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제안 방법
- 이 반응액을 TLC plate (Merck, Silica gel F254)에 10 µl씩 점적하여 butanol-propanol-acetic acid-water(5 : 3 : 3 : 1.5,v/v/v/v) 혼합용매를 통해 전개한 후 aniline-diphenylamine reagent로 발색하여 glucose의 생성 정도에 따라 α-glucosidase 효소원내에 존재하는 α-glucosidase 중에서 maltase 저해능이 우수한 균주를 선발하였다.
- α-Glucosidase 효소원 내의 maltase, sucrase, cellobiase 및 lactase 등 disaccharidase 들의 효소 활성은 TLC 분석을 통해 같은 방법으로 확인하였다.
- 전기영동 후 동일한 효소원을 대상으로 전개한 gel를 양분하여 한쪽은 Coomassie brilliant blue R-250으로 단백질 염색을 실시하였고, 다른 한쪽은 2.3 mM 4-methylumbelliferyl-α-D-glucose를 기질로 효소반응 시킨 후 ultraviolet transilluminator를 이용하여 α-glucosidase 존재여부를 확인하였다.
- 돼지소장으로부터 얻어진 α-glucosidase 효소원을 전기영동하여 단백질을 분리하고 기질-효소 반응을 통해 αglucosidase의 존재를 확인하였다.
- Maltose 분해 억제능이 우수한 균주들을 대상으로 각 균배양액을 HPLC (ThermoQuest Co., U.S.A.)로 분석하여 균의 DNJ 생산 여부를 조사하였다. HPLC 분석을 위한 시료 조제는 다음과 같이 준비하였다.
- 생화학적 동정으로는 API 50 CHB® Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 균의 탄소원 이용능을 분석하였고, gas chromatography (HP 6890, U.S.A.)로 세포내 지방산을 분석하였고 그리고 HPLC를 이용하여 quinone을 분석하였다[13].
- 최종 선발된 균주는 다양한 생화학적 및 분자생물학적 방법에 의해 균주 동정을 하였다. 생화학적 동정으로는 API 50 CHB® Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 균의 탄소원 이용능을 분석하였고, gas chromatography (HP 6890, U.
- )로 세포내 지방산을 분석하였고 그리고 HPLC를 이용하여 quinone을 분석하였다[13]. 분자생물학적 동정으로는 균의 16S rDNA의 염기서열을 비교하였으며 주사전자현미경(JSM-5600, Japan)에 의해 분리균주의 형태 및 크기를 관찰하였다.
- 3) DNJ 생산성이 높은 Bacillus 속의 한 개 균주를 최종 목적균주로 선발하였다. DNJ를 체액 중에 고농도로 함유하고 있는 것으로 알려진 누에(Bombyx mori L.)의 종명에 근거하여 MORI 균주로 명명하였으며 아래 기술한 일련의 동정을 실시하였다(Fig. 4).
- 최종 선발한 MORI 균주에 대한 생화학적 및 분자생물학적 동정을 하였다. 먼저 API kit를 이용한 49 종류의 당 기질에 대한 이용능 시험(Table 1)과 이에 대한 API 분석프로그램(Biomerieux, France)의 동정 결과, MORI 균주는 Bacillus속에 속하는 균주로 확인되었고, 광학현미경상에서 Bacillus균의 형태적 특징인 포자형성이 관찰되었다.
- 실험결과 한국전통식품인 청국장으로부터 α-glucosidase 저해능이 높고 DNJ 생산능이 우수한 한 개의 균주를 선발하였다. 이 균주의 동정을 위하여 API kit에 의한 균의 당 이용능 분석, HPLC와 GC에 의한 균체의 quinone 및 지방산 분석 등과 함께 균의 16S rDNA 염기서 열을 분석하였으며 주사전자현미경에 의해 균주의 형태적 특성을 관찰하였다. 그 결과 본 연구를 통해 선발한 균주는 건강기능성식품 개발 등에 적용할 수 있는 GRAS에 속하는 균주임을 확인하여 B.
- 각각의 균주들은 1% glucose, 0.5% soybean meal, 0.3% yeast extract가 함유된 25 ml 액체배지에서 37℃, 150 rpm으로 5일간 진탕배양 하였고, 100℃에서 배양액을 5분간 열처리한 후 원심분리(9,200×g, 10 min)하여 얻어진 상등액을 α-glucosidase의 효소활성 저해능 검토를 위한 시료로 사용하였다.
- 이 상등액에 80% ammonium sulfate를 첨가하여 단백질들을 침전시킨 후 원심분리(9,200×g, 20 min)하여 얻은 침전물을 투석막(M.W. 12,000 Da)(Sigma, USA)을 이용하여 4℃에서 12시간 동안 탈염한 후 -70℃에서 동결 건조하여 α-glucosidase 효소원으로 사용하였다.
- 전개가 끝난 TLC plate는 60℃ oven에서 완전히 건조한 후 anilinediphenylamine reagent (2 ml aniline, 2 g diphenylamine, 10 ml 85% phosphoric acid, 100 ml methanol)를 분사하고 104℃에서 30분간 발색하여 glucose의 생성여부를 확인하였다.
- DNJ 생산균주 선발은 해당 균주 배양액이 첨가된 αglucosidase 효소반응액을 TLC로 분석한 결과 우선 αglucosidase 저해활성에 의해 glucose의 생성량이 대조군에 비하여 적거나 혹은 생산이 되지 않는 균주들을 1차적으로 선발하였다.
대상 데이터
- 균주의 선발기준은 α-glucosidase의 효소활성을 저해함과 동시에 DNJ를 생산하는 균주로 하였으며, α-glucosidase inhibitor를 생산하는 표준균주로 Bacillus subtilis (KCCM 11314), Bacillus amyloliquefaciens (KCCM 40764), Streptomyces subrutilus (KCCM 40337), Streptomyces lavendulae 3균주 (KCCM 32799, KCCM 12294, KCCM 12293) 및 Streptomyces nojiriensis (KCCM 12307) 등을 사용하였다.
- 30여 균주들과 된장, 청국장 등 한국전통식품들에서 분리한 Bacillus sp. 200여 균주들을 사용하였다. 각각의 균주들은 1% glucose, 0.
- Column은 Phenomenex Luna C18 (4.60×250 mm I.D., 5-µm)을 사용하였고, 용매로 acetonitrile-0.1% acetic acid (1 : 1, v/v)를 사용하여 용출하였으며, 용출속도는 1 ml/min, 검출기는 FL3000 fluorescence detector (excitation 254 nm, emission 322nm), 분석 프로그램은 ChromQuestTM (ThermoQuest Co., USA)을 각각 사용하였다.
- Polyhydroxylated alkaloids의 표준시료로서 DNJ는 Sigma 사로부터 구매한 표준품을 사용하였으며, 그 밖에 2-O-α-Dgalactopyranosyl-1-deoxynojirimycin, 1,4-dideoxy-1,4-iminoD-arabinitol, 1,4-dideoxy-1,4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl) -D-arabinitol, fagomine, 3-epi-fagomine, calystegin B2 그리고 N-methyl-1-deoxynojirimycin 등은 농촌진흥청 농업생물부 활성물질연구실로부터 분양받아 사용하였다[9].
- 이렇게 선발된 균주들 가운데 한국전통식품인 청국장으로부터 분리되었으며 α-glucosidase 활성 저해능이 가장 우수하고(Fig. 3) DNJ 생산성이 높은 Bacillus 속의 한 개 균주를 최종 목적균주로 선발하였다.
- 4 균주와 Bacillus sp. 10 균주를 후보 균주로 선발하였다. 이렇게 선발된 균주들 가운데 한국전통식품인 청국장으로부터 분리되었으며 α-glucosidase 활성 저해능이 가장 우수하고(Fig.
- 200여 균주들로부터 αglucosidase 의 활성을 저해하고 동시에 DNJ를 생산하는 유용균주를 선발하였다.
이론/모형
- 12,000 Da)(Sigma, USA)을 이용하여 4℃에서 12시간 동안 탈염한 후 -70℃에서 동결 건조하여 α-glucosidase 효소원으로 사용하였다. 효소원 내의 단백질 함량은 Bradford의 방법[12]에 의해 정량하였다.
- 돼지소장으로부터 얻어진 α-glucosidase 효소원을 전기영동하여 단백질을 분리하고 기질-효소 반응을 통해 αglucosidase의 존재를 확인하였다. 전기영동은 Davis 법[5]에따라 Native-PAGE 하였으며, 7.5% polyacrylamide gel을 사용하였다. 전기영동 후 동일한 효소원을 대상으로 전개한 gel를 양분하여 한쪽은 Coomassie brilliant blue R-250으로 단백질 염색을 실시하였고, 다른 한쪽은 2.
- and related bacteria. The tree was constructed by using the neighbor-joining method based on partial 16S rDNA sequences. The scale bar indicates the 0.
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