인간 전립선 암세포 PC-3 세포에서 Silibinin의 세포주기조절을 통한 세포사멸 유도 효과 Silibinin Inhibits Cell Growth and Induces Apoptosis through Cell-cycle Arrest in PC-3 Prostate Cancer Cells원문보기
Silibinin은 milk thistle에서 분리된 주된 생리활성 성분으로 강력한 항산화제, 항암활성에 대해서 보고되어 있다. 하지만 항암활성에 대한 정확한 기전에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포를 이용하여 세포사멸의 기전을 조사하였다. MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였고, PI 염색을 통해 세포주기를 확인하고, Annexin-V/PI 염색을 통한 세포사멸을 확인하였다. 뿐만 아니라 western blot을 이용하여 세포주기 및 세포사멸에 관련된 단백질 발현 정도를 확인하였다. 본 연구의 결과에서 silibinin은 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포에서 세포주기관련 단백질의 발현을 조절하여 세포주기 진행을 억제함으로써 세포사멸을 유도 함을 알 수 있었다.
Silibinin은 milk thistle에서 분리된 주된 생리활성 성분으로 강력한 항산화제, 항암활성에 대해서 보고되어 있다. 하지만 항암활성에 대한 정확한 기전에 대해서는 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포를 이용하여 세포사멸의 기전을 조사하였다. MTT assay를 통해 세포독성을 확인하였고, PI 염색을 통해 세포주기를 확인하고, Annexin-V/PI 염색을 통한 세포사멸을 확인하였다. 뿐만 아니라 western blot을 이용하여 세포주기 및 세포사멸에 관련된 단백질 발현 정도를 확인하였다. 본 연구의 결과에서 silibinin은 인간 전립선 암세포주인 PC-3 세포에서 세포주기관련 단백질의 발현을 조절하여 세포주기 진행을 억제함으로써 세포사멸을 유도 함을 알 수 있었다.
Milk thistle (silybum marianum) is a famous dietary supplement widely used in the United States and Europe. Silbinin is a major biologically active compound of milk thistle and has strong antioxidant and radical scavenger activities. Anticancer activities, as well as chemopreventive effects on vario...
Milk thistle (silybum marianum) is a famous dietary supplement widely used in the United States and Europe. Silbinin is a major biologically active compound of milk thistle and has strong antioxidant and radical scavenger activities. Anticancer activities, as well as chemopreventive effects on various cancer cell lines, including prostate, lung, colon, skin, and bladder, have also been reported in silbinin. In the present study, we investigated the anticancer effects of silibinin and apoptosis through cell cycle arrest on prostate cancer cell PC-3. We performed cell viability by MTT assay and western blotting to confirm cell cycle check point proteins such as cyclin A/D1/E and cyclin-dependent kinase (CDK) 2/4/6. To quantify silibinin-induced apoptotic cell death of PC-3, Annexin V and PI double staining was performed by flow cytometry, by which its cell distribution was determined. As a result, silibinin inhibited the cell growth of PC-3 cells in a time- and dose-dependent manner, and its treatment resulted in cell cycle arrest at the G1 phase. Also the level of cell cycle check point proteins (cyclin, CDK) was decreased by silibinin in a dose-dependent manner. Taken together, we suggest that apoptosis of prostate cancer cell line PC-3 induced by silibinin is associated with cell cycle arrest through decrease of cell cycle check point proteins, caspase-3 activation and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage.
Milk thistle (silybum marianum) is a famous dietary supplement widely used in the United States and Europe. Silbinin is a major biologically active compound of milk thistle and has strong antioxidant and radical scavenger activities. Anticancer activities, as well as chemopreventive effects on various cancer cell lines, including prostate, lung, colon, skin, and bladder, have also been reported in silbinin. In the present study, we investigated the anticancer effects of silibinin and apoptosis through cell cycle arrest on prostate cancer cell PC-3. We performed cell viability by MTT assay and western blotting to confirm cell cycle check point proteins such as cyclin A/D1/E and cyclin-dependent kinase (CDK) 2/4/6. To quantify silibinin-induced apoptotic cell death of PC-3, Annexin V and PI double staining was performed by flow cytometry, by which its cell distribution was determined. As a result, silibinin inhibited the cell growth of PC-3 cells in a time- and dose-dependent manner, and its treatment resulted in cell cycle arrest at the G1 phase. Also the level of cell cycle check point proteins (cyclin, CDK) was decreased by silibinin in a dose-dependent manner. Taken together, we suggest that apoptosis of prostate cancer cell line PC-3 induced by silibinin is associated with cell cycle arrest through decrease of cell cycle check point proteins, caspase-3 activation and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage.
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문제 정의
Silibinin은 다양한 암세포에 세포증식과 세포독성에 영향을 미치는 것으로 보고 되었다[1,6,33-34]. 본 연구에서는 PC-3 전립선 암세포에서 silibinin에 의한 세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 농도 및 시간 의존적으로 silibinin에 의해 유의적으로 생존률이 감소되는 것을 관찰 하였다(Fig.
본 연구에서는 silibinin이 인간 전립선암 세포주인 PC-3세포에 대하여 세포주기조절과 이에 따른 세포사멸의 기전에 대하여 조사하여 얻어진 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
PC-3 세포를 세포배양용 48-well plate를 이용하여 1×104cells/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 50-250 μM의 농도로 12, 24, 36 및 48시간 동안 처리하였다.
1% Tween-20]를 이용하여 실온에서 1시간 blocking 하였다. 각각의 1차 항체를 4℃에서 12 시간 반응하였으며, 2차 항체를 상온에서 2 시간 반응하여 enhanced chemilluminescence (ECL) kit (Amersham pharmacia Biotech)를 이용하여 측정하였다.
간략히, PC-3 세포를 6-well plate에 1×105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, silibinin을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처리하여 각각 24, 48시간 배양 후, 세포를 모아 PBS로 세척하였다.
간략히, PC-3 세포를 6-well plate에 1×105 cells/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, silibinin을 다양한 농도로 PC-3 세포에 처리하여 각각 24, 48시간 배양 후, 세포를 모아 PBS로 세척하였다. 그 후, Annexin V apoptosis detection kit를 사용하여 세포를 염색하여 flow cytometry로 측정하였다.
cells/well로 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 24시간 동안 배양하였다. 그 후, silibinin이 처리된 PC-3 세포를 분리하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 세척하여 70% ethanol로 4℃에서 12 시간 고정한 후, RNase A를 37℃ 에 1시간 동안 처리하고 DNA staining dye인 PI로 염색하였다. 염색된 DNA는 flow cytometry (Becton Dickinson Co.
그 후 미토콘드리아 내의 cytochrome c를 방출하게 되어 caspase cascade를 활성화하여 세포사멸을 일으키게 된다. 따라서 PC-3 세포에 세포사멸 유도 경로를 확인하기 위해 관련 단백질(Bcl-2, Bax, caspase-3, PARP)의 발현양을 확인하였다(Fig. 5). Anti-apoptotic protein 인 Bcl-2의 발현양은 농도, 시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 반면에 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현양은 증가하는 것을 확인 하였다.
또한 세포형태 변화 관찰을 위해서 세포배양용 dish에 24 시간 동안 안정화 시킨 다음 50-250 μM 농도로 48시간 동안 배양한 후, 광학현미경에서 각 농도에 따른 형태 변화를 관찰하였다.
본 연구에서는 silibinin을 100-200 μM의 농도로 24, 48시간 처리한 뒤, 세포막 외부로 노출되는 phosphatidylserine (PS)과 세포막의 파괴로 인해 노출되는 핵을 각각 Annexin-V와 PI를 염색하여 flow cytometry로 측정하였다.
5 mg/ml 농도가 되게 처리하여 37℃에서 4 시간 반응하였다. 생성된 보라색의 formazan을 dimethyl sulfoxide(DMSO)로 녹인 후 ELISA reader (VERSA MAX microplate reader, Molecular Devices, Toronto, Canada)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포형태 변화 관찰을 위해서 세포배양용 dish에 24 시간 동안 안정화 시킨 다음 50-250 μM 농도로 48시간 동안 배양한 후, 광학현미경에서 각 농도에 따른 형태 변화를 관찰하였다.
세포주기는 cyclin/CDK complex의 활성과 불활성의 의해 조절되는데, 먼저 silibinin이 PC-3 전립선 암세포의 세포분열 주기상에 미치는 영향을 flow cytometry로 조사하였다. Fig.
그 후, silibinin이 처리된 PC-3 세포를 분리하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 세척하여 70% ethanol로 4℃에서 12 시간 고정한 후, RNase A를 37℃ 에 1시간 동안 처리하고 DNA staining dye인 PI로 염색하였다. 염색된 DNA는 flow cytometry (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.
대상 데이터
각각의 antibody는 Santa Cruz Biotechnology, lnc. (Santa Cruz, Ca, USA)와 Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA)에서 구입하였다. 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS) (WelGene Inc.
Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 세포에 처리시 DMSO/Methanol (1:1, v/v)에 희석하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), 그리고 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)는 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 각각의 antibody는 Santa Cruz Biotechnology, lnc.
본 실험에 사용된 silibinin은 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해하여 세포에 처리시 DMSO/Methanol (1:1, v/v)에 희석하여 사용하였다. 3-(4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), 그리고 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)는 Sigma chemical Co.
인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS) (WelGene Inc., Korea), 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (WelGene Inc., Korea)이 첨가된 DMEM 배지 (WelGene Inc., Korea)에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
모든 실험의 표시된 결과는 3번 수행하였으며, 통계분석은 mean±S.D로 표시하였고, ANOVA에 의해 분석하였다.
이론/모형
Bradford 법을 이용하여 단백질을 정량한 뒤, 50 μg의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacryamide gel을 이용하여 분리하였다.
(A) PC-3 cells were treated with silibinin for 12 hr, 24 hr, 36 hr, and 48 hr. Cell viability was determined by MTT assay. (B) PC-3 cells were incubated with silibinin (100-250 μM) for 48 hr.
성능/효과
5). Anti-apoptotic protein 인 Bcl-2의 발현양은 농도, 시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 반면에 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현양은 증가하는 것을 확인 하였다. 또한 pro-caspase-3의 발현이 시간, 농도 의존적으로 감소하였고, caspase-3의 기질로 알려진 PARP의 분절형태가 증가하는 것을 확인 하였다.
기와 관련한 세포주기에 관여하는 cyclin과 CDK의 발현양을 western blot을 통해 확인하였다. Cyclin A, D1, E와 CDK 2, 4, 6의 발현양은 시간 및 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다(Fig. 3A). 이와 같은 결과를 통해 cyclin과 CDK의 발현양의 감소를 통해 세포주기 중 G1기가 억제됨을 알 수 있었다.
본 연구에서는 silibinin을 100-200 μM의 농도로 24, 48시간 처리한 뒤, 세포막 외부로 노출되는 phosphatidylserine (PS)과 세포막의 파괴로 인해 노출되는 핵을 각각 Annexin-V와 PI를 염색하여 flow cytometry로 측정하였다. Silibinin 처리시 세포사멸의 양이 농도 및 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 48시간 처리시, 1.
본 연구에서는 PC-3 전립선 암세포에서 silibinin에 의한 세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 농도 및 시간 의존적으로 silibinin에 의해 유의적으로 생존률이 감소되는 것을 관찰 하였다(Fig. 1A). 특히 48시간 처리군 중 150 μM 농도에서 비처리군에 비하여 50% 이상 세포 독성을 나타내었고, 이는 최근 선행연구 결과와 유사한 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다[20].
특히 flow cytometry analysis와 세포주기 G1기 관련 cyclin과 cyclin dependent kinase 등의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인함으로써 G1 arrest를 하여 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 Bcl-2 family, caspase-3, PARP 등의 단백질의 발현을 확인함으로써 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다. 본 연구는 세포주기와 관련하여 silibinin의 전립선 암에 대한 세포사멸기전을 확인하였으나 앞으로의 전립선암에 대한 치료제로서의 사용 가능성을 나타내기 위해서는 이에 대한 더 자세한 항암기전에 관한 연구가 더 진행 되어야 할 것이다.
Anti-apoptotic protein 인 Bcl-2의 발현양은 농도, 시간 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, 반면에 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현양은 증가하는 것을 확인 하였다. 또한 pro-caspase-3의 발현이 시간, 농도 의존적으로 감소하였고, caspase-3의 기질로 알려진 PARP의 분절형태가 증가하는 것을 확인 하였다. 이와 같은 결과를 통해 silibinin이 PC-3 세포에서 Bcl-2 family의 변화를 유도하여 caspase-3 경로를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.
특히 48시간 처리군 중 150 μM 농도에서 비처리군에 비하여 50% 이상 세포 독성을 나타내었고, 이는 최근 선행연구 결과와 유사한 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다[20]. 또한 세포형태 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 silibinin을 다양한 농도로 처리하여 48시간 배양하여 광학현미경으로 관찰한 결과, 농도 의존적으로 세포밀도 감소와 형태변화를 관찰 할 수 있었다(Fig. 1B). 이들 결과들을 종합해&볼 때, silibinin은 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포의 성장을 억제하고 특히 세포 형태의 변화를 통해 세포 사멸이 나타냄을 알 수 있었다.
반면에 silibinin이 150 μM의 농도로 처리된 세포의 분포는 G1기가 56.66%로 증가하였고, G2기는 18.54%로 감소하는 것을 관찰하였다.
이들 결과들을 종합해&볼 때, silibinin은 인간 전립선암 세포주인 PC-3 세포의 성장을 억제하고 특히 세포 형태의 변화를 통해 세포 사멸이 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 결과들을 통해 silibinin이 인간 전립선 암세포 PC-3세포의 증식을 억제하여 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 특히 flow cytometry analysis와 세포주기 G1기 관련 cyclin과 cyclin dependent kinase 등의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인함으로써 G1 arrest를 하여 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다.
54%로 감소하는 것을 관찰하였다. 이상의 결과로 보아 G1기의 세포분포는 증가하고 G2기의 세포가 상대적으로 줄어드는 것을 확인함으로써 silibinin은 세포주기 중 G1기를 억제함으로써 세포의 증식에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
3A). 이와 같은 결과를 통해 cyclin과 CDK의 발현양의 감소를 통해 세포주기 중 G1기가 억제됨을 알 수 있었다.
또한 pro-caspase-3의 발현이 시간, 농도 의존적으로 감소하였고, caspase-3의 기질로 알려진 PARP의 분절형태가 증가하는 것을 확인 하였다. 이와 같은 결과를 통해 silibinin이 PC-3 세포에서 Bcl-2 family의 변화를 유도하여 caspase-3 경로를 통해 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과들을 통해 silibinin이 인간 전립선 암세포 PC-3세포의 증식을 억제하여 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다. 특히 flow cytometry analysis와 세포주기 G1기 관련 cyclin과 cyclin dependent kinase 등의 단백질 발현이 감소하는 것을 확인함으로써 G1 arrest를 하여 증식을 억제하는 것을 알 수 있었다. 또한 Bcl-2 family, caspase-3, PARP 등의 단백질의 발현을 확인함으로써 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.
Silibinin 처리시 세포사멸의 양이 농도 및 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 48시간 처리시, 1.11%에서 44.19%로 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인함으로써 silibinin이 PC-3 세포에서 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다(Fig. 4A). Fig.
후속연구
또한 Bcl-2 family, caspase-3, PARP 등의 단백질의 발현을 확인함으로써 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다. 본 연구는 세포주기와 관련하여 silibinin의 전립선 암에 대한 세포사멸기전을 확인하였으나 앞으로의 전립선암에 대한 치료제로서의 사용 가능성을 나타내기 위해서는 이에 대한 더 자세한 항암기전에 관한 연구가 더 진행 되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
세포사멸이란 무엇인가?
세포사멸은 세포가 병리학적인 요인들에 의해 노출되어 세포 내·외부의 다양한 신호전달에 의해 세포가 죽음에 이르는 생리학적 과정으로 세포질 및 염색질 응축, 세포막 수포화, DNA 단편화 등으로 나타날 수 있으며, 세포 내 단백질인 Bcl-2 family 및 caspase 활성화, poly (ADP-ribose) poly-merase (PARP) 분절들에 의해 조절된다[10,13,15]. 최근에는 암세포의 세포주기조절을 통해 세포사멸을 유도한다는 연구가 많이 진행되고 있다[16,24].
Silymarin의 입체 이성질체는 어떤 것이 있는가?
Silymarin은 Milk thistle (Silybum marianum)과 식물의 열매나 씨앗에서 분리된 플라보노이드계 생리활성 성분 중 하나이다. Silymarin은 silibinin, siliychristin, silydianin 등의 입체 이성질체를 포함하고 있으며, 현재까지 전립선암, 폐암, 대장암, 피부암, 방광암, 유방암 등 다양한 암세포에 대하여 항암 효과가 있다고 보고되어 있다[1-2,6,8-9,19,21,26,29,30-31,33-34]. 특히 silibinin은 urokinase plasminogen activator (u-PA), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성을 조절하여 암세포의 증식, 침윤 및 전이에 영향을 미치고[4-5], 세포주기조절 및 세포사멸 유도에 관한 활성이 보고되어 있다[7,11,17-18,25,28].
Silymarin의 이성질체 중 silibinin은 어떤 활성이 보고되어 있는가?
Silymarin은 silibinin, siliychristin, silydianin 등의 입체 이성질체를 포함하고 있으며, 현재까지 전립선암, 폐암, 대장암, 피부암, 방광암, 유방암 등 다양한 암세포에 대하여 항암 효과가 있다고 보고되어 있다[1-2,6,8-9,19,21,26,29,30-31,33-34]. 특히 silibinin은 urokinase plasminogen activator (u-PA), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 활성을 조절하여 암세포의 증식, 침윤 및 전이에 영향을 미치고[4-5], 세포주기조절 및 세포사멸 유도에 관한 활성이 보고되어 있다[7,11,17-18,25,28].
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