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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 제주산 우뭇가사리로부터 한천을 추출한 후 대량생산공정에 적합한 DMSO 추출법과 EDTA 수세법을 병용하여 고순도 아가로스를 제조한 후 제주산 우뭇가사리의 고부가 활용을 위하여 그 품질을 비교·검토하였다.
제안 방법
- 0.15 및 0.30 g의 시료를 15 mL TAE buffer에 용해시켜 겔을 성형한 후, 각각 1 kb (Biored, U.S.A.), 100 bp (Bioneer, Korea) DNA ladder를 3 μL씩 주입하여 100 V의 전압 조건에서 전개시킨 다음 ethidium bromide로 염색하여 확인하였다.
- (2006)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 1% (w/v) 시료 용액을 외경 2 cm 스크류 시험관에 5 mL를 분주하여 20℃에 하룻밤 방치하고, 열풍건조기(OF-22GW, Jeio Tec, Korea)에 뒤집어서 고정 후 온도를 서서히 가열하여 시료 겔이 떨어지는 온도를 3회 측정하여 평균값으로 나타내었다.
- (1998)의 방법으로 분석하였다. 1%(w/v) 시료 용액을 외경 5 cm 원통형 틀에 30 mL를 분주하고 20℃ 실내에서 하룻밤 방치하여 레오메타(TA-XT 2, Stable Micro Systems, England)로 파단강도를 측정하였다.
- DMSO-d6 700 mg에 30 mg의 시료를 용해시킨 후 실온조건하에서 핵자기공명분광기(JNM-LA400, Jeol Ltd., Japan)를 사용하여 측정하였다.
- Nuclear magnetic resonace (NMR)는 홍조류 유래 다당류의 구조분석에 가장 효과적인 방법으로 알려져 있으나(Murano, 1995), 본 연구에서는 Fig. 2와 같이 제주산 우뭇가사리로부터 DMSO 추출과 EDTA 수세 병행 추출법으로 제조한 아가로스의 정제도를 확인하는 하나의 방법으로 시판되는 아가로스와 함께 13C NMR spectroscopy를 수행하였다. 2가지 아가로스간 탄소 위치별(chemical shifts) ppm은 거의 일치하여, 두 시료물질은 동일한 수준으로 정제된 아가로스임을 알 수 있었다.
- 건조 보관된 30 g의 우뭇가사리를 1 L 담수가 들어간 Duran 병에 취하고 98%의 황산(Daejung chemicals Co., Korea)을 이용하여 pH 4로 조절한 후 autoclave (HS-60, Hanshin medical Co., Korea)에서 120℃에서 1시간 동안 가압 추출하였다. 그런 다음 1 N NaOH를 사용하여 중화시키고 나일론 천으로 여과·응고 시킨 후 2 cm 정육면체의 형태로 절단하였다.
- 8 mL의 4% TCA 용액을 첨가한 후 미리 준비된 BaCl2-gelatin 시약 1 mL (증류수 400 mL에 gelatin 2 g을 넣고 65℃에서 용해 후 4℃에서 하룻밤 방치한 뒤 BaCl2 2 g을 녹인 후 2시간 방치하여 제조)를 첨가하여 20 분간 방치한 다음 spectrophotometer (Libra S22, Biochrom Inc, England)를 이용하여 360 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량선은 K2SO4를 표준 황산염으로 하여 계산하였다. 아가로스 함량은 다음과 같이 측정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 한천으로부터 아가로스 제조시 응용할 수 있는 DMSO 추출법과 DMSO 추출법에 EDTA 수세공정(DMSO 및 EDTA 병용 추출법)을 적용하여 고순도 범용 아가로스를 제조한 후 이화학적 특성을 비교·검토하였다.
- 수분 함량은 적외선 수분측정기(FD-600, KETT Co., Japan)을 사용하여 측정하였다. 황산기 함량 Dodgson and Price(1962)의 방법에 따라 측정하였다.
- 아가로스 제조는 2가지 방법으로 각각 제조하였다. 즉, DMSO 추출법은 한천 10 g을 200 mL DMSO (Daejung chemicals Co.
- , Japan)을 이용하여 시료 입자 표면을 관찰하였다. 즉, 시료를 동결건조하여 수분을 완전히 제거시키고 카본 테이프가 부착된 구리 시료대에 도포한 후 palladium mix로 코팅하여 100 및 500 배율로 표면구조를 관찰하였다.
- 한편, DMSO 추출 및 EDTA 수세를 병용한 추출법은 DMSO 추출법과 동일한 방법으로 아가로스를 침전시킨 후 0.01 M의 Na2EDTA용액 200 mL로 하룻밤 교반하였고, 증류수로 3회 세척한 다음 아세톤으로 탈수하여 40℃ 이하에서 감압건조하는 방법으로 아가로스를 제조하였다.
- 한편, 대조용 표품으로서 사용된 전기영동용 아가로스는 Seakem LE 아가로스(Lonza Co., USA)를 구입하여 비교·분석하였다.
대상 데이터
- 또한, 겔 조작시 잘 찢어져 운반이나 slicing을 할 때 문제가 될 수도 있어 겔 강도가 높은 아가로스를 제조하는 것은 매우 중요하다. 제주산 우뭇가사리 유래 한천으로부터 DMSO 추출법과 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 제조한 아가로스를 1% 농도의 겔로 제작하여 전기영동한 결과는 Fig. 1A와 같다. 전기영동에 있어 핵산의 전개속도에 관여하는 인자는 전압크기, buffer의 종류, 핵산 분자량의 크기, 아가로스의 농도, 아가로스의 EEO(-mr) 등이 있는 것으로 알려져 있다.
- 제주산 우뭇가사리는 제주시 하도 어촌계에서 구입한 후 담수로 수세하고, 건조공정을 5회 반복하여 탈색한 다음 밀봉·보관하면서 사용하였으며, 모로코산 우뭇가사리는 경남 밀양에 소재하는 밀양한천에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 아가로스 함량은 다음과 같이 측정하였다. 한천 10 g을 30배의 DMSO와 함께 상온에서 2시간 용해시킨 다음 원심분리 하여 상층액을 취하였다. 상층액을 농축한 다음 3배의 아세톤를 서서히 가하여 아가로스를 침전시킨 후 여과하였다.
이론/모형
- 겔강도는 Mollet et al. (1998)의 방법으로 분석하였다. 1%(w/v) 시료 용액을 외경 5 cm 원통형 틀에 30 mL를 분주하고 20℃ 실내에서 하룻밤 방치하여 레오메타(TA-XT 2, Stable Micro Systems, England)로 파단강도를 측정하였다.
- 8 cm 시험관에 5 mL를 분주하고 20℃ 실내에서 방치하면서 시료용액의 유동성을 관찰하여 표면이 고정되어 움직이지 않을 때의 온도를 3회 측정하여 평균값으로 나타내었다. 융해온도는 Praiboon et al. (2006)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 1% (w/v) 시료 용액을 외경 2 cm 스크류 시험관에 5 mL를 분주하여 20℃에 하룻밤 방치하고, 열풍건조기(OF-22GW, Jeio Tec, Korea)에 뒤집어서 고정 후 온도를 서서히 가열하여 시료 겔이 떨어지는 온도를 3회 측정하여 평균값으로 나타내었다.
- 응고온도는 Guiseley (1970)의 방법에 따라 1% (w/v) 시료 용액을 외경 1.8 cm 시험관에 5 mL를 분주하고 20℃ 실내에서 방치하면서 시료용액의 유동성을 관찰하여 표면이 고정되어 움직이지 않을 때의 온도를 3회 측정하여 평균값으로 나타내었다. 융해온도는 Praiboon et al.
- 입자표면분석 Kim and Son (1997)의 방법에 따라 장방출주사전자현미경(Field Emission Scanning Electron Microscope; JSM-6700F, Jeol Ltd., Japan)을 이용하여 시료 입자 표면을 관찰하였다. 즉, 시료를 동결건조하여 수분을 완전히 제거시키고 카본 테이프가 부착된 구리 시료대에 도포한 후 palladium mix로 코팅하여 100 및 500 배율로 표면구조를 관찰하였다.
- , Japan)을 사용하여 측정하였다. 황산기 함량 Dodgson and Price(1962)의 방법에 따라 측정하였다. 3 mg의 시료를 1 N HCl로 105℃에서 5시간 동안 산 가수분해 시키고, 원심분리(10,000×g, 5 min)하여 상층액 0.
성능/효과
- 제주산 우뭇가사리 유래 한천으로부터 DMSO 추출법과 DMSO 추출 및 EDTA 수세법을 이용하여 추출한 아가로스의 융해온도 및 응고온도는 Table 2에 나타내었다. 2가지 방법으로 제조한 아가로스의 융해온도는 약 95℃ 부근(DMSO 추출법: 95.3℃, DMSO 추출 및 EDTA 수세법: 95.7℃)으로 비슷한 범위를 나타내어 황산기의 제거에 따른 융해온도의 변화는 미미하다는 것을 알 수 있었다. Tagawa (1968)의 연구에서는 4종의 한천을 아가로스와 아가로팩틴을 분리 후 융해 온도를 측정하였는데 한천과 아가로스의 융해 온도는 큰 변화를 나타나지 않았다고 보고하여 본 연구와 잘 일치하였다.
- 2와 같이 제주산 우뭇가사리로부터 DMSO 추출과 EDTA 수세 병행 추출법으로 제조한 아가로스의 정제도를 확인하는 하나의 방법으로 시판되는 아가로스와 함께 13C NMR spectroscopy를 수행하였다. 2가지 아가로스간 탄소 위치별(chemical shifts) ppm은 거의 일치하여, 두 시료물질은 동일한 수준으로 정제된 아가로스임을 알 수 있었다. 한편, 아가로스는 NMR상에서 12개의 agarobiose 탄소 시그널이 나타나야 하지만, 본 NMR에서는 11개 탄소 시그널이 나타났다.
- 제주산 우뭇가사리 유래 한천으로부터 DMSO 추출법과 DMSO 추출 및 EDTA 수세법을 병용하여 제조한 아가로스의 겔 강도는 Table 2에 나타내었다. DMSO 추출법으로만 제조한 아가로스의 겔 강도는 1,386 g/cm2로 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 제조한 아가로스의 겔 강도(1,365 g/cm2) 보다 약간 높은 값을 나타내었는데, 이는 EDTA에 의해서 아가로스가 일부 가수분해 반응이 일어나 DMSO 단독 추출법으로 제조한 아가로스 보다 겔 강도가 낮아진 것으로 생각된다. 기 보고된 연구결과(Kim and Son, 1997)에서도 아가로스를 EDTA 용액으로 3회 세척한 경우 겔강도는 618 g/cm2에서 527 g/cm2로 저하하였다는 결과가 있다.
- 제주산 우뭇가사리 유래 한천으로부터 2가지 방법으로 제조한 아가로스의 황산기 함량을 Table 2에 나타내었다. DMSO 추출법으로만 제조한 아가로스의 황산기 함량은 0.45%로 시판 범용 아가로스의 황산기 함량 기준인 0.12% 보다 매우 높은 값을 나타내었으나, DMSO 추출 및 EDTA 수세법을 적용하여 제조한 아가로스는 0.06%로 시판 아가로스와 비슷한 황산기 함량 결과를 나타내었다. DMSO 추출법으로만 황산기 함량이 낮은 고순도 아가로스를 제조하기 어려운 이유는 한천의 구조적 특징에 기인하는 것으로 추정된다.
- 아가로스를 겔화 시키면 전기적으로 중성 망상구조를 가진 형성하는데, 이 망상구조는 스펀지처럼 미세한 구멍들이 서로 통해 있어서 이 구멍의 크기보다 작은 물질은 어떤 힘을 걸어줄 때 일정 속도로 그 구멍을 통과하여 이동하게 된다. Fig. 1A에서 보는 바와 같이 1 Kb DNA 편자를 분리하기 위하여 아가로스를 매질로 전기영동한 결과, 해상도에서는 큰 차이가 없었으나 DMSO 단독 추출법으로 제조한 아가로스는 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 제조한 아가로스 보다 느린 전개 속도를 나타내었고, 고분자 DNA의 분리가 용이하지 않음을 알 수 있었다. 한편, 2가지 방법으로 제조한 아가로스의 전기영동시 전개속도 차이는 황산기 함량의 차이에서 기인되는 것으로 추정된다.
- 제주산 우뭇가사리 유래 한천으로부터 DMSO 단독 추출법과 DMSO 추출 및 EDTA 수세를 병용한 방법을 이용하여 제조한 아가로스의 수분함량 및 수율은 Table 2에 나타내었다. Table 2에서 보는 바와 같이 DMSO 추출법 단독으로 아가로스를 제조한 경우 수분함량이 6.0%였으며, DMSO 추출 및 EDTA 수세법을 병용하여 추출한 아가로스의 수분함량은 6.6%로 약간 높았다. 수율은 2가지 방법으로 제조한 아가로스 모두 건물당 55% 이상이었는데, DMSO 추출법만으로 제조한 아가로스는 57.
- 이상의 전기영동 및 이화학적 분석 결과에서 보듯이 DMSO 추출과 EDTA 수세공정을 병행하여 아가로스를 제조하면 시판되고 있는 아가로스와 유사한 전기영동급 아가로스를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 따라서 제주산 우뭇가사리로부터 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 정제한 아가로스와 시판되고 있는 아가로스를 2%의 농도로 겔 성형 한 다음 전기영동한 결과(Fig. 1B) DNA 편자의 이동 속도와 각 편자간 분리능 그리고 해상도 모두 2개의 아가로스가 유사하여 DMSO 추출과 EDTA 수세 병행 추출법으로 제조한 아가로스는 상용화가 가능한 품질임을 알 수 있었다. Do and Oh (1999)는 다량의 황산기가 존재하는 겔 상에 ethidium bromide로 염색한 후 탈색시에도 DNA 이외의 부분에서도 ethidium bromide가 제거되지 않아 겔 전체가 형광성을 띠는 효과로 DNA 편자의 확인이 어렵다고 보고하여, 결과적으로 아가로스 겔 전기영동시 고해상도를 요구하는 경우 아가로스는 황산기, pyruvic acid 등과 같은 극성잔기의 함량에 따라 품질이 좌우된다고 볼 수 있다.
- 6%로 약간 높았다. 수율은 2가지 방법으로 제조한 아가로스 모두 건물당 55% 이상이었는데, DMSO 추출법만으로 제조한 아가로스는 57.6%였으며, DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 제조한 아가로스의 경우 57.1%로 큰 차이는 보여지지 않았다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 제주산 우뭇가시리로부터 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 정제한 아가로스는 시판되고 있는 아가로스와 이화학적 특성에서 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에 적용한 상기 아가로스 제조 방법으로 향후 추가적인 Scale-up 실험 등이 보완된다면 제주산 우뭇가사리로부터 고순도 아가로스의 산업적 대량생산이 가능하리라 판단된다.
- 7℃)도 융해온도와 마찬가지로 큰 차이가 없었다. 이상의 결과에서 DMSO 추출과 EDTA 수세 과정을 병행 했을 때, 아가로스의 황산기 함량은 0.06%, 융해온도 95.7℃ 및 응고온도 33.7℃로 시판되는 아가로스(황산기함량은 0.05%, 융해온도 96.2℃ 및 응고온도 35.7℃)와 유사한 전기영동급 아가로스를 얻을 수 있었다. 하지만 겔 강도의 경우 1365 g/cm2로 시판되는 아가로스 겔 강도(2168 g/cm2)보다 낮은 값을 나타내었으나 일반적인 시판 범용 아가로스의 겔 강도 기준인 >1,200 g/cm2 보다 높은 값을 나타내어 적합하다고 사료된다.
- 한편, 2가지 방법으로 제조한 아가로스의 전기영동시 전개속도 차이는 황산기 함량의 차이에서 기인되는 것으로 추정된다. 이상의 전기영동 및 이화학적 분석 결과에서 보듯이 DMSO 추출과 EDTA 수세공정을 병행하여 아가로스를 제조하면 시판되고 있는 아가로스와 유사한 전기영동급 아가로스를 얻을 수 있음을 알 수 있다. 따라서 제주산 우뭇가사리로부터 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 정제한 아가로스와 시판되고 있는 아가로스를 2%의 농도로 겔 성형 한 다음 전기영동한 결과(Fig.
- (2000)과 Do(1997)의 연구에서는 국내산 우뭇가사리로부터 제조된 한천은 황산기 함량이 1% 이상이었지만, 본 연구에서 제조한 한천은 그보다 낮은 함량을 나타내었는데, 이는 한천 제조 전 우뭇가사리의 탈색을 위한 세척과 한천 제조 과정 중 해동 후 담수 세척에 의하여 아가로팩틴과 함께 황산기가 상당량 제거 된 것으로 생각된다. 이상의 제조된 한천의 겔 강도 및 황산기 함량 등 이화학적 특성을 종합해 볼 때, 제주산 우뭇가사리가 모로코산 우뭇가사리 보다 아가로스의 추출용 원료로서 적합하다는 결과를 얻을 수 있었다.
- 제주산 및 모로코산 우뭇가사리로부터 추출 정제한 한천의 수분함량, 수율 및 아가로스 함량은 Table 1에 나타내었다. 제주산 및 모로코산 우뭇가사리 유래 한천의 수분함량은 각각 6.5% 및 6.4%로 큰 차이가 없었으며, 수율도 건물당 각각 44.5% 및 44.1%로 수분 함량과 마찬가지로 큰 차이를 보이지 않았다. 한편, 모로코산 우뭇가사리 유래 한천의 아가로스 함량이 65.
- (1997)는 아가로스의 13C NMR spectroscopy 분석한 결과, 80℃ 온도 조건에서 D2O와 DMSO-d6의 용매에 따라 galactose 2번 탄소의 ppm shift를 보고한 바 있는데, 본 연구에서 겹쳐진 시그널도 galactose 2번 탄소가 shift되어 galactose의 6번 탄소와 겹쳐진 것으로 사료된다. 한편 분석한 2개의 아가로스 모두 agarobiose 탄소 12개 이외에 6-O-methyl-D-galactose, 2-O-methyl-L-3,6- anhydrogalactose 등과 같은 메칠기의 탄소는 검출되지 않았다.
- 한편, 2가지 방법으로 제조한 아가로스의 겔 강도 모두 일반적인 시판 범용 아가로스의 겔 강도 기준인 >1,200 g/cm2 보다 높은 값을 나타내어 적합하다고 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 보면, 제주산 우뭇가시리로부터 DMSO 추출 및 EDTA 수세법으로 정제한 아가로스는 시판되고 있는 아가로스와 이화학적 특성에서 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에 적용한 상기 아가로스 제조 방법으로 향후 추가적인 Scale-up 실험 등이 보완된다면 제주산 우뭇가사리로부터 고순도 아가로스의 산업적 대량생산이 가능하리라 판단된다.
- 아가로스 정제방법 중 DMSO 추출법은 아가로스를 선택적으로 용해시키는 성질을 가진 DMSO의 고유성질을 이용한 것인데 추출 시간이 빠르며, 상온에서 겔화되지 않는다는 장점을 가지고 있다. 또한, DMSO 용매의 낮은 독성과 높은 한천 농도에서도 아가로팩틴을 분리시킬 수 있어 아가로스의 생산을 위한 용매로서 응용이 가능하다. Kang et al.
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