae 배양액에 0.3% Bovine Serum Albumin(Sigma, U.S.A)를 첨가하여 7, 8, 9일까지 배 양하였다. 배양액 교환은 2일째 4일째, 6일째 3회 실시하였다.
5% (53/65)의 결과를 보였으나, 두 처리군간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 확장된 수정 란 중에서 수정 란이 부화된경우는 체내수정란을 96시간까지 배양하였을 때 부화된 수정란을 조사하였다. 체내수정란은 76.
그 후 -35 ℃ 까지 동결 시킨 후 액체질소에 침지하여 1개월 이상 보관한 다음 생존율 실험에 공시하였다. 동결수정란의 융해는 37℃로 가온된 HEPES- Buffer 배양액에서 스트로우를 융해한 후 동일한 배양액에서 3회 이상 세척한 다음 인큐베이터에서 수정란 배양을 통한 생존율 평가를 실시하였다. 수정란 초자화동결은 VSl(10% Glycerin, 0.
25 mg, 6회째에 15 mg을 근육주사하였고,CIDR을 제거하였다. 발정징후를 나타내는 공란우는 12시간 간격으로 2회 인공수정을 실시하였다, 인공수정 후 7일째 비외과적인 방법으로 수정란을 채란하여 수정란 동결 실험에 공시하였다.
A)를 첨가하여 7, 8, 9일까지 배 양하였다. 배양액 교환은 2일째 4일째, 6일째 3회 실시하였다. 수정란 배양 조건은 38.
5℃ 온도에서 5% CO2, 5% O2 그리고 90% 질소가 포함된 배양 조건에서 수정란을 배양하였다. 분할률은 체외수정 후 48시간에 확인하였으며, 3일과 5일째 신선한 배양액으로 배양액 교환을 하였으며, 수정란은 수정 후 7~9일째 생산된 배반포 수정란을 실험에 공시하였다.
동결 수정란보관은 최소 2주간 이상 보관을 실시하였다. 수정 란 융해 후 생존율 확인을 위하여 스트로우를 보관고에서 꺼내어 공기 중에 약 10 초간 노출 시킨 후 37℃로 가온된 HEPES-Buffer 배양액에 직접 침지 후 0.13 M sucrose 첨가 배 양액에서 4분간, 0.075 M sucrose에서 5분 동안 처리 후 체외배양액으로 옮겨 1회 세척한 다음 배 양 48시 간과 72시간에 수정 란의 재 확장 및 부화 여부로 생존성을 판단하였다.
동결수정란의 융해는 37℃로 가온된 HEPES- Buffer 배양액에서 스트로우를 융해한 후 동일한 배양액에서 3회 이상 세척한 다음 인큐베이터에서 수정란 배양을 통한 생존율 평가를 실시하였다. 수정란 초자화동결은 VSl(10% Glycerin, 0.1 M glucose, 0.1 M sucrose, poly ethylene glycol(PEG) 1%)에서 5분간 처리 후 VS2(10% glycerin, 10% EG, 0.2 M glucose, 0.2 M Sucrose, PEG 2%)에서 5분, VS3(10% glycerin, 30% EG, 0.3 M glucose, 0.3 M sucrose, PEG 3%)에서 1 분간침지 후 0.25 ml 스트로우에 장착 후 액체질소 위에서 10 초간냉각 후 액체질소에 침지하여 수정란을 동결하였다. 그리고open pulled straw는 가는 유리관을 이용하여 약 2.
A)를 이용하였다. 수정란은 0.25 ml 스트로우에 장착한 후 스트로우 양끝에는 D.PBS 층과 공기층을 형성하고 동결보호제와 수정 란이 혼합된 부분이 스트로우 중간에 위치하게 한 다음 스트로우를 동결기의 chamber에 넣고 약 3 분간 정치(-7℃, 10분간)한 후, 구리선이 감겨진 핀셋을 이용하여 식빙(seeding)을 실시하였다. 그 후 -35 ℃ 까지 동결 시킨 후 액체질소에 침지하여 1개월 이상 보관한 다음 생존율 실험에 공시하였다.
체내수정란 생산을 위해서 한우 공란우의 처리는 발정발현과 무관하게 progesterone releasing intravaginal device CIDR (CIDR-plus, InterAg, New Zealand)을 질 내에 삽입하고 CIDR 삽입 7~8일째부터 FSH(Antorin R-10, Kawasaki, Japan) 28AU를 감량법으로 12시간 간격으로 4일간 나누어서 근육주사를 실시하였으며, FSH 투여량은 5회째에 PGFza 제제인 Lu- talyse(Belgium)25 mg, 6회째에 15 mg을 근육주사하였고,CIDR을 제거하였다. 발정징후를 나타내는 공란우는 12시간 간격으로 2회 인공수정을 실시하였다, 인공수정 후 7일째 비외과적인 방법으로 수정란을 채란하여 수정란 동결 실험에 공시하였다.
대상 데이터
9% 생리식염수의 온도를 25℃ 조건으로 맞추어 보온병에 담아 실험실로 2시간 이내로 운반하였다. 직경이 2~6 mm의 난포로부터 난포란을 난포액과 함께 18 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입 방법으로 난모세포를 채취하였다. 난포란의 선별은 실체현미경하에서 체외성숙을 위한 난모세포는 난구세포가 치밀하고 세포질이 균일한 1, 2등급(IETS 기준)만을 사용하였다.
한우 도축 암소로부터 적출된 난소를 회수하여 실험실로 운반하여 실험에 공시하였다. 본 실험의 조건에 맞춘 난소 수송온도는 0.
데이터처리
수정란의 동결 후 체내 및 체외수정란의 생존율 조사에 대한 결과 비교는 Chi-square Test 방법을 이용하여 유의성 검정 3<0.05)을 실시하였다.
성능/효과
실험에 공시된 체내 및 체외수정 란은 인공수정 후 7일째 생산된 배반포기 및 확장 배반포기 수정란을 사용하였다. 본 실험에서는 29개의 수정란을 사용하여 수정란이 재확장된 비율은 89.6%(26/29), 체외수정란의 81.5% (53/65)의 결과를 보였으나, 두 처리군간의 유의적인 차이는 보이지 않았다. 그러나 확장된 수정 란 중에서 수정 란이 부화된경우는 체내수정란을 96시간까지 배양하였을 때 부화된 수정란을 조사하였다.
7%의 결과를 보고하였다. 본 실험의 결과와 비교하였을 때보다는 다소 높은 경향을 보였으나, 혈청이 첨가된 그룹에서는 75%(48/65) 생존율과 50%(32/64)의 부화율을 보였다. 본 실험에서도 혈청이 첨가되지 않은 배양 시스템을 활용하였다.
체내수정란으로 완만동결을 실시 후 융해하였을 때 수정란의 배반포로의 재확장률은 91.3%의 결과를 보였으며, 이들 수정란을 48시간 이상 배양하였을 때 수정란의 확장배반포율은 71.4%의 결과를 보였으며, OPS 방법에 따른 수정란의 동결성 조사에서 재 확장률은 85.7%였으며, 재확장 수정 란 중에서 확장배 반포까지 발달한 수정 란은 75%의 결과를 나타내었으나, 완만 동결법과 OPS 동결 방법 간에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 수정란의 동결성을 향상 시키기 위해서는 무엇보다도 수정란에 대한특징을 잘 이해하고 있어야 하며, 발달 단계에 따른 수정란의객관적인 선별 기준을 갖추고 있어야 한다(Niemann, 1991; Rail, 1992; Leibo and Loskutofe 1993; Massip 등, 1 으95).
후속연구
최근에는 체외수정란 생산 기술이 향상되어 서로 다른 배 양 조건하에서 다양한 배양액 조성을 통해서 성공적 인 효과를 거두는 것으로 보고하고 있다(Gray 등, 1992). 체외수정란의 안정적인 생산 시스템은 유전 자원의 활용성 제고를 위해서 더 많은 연구가 수행되어야 할 것이며, 특히 수정란이식을 위해서는 우수한 유전력을 지닌 개체 또는 멸실 위험 축종에 대한 유전자원의 확보를 위하여 생체 내 난자 채취 (Ovum Pick Up) 및 도축 난소 이용 개체식별로 우수한 혈통 보유축에 대한 체외수정란을 생산하기 위해서도 배양 체계에 대한 연구는 지속적으로 연구가 수행되어져야 할 것이다.
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