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문제 정의
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따라서 본 연구는 돼지 집단을 대상으로 해당과정 중 전이 및 동질효소로서 작용하여 에너지 대사에 영향을 미치고, 다양한 기능에 관여하고 있는 PGK 2 유전자의promoter 영역 및 transcription 영역을 대상으로 DNA 염기서열을 결정하고 새로운
SNP를 발굴하여 유전자형을 결정한 후 돼지의 성장 형질과의 연관성을 분석하고자 수행하였다. - 001)에서 통계적으로 고도의 유의적 연관성이 있음을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통하여 확인된 PGK 2 유전자의 promoter 영역 내 성장 형질 관련 SNP는 건강한 자돈 및 종돈을 조기 선발하기 위한 유전자 marker로 활용 가능성을 제시하였다.
제안 방법
- 1)를 참고하고 Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA) 프로그램을 사용하여 최종 반응산물이 600 bp 내외가 되도록 제작 하였다(Table 1). 8개의 primer는 양끝의 염기 서열이 모두 중복되도록 제작하여 PGK 2 유전자의 정확한 염기서열을 얻을 수 있도록 하였다. PCR 반응은 PCR reaction buffer (500 mM KCl; 100 mM Tris-Cl, pH 8.
- Genomic DNA는 F2 집단 268두의 전혈을 채취한 후, Wizard genomic purification kit (Promega, USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 spectrophotometer (Nanodrop technologies.
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8개의 primer는 양끝의 염기 서열이 모두 중복되도록 제작하여 PGK 2 유전자의 정확한 염기서열을 얻을 수 있도록 하였다. PCR 반응은 PCR reaction buffer (500 mM KCl; 100 mM Tris-Cl, pH 8.2; 15 mM MgCl2 0.1% Triton X-100, TaKaRa Co, Japan) 2.5㎕, 2.5 mM dNTPs 2㎕, 10 pmole/ul의 primer 각 0.5 ul, 50 ng/ul의 genomic DNA, 1unit의 Taq DNA polymerase (CoreBio)를 넣고 멸균증류수를 첨가하여최종 부피를 25㎕가 되도록 하였다. 유전자 증폭은 Thermal
- PCR 반응을 통해 증폭된 산물은 유전자 증폭산물 정제 키트 (PCR Purification Kit, CoreBio PPHTS-30)를 이용하여 정제한 후, BigDye® Terminator (ver3.1) Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)와 ABI 3730XL (Applied Biosystems)을 이용하여 직접 염기서열분석을 수행하였다.
- PGK 2 유전자 내 SNP 발굴을 위하여, 각각 품종이 다른 재래 돼지, Duroc, Berkshire, Yorkshire, Landrace, Minipig 품종으로 부터 각각 8두씩 총 48두를 이용하였다. PGK 2 유전자의 promoter 영역 및 transcription 영역의 증폭 및 확인을 위한 8개의 primer는 NCBI Genbank (Acession NO. AY500132.1)를 참고하고 Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA) 프로그램을 사용하여 최종 반응산물이 600 bp 내외가 되도록 제작 하였다(Table 1). 8개의 primer는 양끝의 염기 서열이 모두 중복되도록 제작하여 PGK 2 유전자의 정확한 염기서열을 얻을 수 있도록 하였다.
- T > G SNP를 재래돼지와 Landrace의 F2 집단 268두를 대상으로 PCR-RFLP 방법을 통하여 유전자형을 조사 하였고, 대립유전자빈도 분석을 수행하였다(Table 2).
- T > G 등 1개의 SNP 유전자형 효과를 분석하였다.
- 돼지 각 개체의 유전자형과 성장 형질과의 연관성 분석을 실시하였다. 연관성 분석은 SAS package (Version 9.
- 유전자 증폭은 Thermal Cycler PTC-0240 (MJ Research, Inc., MA, USA)를 이용하여 94℃ 10분간 pre_denaturation을 시작으로 94℃ 30초, 50~61℃ 30초, 72℃ 70초를 1cycle로 하여 총 35 cycle 증폭 후 72℃에서 5분간 신장 반응을 수행하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 MboⅡ 제한효소(5'-GAAGA(N)8 ↓-3')를 처리하여 5시간 동안 37℃에서 반응시키고 ethidium bromide가 포함된 2.5% agarose gel에서 전기영동 후 UV상에서 확인하였다.
대상 데이터
- PCR 및 직접 염기서열분석을 통하여 PGK 2 유전자에서 20개의 SNP를 발견하였다(Fig. 1). 현재까지 Genbank에 돼지 PGK 2 유전자는 42개의 SNP가 보고되어 있으나, 성장형질과 연관된 SNP는 아직 보고되어 있지 않다.
- PGK 2 유전자 내 SNP 발굴을 위하여, 각각 품종이 다른 재래 돼지, Duroc, Berkshire, Yorkshire, Landrace, Minipig 품종으로 부터 각각 8두씩 총 48두를 이용하였다. PGK 2 유전자의 promoter 영역 및 transcription 영역의 증폭 및 확인을 위한 8개의 primer는 NCBI Genbank (Acession NO.
- 본 연구에 사용된 공시재료는 농촌진흥청 국립축산과학원의 순종 재래돼지(Korean Native Pig, KNP) 5두와 Landrace 9두의 품종간 교배를 통해 F1을 생산하고, F1 간의 교배를 통해 F2 집단 268두를 생산하였다. 사용된 집단은 성장 형질인 생시 체중과 3, 5, 12, 30 주령 체중 및 일당증체량의 기록을 보유하고 있다.
- 집단 268두를 생산하였다. 사용된 집단은 성장 형질인 생시 체중과 3, 5, 12, 30 주령 체중 및 일당증체량의 기록을 보유하고 있다.
데이터처리
- 돼지 각 개체의 유전자형과 성장 형질과의 연관성 분석을 실시하였다. 연관성 분석은 SAS package (Version 9.01; SAS, Inst., Inc., Cary, NC)의 혼합 효과 모형(MIXED)을 이용하였으며, 유전자형의 효과와 유의한 형질들에 대해 최소 유의 검정차이에 대한유의성을 조사하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.
이론/모형
- 개체별로 결정된 염기서열은 SNP 확인을 위하여 Lasergene SeqMan program (DNASTAR, Inc., USA)을 사용하였다. 확인된 SNPs는 PCR-RFLP 방법을 이용하여 유전자형을 결정하였다.
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, USA)을 사용하였다. 확인된 SNPs는 PCR-RFLP 방법을 이용하여 유전자형을 결정하였다. 증폭된 PCR 산물은 MboⅡ 제한효소(5'-GAAGA(N)8
성능/효과
- G > A (3'-UTR 영역) 등 4개의 SNP를 제외한 16개의 SNPs는 모두 신규 SNP로 확인 되었다.
- T > G SNP는 3주령 체중(p<0.001) 및 생시 체중(p<0.01)에서 유의적인 차이가 관찰되었으나, 5, 12, 30 주령 체중 및 일당증체량은 유의적 연관성을 확인할 수 없었다(Table 4).
- T > G SNP의 경우 GT 및 GG 유전자형이 TT 유전자형 보다 생시 체중에서 더 우수한 효과를 보였으며, 3주령 체중에서도 GT 및 GG 유전자형이 TT 유전자형에 비하여 더 우수한 것으로 확인되었다(Table 4).
- T > G 다형을 재래돼지와 Landrace를 이용한 F2 집단 268두 자돈의 성장 형질과의 연관성 분석을 실시한 결과, 생시 체중(p<0.01) 및 3주령 체중(p<0.001)에서 통계적으로 고도의 유의적 연관성이 있음을 확인 할 수 있었다.
- 또한 김 등(2005)의 연구에 의하면 성장률에 관여하는 FABP3 유전자의 promoter 상에서 발견된 신규돌연변이가 한국재래돼지와 Landrace 교배조합의 F2 집단에서 초기 성장 단계라 할 수 있는 생시, 3주, 5주, 12 주령 체중과는 유의적 연관성을 보인다. 본 연구에서도 생시 체중은 이유 시 일령인 3 주령 체중과 높은 유의적 연관성이 확인됨을 알 수 있었다.
- TT형은 절단되지 않는 542 bp 1개의 band 만 나타났다. 유전자형 빈도는 GG형, GT형, TT형이 각각 40두(14.9%), 128두(47.8%), 100두(37.3%)로 나타났다. 또한 SNP 확인을 위하여 사용된 재래돼지․Duroc․ Berkshire․Yorkshire․Landrace․Minipig 등 6개 품종에 대한 유전자형 및 대립유전자 빈도는 Table 3에 제시하였다.
- 122 T > G SNP를 재래돼지와 Landrace의 F2 집단 268두를 대상으로 PCR-RFLP 방법을 통하여 유전자형을 조사 하였고, 대립유전자빈도 분석을 수행하였다(Table 2). 확인 결과 GG 유전자형은 2개의 band로 92 bp와 450 bp로 절단되어 2개의 band로 나타났으며, GT형은 절단되지 않는 542 bp와 절단된 92bp 와 450 bp 등 3개의 band로 나타났다. TT형은 절단되지 않는 542 bp 1개의 band 만 나타났다.
후속연구
- 이상의 연구 결과로 판단하여 볼 때 현재 돼지 PGK 2 유전자는 돼지의 성장 형질에 관여한다는 연구 결과는 없다. 그러나 해당과정 중 전이 및 동질효소로서 작용하여 에너지 대사에 관여하며 유전자의 기능에 영향을 줄 수 있는 PGK 2 유전자의 promoter 영역내의 SNP가 생시 체중 및 3주령 체중과 유의적 연관성이 있음을 확인하여, 건강한 자돈 및 종돈을 조기 선발하는 DNA marker로 개발하는데 활용 함으로서 향후 국내 양돈산업에 크게 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 그리고 연구 대상을 다른 품종으로 확대하여 돼지 PGK 2 유전자에 대한 추가적인 연구가 이루어 져야 할 것으로 사료된다.
- 그러나 해당과정 중 전이 및 동질효소로서 작용하여 에너지 대사에 관여하며 유전자의 기능에 영향을 줄 수 있는 PGK 2 유전자의 promoter 영역내의 SNP가 생시 체중 및 3주령 체중과 유의적 연관성이 있음을 확인하여, 건강한 자돈 및 종돈을 조기 선발하는 DNA marker로 개발하는데 활용 함으로서 향후 국내 양돈산업에 크게 기여할 수 있을 것으로 판단된다. 그리고 연구 대상을 다른 품종으로 확대하여 돼지 PGK 2 유전자에 대한 추가적인 연구가 이루어 져야 할 것으로 사료된다.
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