[논문]Proteus vulgaris에서 유래한 리파아제의 고정화 및 바이오디젤 생산

윤신아; 한진이; 김형권

Proteus vulgaris에서 유래한 리파아제의 고정화 및 바이오디젤 생산
Production of Biodiesel Using Immobilized Lipase from Proteus vulgaris 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.39 no.3, 2011년, pp.238 - 244

윤신아 (가톨릭대학교 생명공학과) , 한진이 (가톨릭대학교 생명공학과) , 김형권 (가톨릭대학교 생명공학과)

초록
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바이오디젤은 긴 사슬 지방산의 알킬 에스테르로서 동물성 지방 또는 식물성 오일과 알코올이 반응하여 에스테르 교환 반응에 의해 생성되는 대체연료이다. 지난 십여 년 동안, 다양한 리파아제를 이용한 바이오디젤 생산에 대해 연구되었다. 하지만 효소 촉매 공정을 통한 바이오디젤 생산의 경우, 높은 효소 단가로 산업적 공정에 쉽게 적용할 수 없었다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 저렴한 오일 원료를 선택하거나, 바이오디젤 생산에 적합한 리파아제를 스크리닝하는 과정 또는 리파아제 고정화 방법이 활발히 연구되었다. 이번 연구에서는 P. vulgaris에서 유래한 리파아제 K80을 E. coli균에서 발현하여 얻은 효소액으로 바이오디젤을 생산하였다. 재조합 리파아제 K80은 높은 발현량을 보였으며, 높은 가수분해 반응의 비활성도(specific activity)와 유기용매에서 높은 안정성을 확인했다. 리파아제 K80은 올리브 오일과 메탄올을 3-stepwise 방법을 이용하여 바이오디젤을 생산할 수 있었다. 리파아제 K80을 소수성 결합을 이용하여 담체 표면에 흡착시켜 얻은 고정화 K80을 이용하여 수용성 리파아제 K80과 동일한 방법으로 바이오디젤을 생산한 결과, 효율적으로 바이오디젤 생산을 확인했다. 고정화 K80은 다양한 식물성 오일과 메탄올을 사용하여 효과적으로 바이오디젤을 생산하였다. 고정화 K80을 이용하여 바이오디젤 생산뿐만 아니라 다른 산업적 공정에서도 활용할 수 있을 것으로 기대한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Biodiesel, mono-alkyl esters of long chain fatty acids, is one of the alternative fuels derived from renewable lipid feedstock, such as vegetable oils or animal fats. For decade, various lipases have been used for the production of biodiesel. However, the production of biodiesel by enzymatic catalyst has profound restriction in industry application due to high cost. To overcome these problems, many research groups have studied extensively on the selection of cheap oil sources, the screening of suitable lipases, and development of lipase immobilization methods. In this study, we produced biodiesel from plant oil using Proteus vulgaris lipase K80 expressed in Escherichia coli cells. The recombinant lipase K80 was not only expressed in high level but also had high specific lipase activity and high stability in various organic solvents. Lipase K80 could produce biodiesel from olive oil by 3-stepwise methanol feeding method. The immobilized lipase K80 also produced biodiesel using the same 3-stepwise method. The immobilized lipase could produce biodiesel efficiently from various plant oils and waste oils.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

coli에서 발현한 결과 매우 높은 리파아제 활성을 확인할 수 있었다[11, 12, 13]. 본 연구에서는 높은 리파아제 활성을 가진 리파아제 K80을 E. coli에서 대량 발현하여 얻은 효소액을 통해 바이오디젤 생산을 수행하고 흡착법을 통해 고정화된 리파아제 K80을 이용하여 효율적으로 바이오디젤을 생산할 수 있는지 확인하고자 한다.

제안 방법

0-90%농도의 다양한 유기용매와 리파아제 K80을 섞고, 25℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리(10,000×g, 10분, 4℃)를 통해 상등액을 얻었으며, 이 상등액의 효소활성을 pNPC assay를 통해 측정하였다.
반응시간은 총 9시간이었으며, 초기에 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 반응기질로 사용하였다. 3시간, 6시간 후에 각각 메탄올이 최종 몰비가 1:2, 1:3이 되도록 첨가하였다(3 step-wise). 즉, 마이크로 튜브 (Axygen 2 mL tube)에 올리브오일 1 mL과 메탄올(125 µL, 최종부피)을 넣고 섞는다.
0으로 유지되도록 조절하면서 반응을 진행하였다. 5분간 생성된 자유지방산의 양을 pH titrator로 측정하였다(Titrino718, Metrohm). 효소활성 1 unit는 분당 1 µmol의 자유지방산이 생성되기 위해 필요한 효소의 양으로 정의하였다.
고정화 K80을 이용하여 다양한 오일을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브유, 팜유, 해바라기씨유, 콩기름, 청어유와 폐콩기름과 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞고 반응을 진행시켰다.
고정화 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브오일과 메탄올을 반응기질로 하여 최종 몰비가 1:3이 되도록 반응을 진행시켰다.
고정화 K80을 이용하여 올리브유, 팜유, 해바라기씨유, 콩기름, 청어유, 폐콩기름유, 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞은 3-stepwise 반응을 진행시켰다. 9시간 동안 반응을 수행한 후 기체 크로마토그래피로 반응산물을 분석한 결과, 청어유를 제외한 나머지 오일에서 높은 바이오디젤 생성량을 확인 할 수 있었다(Fig.
고정화 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 고정화 K80의 경우에도 앞서 기술한 리파아제 K80 효소액과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 초기 반응기질로 사용하였다.
높은 활성을 가지고 있는 리파아제 K80을 산업적 공정과정에 적용하기 위해 알코올류(메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올)에 대한 리파아제 K80의 안정성을 확인하였다(Fig. 1). 다양한 농도의 알코올용액에 리파아제 K80을 넣고 25℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리를 통해 얻은 상등액의 리파아제 활성을 pNPC assay방법으로 측정하였다.
리파아제 K80 및 고정화 K80의 반응 산물을 분석하기 위해 기체 크로마토그래피(gas chromatography) 분석을 수행하였다. 일정 시간 별로 또는 반응종료 후에 200 µL씩 샘플링하여 핵산과 Decane을 섞은 용액 1 mL을 넣고, 2분간 균일하게 섞어준 후 원심분리하여 추출 상층액 1 µL을 gas chromatography Hewlett-packard 7890 기기에 주입하였다.
리파아제 K80 및 고정화 K80의 반응 산물을 분석하기 위해 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC) 분석을 수행하였다. 일정 시간 별로 또는 반응 종료 후에 200 µL씩 샘플링하여 핵산 1 mL을 넣고 2분간 균일하게 섞어준 후 원심분리(10,000×g, 10분)하여 추출 상층액 10 µL 을 실리카겔 플레이트(TLC silica gel 60 F₂₅₄, Merck)에 가하였다.
올리브오일과 여러 가지 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)을 몰비가 1:1로 되도록 섞고 리파아제 K80을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 진행시켰다. 리파아제 K80을 800 U 만큼 넣고 24시간 동안 반응을 진행한 뒤, 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 반응산물을 분석하였다. 분석결과를 토대로 바이오디젤 생산용 알코올을 선택하였다.
리파아제 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브오일과 메탄올을 반응기질로 하여 최종 몰비가 1:3이 되도록 반응을 진행시켰다.
리파아제 K80의 활성 측정은 크게 두 가지로 나누어서 진행하였다. 첫 번째로, 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다.
반응시간 0, 2, 4시간에 반응상등액 200 µL을 취해 pH STAT방법으로 잔존활성을 확인하였다.
반응시간 0, 3, 6시간에 각각 42 µL의 메탄올을 첨가하였다.
분석 컬럼은 HP-5(Crosslinked 5% PH ME Siloxane, 0.32 mm×30 m)이며, FID 검출기를 통해 지방산 메틸 에스테르 (fatty acid methyl ester)를 분석하였다.
오일과 알코올의 몰비가 1:1이 되도록 올리브오일과 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 각각 섞고 리파아제 K80 을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 24시간 동안 진행하였다. 박층 크로마토그래피를 통해 반응 산물을 확인한 결과 (Fig.
올리브오일과 여러 가지 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)을 몰비가 1:1로 되도록 섞고 리파아제 K80을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 진행시켰다. 리파아제 K80을 800 U 만큼 넣고 24시간 동안 반응을 진행한 뒤, 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 반응산물을 분석하였다.
고정화 K80을 이용하여 다양한 오일을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. 올리브유, 팜유, 해바라기씨유, 콩기름, 청어유와 폐콩기름과 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞고 반응을 진행시켰다. 초기에 고정화 K80 0.
그러나 높은 효소 단가와 반응 공정 시, 효소의 낮은 안정성이 단점이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 효소의 고정화 기술을 도입하였다. 고정화 기술을 통해 재회수하여 다시 반응 공정에 이용함으로써 효소의 단가를 낮출 수 있으며, 효소의 활성 또는 안정성을 증가시킨다[10, 14].
일정 시간 별로 또는 반응 종료 후에 200 µL씩 샘플링하여 핵산 1 mL을 넣고 2분간 균일하게 섞어준 후 원심분리(10,000×g, 10분)하여 추출 상층액 10 µL 을 실리카겔 플레이트(TLC silica gel 60 F254, Merck)에 가하였다.
coli BL21(DE3)균을 접종하고 20℃에서 진탕배양하였다. 재조합 리파아제 K80의 발현을 유도하기 위해, 배양액의 600 nm 파장의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.5로 증가 되었을 때, 배지에 isopropyl-bbb-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 1 mM 농도가 되도록 첨가하고 24시간 동안 20℃ 에서 진탕배양하였다. 배양액 1.
전개용매로 핵산:에틸 아세테이트:아세트산(90:10:1)을 사용하였으며, 발색시약은 메탄올:황산(1:1)을 사용하였다. 전개 후 실리카 플레이트 위에 발색시약을 골고루 뿌린 후 고온에서 가열하여 분석하였다.
리파아제 K80의 활성 측정은 크게 두 가지로 나누어서 진행하였다. 첫 번째로, 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 기질혼합액은 p-nitrophenyl caprylate(10 mM 농도로 아세토니트릴 용매에 녹아 있음), 에탄올, 트리스-염산(Tris-HCl)용액(50 mM, pH 8.
CalB의 바이오디젤 합성반응과 동일하게 3-stepwise 반응을 진행하였다. 초기에 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 반응기질로 사용하였으며, 3시간, 6시간 후에 오일과 알코올의 최종 몰비가 1:2, 1:3으로 되도록 메탄올을 첨가(3step-wise)하고 총 9시간 동안 반응하였다(Fig. 3).
32 mm×30 m)이며, FID 검출기를 통해 지방산 메틸 에스테르 (fatty acid methyl ester)를 분석하였다. 컬럼 분석온도와 시간 조건은 70℃에서 300℃까지 분당 10℃씩 증가시킨 후, 최종시간 3분 동안 분석하여 총 27분 동안 반응산물 피크를 분석하였다.

대상 데이터

E. coli BL21(DE3)을 재조합 단백질의 발현 숙주로 사용하였고, E. coli XL1-Blue를 재조합 플라스미드의 보관 숙주로 사용하였다. 리파아제 K80 유전자가 삽입되어 있는 pKLE 재조합 플라스미드를 발현 벡터로 사용하였다.
고정화 과정에서 쓰인 담체는 한국생명공학연구원에서 공급받았다. Palm oil은 Newpia사, methyl ester linoleic acid는 Fluka사, 메탄올과 에탄올은 Merck사, 그리고 1-프로판올과 n-부탄올은 Junsei사에서 구입하였다. 이 밖의 시약들은 모두 일반 시약급을 사용하였다.
p-Nitrophenyl caprylate(pNPC), methyl ester palmitic acid, methyl ester oleic acid, methyl ester stearic acid, olive oil, soybean oil, sunflower seed oil, Fish oil(menhaden)는 Sigma사에서 구입하였다. Waste soybean oil은 국립 수산과학원에서 제공받았으며, 가정용 폐식용유를 waste cooking oil로 사용하였다. 고정화 과정에서 쓰인 담체는 한국생명공학연구원에서 공급받았다.
2), 메탄올, 에탄올, 부탄올의 경우, 올리브유로부터 바이오디젤이 생성되었고, 1-프로판올의 경우, 바이오디젤이 거의 생성되지 않았다. n-부탄올을 사용하였을 때, 가장 많은 양의 바이오디젤이 생성되었으나, 메탄올이 다른 알코올류에 비해 가장 저렴하며, 바이오디젤 합성 반응에서 가장 많이 쓰이기 때문에 메탄올을 추가적인 연구에 사용하였다.
p-Nitrophenyl caprylate(pNPC), methyl ester palmitic acid, methyl ester oleic acid, methyl ester stearic acid, olive oil, soybean oil, sunflower seed oil, Fish oil(menhaden)는 Sigma사에서 구입하였다. Waste soybean oil은 국립 수산과학원에서 제공받았으며, 가정용 폐식용유를 waste cooking oil로 사용하였다.
Waste soybean oil은 국립 수산과학원에서 제공받았으며, 가정용 폐식용유를 waste cooking oil로 사용하였다. 고정화 과정에서 쓰인 담체는 한국생명공학연구원에서 공급받았다. Palm oil은 Newpia사, methyl ester linoleic acid는 Fluka사, 메탄올과 에탄올은 Merck사, 그리고 1-프로판올과 n-부탄올은 Junsei사에서 구입하였다.
두 번째는 pH stat 방법을 이용하여 리파아제 활성을 측정하였다. 기질혼합액으로 올리브유 에멀젼(1% 올리브유, 1% gum Arabic, 20 mM CaCl₂, 100 mM NaCl)을 사용하였다. 기질혼합액 20 mL의 pH가 8.
첫 번째로, 합성기질을 사용한 효소의 활성 측정을 다음과 같이 수행하였다. 기질혼합액은 p-nitrophenyl caprylate(10 mM 농도로 아세토니트릴 용매에 녹아 있음), 에탄올, 트리스-염산(Tris-HCl)용액(50 mM, pH 8.0)을 1:4:95의 비율로 구성하여 사용하였다. 이 혼합액 1 mL에 소량(~10 µL)의 효소액을 넣고, 빠르게 섞어 주었다.
본 연구에서 사용한 pKLE 재조합 플라스미드는 P. vulgaris K80 리파아제 유전자(GenBank accession number AAB01071)를 발현벡터인 pET-3에 서브클로닝하여 제조한 것이다[11, 12].
리파아제 K80을 800 U 만큼 넣고 24시간 동안 반응을 진행한 뒤, 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)를 이용하여 반응산물을 분석하였다. 분석결과를 토대로 바이오디젤 생산용 알코올을 선택하였다.
고정화 K80의 경우에도 앞서 기술한 리파아제 K80 효소액과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 초기 반응기질로 사용하였다. 3시간, 6시간 후에 메탄올의 최종 몰비가 1:2, 1:3으로 되도록 첨가하였으며, 총 9시간을 반응하여 얻은 결과는 다음과 같다(Fig.
유기용매는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 사용하였다. 0-90%농도의 다양한 유기용매와 리파아제 K80을 섞고, 25℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리(10,000×g, 10분, 4℃)를 통해 상등액을 얻었으며, 이 상등액의 효소활성을 pNPC assay를 통해 측정하였다.
전개용매로 핵산:에틸 아세테이트:아세트산(90:10:1)을 사용하였으며, 발색시약은 메탄올:황산(1:1)을 사용하였다. 전개 후 실리카 플레이트 위에 발색시약을 골고루 뿌린 후 고온에서 가열하여 분석하였다.

이론/모형

리파아제 K80을 이용하여 올리브오일과 메탄올을 바이오디젤로 전환시키는 반응을 수행하였다. CalB의 바이오디젤 합성반응과 동일하게 3-stepwise 반응을 진행하였다. 초기에 올리브오일과 메탄올의 몰비가 1:1로 혼합된 용액을 반응기질로 사용하였으며, 3시간, 6시간 후에 오일과 알코올의 최종 몰비가 1:2, 1:3으로 되도록 메탄올을 첨가(3step-wise)하고 총 9시간 동안 반응하였다(Fig.
Residual activity was measured after 30 min of incubation in the presence of various alcohols. The hydrolytic activity was assayed via the pNPC-spectrophotometric method.
1). 다양한 농도의 알코올용액에 리파아제 K80을 넣고 25℃에서 30분간 방치한 후, 원심분리를 통해 얻은 상등액의 리파아제 활성을 pNPC assay방법으로 측정하였다. 메탄올의 경우, 50%의 농도에서도 높은 활성을 유지하였으며, 60%이상의 농도에서 효소활성이 감소하였다.
담체에 고정된 리파아제 K80의 효소활성을 pH STAT방법으로 측정하여 고정화 수율 (η)과 활성 유지율(R)을 다음 식을 이용하여 계산했다[4].
두 번째는 pH stat 방법을 이용하여 리파아제 활성을 측정하였다. 기질혼합액으로 올리브유 에멀젼(1% 올리브유, 1% gum Arabic, 20 mM CaCl₂, 100 mM NaCl)을 사용하였다.

성능/효과

고정화 K80을 이용하여 올리브유, 팜유, 해바라기씨유, 콩기름, 청어유, 폐콩기름유, 폐식용유를 메탄올과 최종 몰비가 1:3이 되도록 각각 섞은 3-stepwise 반응을 진행시켰다. 9시간 동안 반응을 수행한 후 기체 크로마토그래피로 반응산물을 분석한 결과, 청어유를 제외한 나머지 오일에서 높은 바이오디젤 생성량을 확인 할 수 있었다(Fig. 6). 고정화 K80이 다양한 식물성 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있음을 확인하였다.
Immobilization yield of various microbial lipases. Immobilization yield were measured against P. vulgaris K80 lipase, Photobacterium lipolyticum M37 lipase, Bacillus stearothermophilus L1 lipase, and Staphylococcus haemolyticus L62 lipase.
TLC결과를 통해 반응시간이 진행될수록 올리브오일의 양이 감소하는 것과 바이오디젤의 양이 증가하는 것을 관찰할 수 있으며, 기체 크로마토그래피 분석을 통하여 바이오디젤 생성량이 최대 71%임을 확인했다(Fig. 3B). 분석 결과, 7시간대에 71%의 바이오디젤이 생성되었으나 9시간대에 43%로 감소하였다.
결론적으로, 리파아제 K80은 다른 상업적 리파아제인 CalB 효소보다 메탄올에 대해 훨씬 높은 안정성을 가지고 있었으며, 이러한 특성을 이용하여 바이오디젤을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 담체에 소수성 결합으로 흡착된 고정화된 K80을 이용하였을 때 바이오디젤을 효과적으로 생산할 수 있었다.
6). 고정화 K80이 다양한 식물성 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있음을 확인하였다. 다양한 오일의 성분표(Table 2)를 통해 팔미트산, 올레인 산, 스테아린산, 리놀렌산을 다량 포함하고 있는 대부분의 식물성 오일을 바이오디젤 생산원료로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
2%로 나타났다(Table 1). 담체에 고정화된 K80을 건조시킨 뒤, 최종적으로 제조된 고정화 K80의 활성을 pH stat으로 측정한 결과, 246 U/g이었다. 이것을 기준으로 활성 유지율을 계산한 결과 4.
이것은 리파아제 K80에 의해 생성된 바이오디젤이 효소의 가수분해반응에 의해 다시 지방산으로 전환되기 때문이라고 해석된다. 따라서 메탄올 첨가 후, 1시간 동안 반응을 진행하고 바이오디젤을 회수하는 것이 가장 효과적이라고 판단된다.
coli BL21(DE3)/pKLE 균체의 세포 추출액 중의 리파아제 활성이 평균 600 U/mL로 매우 높은 활성을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 세포 추출액 중의 리파아제 K80의 농도는 300 mg/L이며, 배양액 1.8리터에 해당되는 균체를 1/50 부피인 36 mL에 현탁하고 세포추출액을 제조했기 때문에 리파아제의 생산량은 배양액 기준으로 6 mg/L인 것으로 밝혀졌다.
상업적으로 판매되는 Candida antarctica에서 유래한 리파아제인 CalB의 경우, 20% 메탄올의 농도에서 잔존활성이 50%이하로 떨어졌으며, 메탄올의 농도가 증가함에 따라 그 활성이 점차적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다[23]. 따라서, P. vulgaris에서 유래한 리파아제 K80의 경우 알코올류에 대해 상대적으로 높은 안정성을 가지고 있음을 확인하였다.
결론적으로, 리파아제 K80은 다른 상업적 리파아제인 CalB 효소보다 메탄올에 대해 훨씬 높은 안정성을 가지고 있었으며, 이러한 특성을 이용하여 바이오디젤을 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한 담체에 소수성 결합으로 흡착된 고정화된 K80을 이용하였을 때 바이오디젤을 효과적으로 생산할 수 있었다. 고정화 K80을 이용하여 다양한 종류의 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있었다.
리파아제 K80과 동일하게 반응이 진행될수록 올리브오일의 양이 감소하는 것과 바이오디젤의 양이 증가하는 것을 TLC결과를 통해 확인할 수 있으며, 기체 크로마토그래피 분석을 통하여 최대 생성수율이 97%임을 알 수 있다. 고정화 K80의 경우, 수용성 K80과 달리 반응 조건에서 수분함량이 매우 낮기 때문에 가수분해 반응보다 에스테르 교환반응 또는 에스테르화 반응이 빠르게 진행되어 바이오디젤 생성 수율이 높게 나타난 것으로 해석된다.
오일과 알코올의 몰비가 1:1이 되도록 올리브오일과 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, n-부탄올을 각각 섞고 리파아제 K80 을 이용하여 바이오디젤 합성반응을 24시간 동안 진행하였다. 박층 크로마토그래피를 통해 반응 산물을 확인한 결과 (Fig. 2), 메탄올, 에탄올, 부탄올의 경우, 올리브유로부터 바이오디젤이 생성되었고, 1-프로판올의 경우, 바이오디젤이 거의 생성되지 않았다. n-부탄올을 사용하였을 때, 가장 많은 양의 바이오디젤이 생성되었으나, 메탄올이 다른 알코올류에 비해 가장 저렴하며, 바이오디젤 합성 반응에서 가장 많이 쓰이기 때문에 메탄올을 추가적인 연구에 사용하였다.
이번 연구에서 사용된 고정화 기술은 소수성 작용을 이용하여 고체 상태의 담체에 효소를 흡착시키는 방법이다. 본 연구실에 확보하고 있는 여러 미생물에서 유래한 리파아제에 대한 고정화 효율을 확인한 결과, 리파아제 K80이 가장 효과적으로 고정화되는 것을 확인하였다(Fig. 4). 리파아제 K80 효소액(단백질 100 mg, 0.
3B). 분석 결과, 7시간대에 71%의 바이오디젤이 생성되었으나 9시간대에 43%로 감소하였다. 이처럼, 6시간대에 메탄올을 첨가한 후 1시 간 동안 바이오디젤의 생성량이 크게 증가하지만 그 뒤로 감소하는 것을 확인하였다.
분석 결과, 7시간대에 71%의 바이오디젤이 생성되었으나 9시간대에 43%로 감소하였다. 이처럼, 6시간대에 메탄올을 첨가한 후 1시 간 동안 바이오디젤의 생성량이 크게 증가하지만 그 뒤로 감소하는 것을 확인하였다. 이것은 리파아제 K80에 의해 생성된 바이오디젤이 효소의 가수분해반응에 의해 다시 지방산으로 전환되기 때문이라고 해석된다.
5 M 황산암모늄용액)을 담체와 섞고 4시간 동안 진탕배양기에서 반응한다. 즉, 반응시간 0, 2, 4시간에 반응상등액의 리파아제 잔존활성을 pH stat방법으로 확인한 결과, 2시간 만에 고정화 효율은 91.8%에 도달했으며, 4시간 만에 고정화 효율이 98.2%로 나타났다(Table 1). 담체에 고정화된 K80을 건조시킨 뒤, 최종적으로 제조된 고정화 K80의 활성을 pH stat으로 측정한 결과, 246 U/g이었다.

후속연구

고정화 K80을 이용하여 다양한 종류의 오일을 바이오디젤로 전환할 수 있었다. 고정화된 리파아제 K80는 바이오디젤 생산뿐만 아니라 다른 산업적 공정에서도 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
CalB를 이용하여 바이오디젤 합성반응에서 동일한 3- stepwise반응을 수행한 선행연구에서 90%이상의 바이오디젤 전환율을 확인할 수 있다[7, 18, 19, 23]. 그러나 90%이상의 높은 바이오디젤 생성 수율을 얻기 위해 긴 반응시간을 필요로 하는 CalB와는 달리 고정화 K80의 경우, CalB를 이용한 바이오디젤 합성반응보다 빠른 시간 내에 높은 전환율을 보여줌으로써 산업 공정에서 반응시간을 단축시켜 비용을 절감할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	바이오디젤이란 무엇인가?	바이오디젤은 긴 사슬 지방산의 알킬 에스테르로서 동물성 지방 또는 식물성 오일과 알코올이 반응하여 에스테르 교환 반응에 의해 생성되는 대체연료이다. 지난 십여 년 동안, 다양한 리파아제를 이용한 바이오디젤 생산에 대해 연구되었다.
	P. vulgaris에서 유래한 리파아제 K80을 E. coli 균에서 발현하여 얻은 효소액으로 바이오디젤을 생산한 실험 결과는 어떠한가?	coli균에서 발현하여 얻은 효소액으로 바이오디젤을 생산하였다. 재조합 리파아제 K80은 높은 발현량을 보였으며, 높은 가수분해 반응의 비활성도(specific activity)와 유기용매에서 높은 안정성을 확인했다. 리파아제 K80은 올리브 오일과 메탄올을 3-stepwise 방법을 이용하여 바이오디젤을 생산할 수 있었다. 리파아제 K80을 소수성 결합을 이용하여 담체 표면에 흡착시켜 얻은 고정화 K80을 이용하여 수용성 리파아제 K80과 동일한 방법으로 바이오디젤을 생산한 결과, 효율적으로 바이오디젤 생산을 확인했다. 고정화 K80은 다양한 식물성 오일과 메탄올을 사용하여 효과적으로 바이오디젤을 생산하였다. 고정화 K80을 이용하여 바이오디젤 생산뿐만 아니라 다른 산업적 공정에서도 활용할 수 있을 것으로 기대한다.
	바이오디젤 생산 방법은 무엇이 있는가?	바이오디젤을 생산하는 방법으로는 크게 화학적 촉매 방법과 효소 촉매 방법이 있다. 화학적 촉매 공정이 바이오디젤 생성량이 높아 산업공정에 많이 쓰이고 있지만, 생성물인 바이오디젤과 부산물이 쉽게 분리되지 않는다는 점과 다량의 유기용매를 처리하는 과정에서 생기는 폐수와 부산물 등이 환경오염을 유발시키는 문제점을 갖고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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