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문제 정의
- 본 연구는 우리나라 어디에서나 자생하며, 산성비에 비교적 높은 감수성을 보이는 것으로 보고된(Kim 등 2000) 초본식물인 봉선화를 대상으로 H2O2의 함량 변화와 생체막 지질의 조성 변화를 조사하여 산성비에 의한 산화스트레스 생성 여부와 이를 막기 위한 식물의 방어기작을 조사하기 위하여 수행하였다.
제안 방법
- 2주간의 인공산성비 처리 후, 1g의 봉선화 잎을 채취하여 액체질소로 동결분쇄하고 5ml의 20mM K-phosphate buffer(pH 7.0)를 첨가하여 추가로 마쇄한 다음, 15분간 원심분리(12,000g)하여 그 상징액을 함량분석에 이용하였다. H2O2의 정량분석은 Lee 등(1999)의 방법의 따라 0.
- 0) 250ul 및 상징액 700ul를 혼합하여, 30℃에서 10분간 peroxidase와 dianisidine으로 반응을 시킨 뒤, 1N perchloric acid 200μl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 각각의 샘플은 재차 원심분리 후 그 상징액을 흡광도 436nm에서 UV-spectrophotometer로 측정하여 H2O2의 함량을 결정하였다.
- 봉선화(Impatiens balsamina L.) 종자를 2% sodium hypochloride 용액으로 표면 살균하고 세척한 후, 500g의 배양상토(N：P2O5：K2O = 0.21g：0.41g：0.38g)를 넣은 플라스틱 포트에 1개체씩 파종하여 인공기상실에서 생육시켰다. 인공기상실 내의 온도는 낮(7시～19시)이 30℃, 밤(19시～7시)이 20℃이었으며, 습도는 주야간 공히 70±5%를 유지하였다.
- 산성비에 대한 봉선화의 피해양상과 지질조성 변화 및 방어기작 등을 조사하기 위하여 2주 동안 여러 농도(pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.6)의 인공산성비 실험을 수행하였다. 인공산성비의 pH가 낮을수록 생육피해가 심하게 나타났다.
- 산성비는 식물에 유해한 활성산소를 생성시키는것으로 추정되고 있다(Koricheva 등 1997; Kim 2005). 이를 확인하기 위해 인공산성비 처리에 의한 H2O2의 생성량을 조사하였다(그림 2). H2O2 함량은 pH 4.
- 인공산성비 처리는 각 pH 농도별 용액을 3일 간격으로 자연 강우와 같이 식물체가 완전히 젖을 정도로 처리하였다.
- 인공산성비가 봉선화 잎의 엽록소 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 2주간 산성비를 처리한 봉선화 잎 1g을 채취하여 99.5% ethanol에 넣고 4℃의 암상태에서 48시간 추출하였다. 엽록소 함량은 spectrophotometer(UV-1200, Shimadzue Co.
- 인공산성비의 제조는 Singh와 Agrawal(1996)의 방법에 따라 1N H2SO4와 1N HNO3를 이용하여 pH가 각각 2.0, 3.0, 4.0인 용액을 만들어 사용하였으며, 대조구는 일반적으로 산성비의 기준이 되는 pH 5.6용액을 제조하여 사용하였다.
대상 데이터
- 인공기상실 내의 온도는 낮(7시～19시)이 30℃, 밤(19시～7시)이 20℃이었으며, 습도는 주야간 공히 70±5%를 유지하였다. 3주 동안 생육시킨 건전한 식물체를 선발하여 공시식물로 사용하였다.
데이터처리
- 측정치에 대한 통계처리는 one-way ANOVA에 의해 분석하고, 평균은 Tukey HSD에 의한 다중비교를 하였다(5% 유의수준).
이론/모형
- 8)를 넣고 마쇄한 후, 4℃에서 20분간 원심분리(20,000g)하여 얻은 상등액을 효소활성분석에 사용하였다. Catalase 활성도는 Chance와 Machiy(1955)의 방법에 따라 H2O2의 기질이 분해되는 흡광도 240nm(39.4mM-1cm-1)의 감소 값을 측정하여 산출하였다.
- H2O2의 정량분석은 Lee 등(1999)의 방법의 따라 0.02% dianisidine 250ul, 5unit의 peroxidase(RZ3.1)/100mM potassium phosphate buffer(pH 6.0) 250ul 및 상징액 700ul를 혼합하여, 30℃에서 10분간 peroxidase와 dianisidine으로 반응을 시킨 뒤, 1N perchloric acid 200μl를 첨가하여 반응을 중지시켰다.
- Polyamine 함량 분석을 위하여 2주간의 인공산성비를 처리한 봉선화 잎 1g을 채취하여 10ml의 0.5M HClO4를 넣어 추출한 후, Walters(2003)의 방법에 따라 HPLC(Shimadzu LC-6A)를 이용하여 분석하였다.
- )를 넣고 30℃에서 5시간 동안 진탕한 후, 40℃에서 감압 농축하였다. 농축된 시료를 Norman 등(2001)의 방법에 따라 메틸화시킨 후 GC(Shimadzu GC-9A)를 이용하여 분석하였다.
- 5% ethanol에 넣고 4℃의 암상태에서 48시간 추출하였다. 엽록소 함량은 spectrophotometer(UV-1200, Shimadzue Co., Kyoto, Japan)를 이용하여 Knudson 등(1977)의 방법에 따라 664nm 및 649nm에서 흡광도를 측정하여 함량을 조사하였다.
성능/효과
- 한편 불포화지방산인 16：1 및 18：3의 비율의 경우 포화지방산과 반대의 경향을 나타내었다. 16：1의 비율이 pH 2.0 처리에서 1.05%를 나타내어 대조구인 pH 5.6처리의 1.28%에 비해 약 22% 감소하는 것으로 나타났으며, 18：3의 비율도 pH 2.0 처리에서 83.0%를 나타내어 대조인 pH 5.6 처리의 85.12%에 비해 약 3% 감소하는 것으로 나타났다. 즉 당지질의 경우 인공산성비처리에 의해 포화지방산(16：0, 18：0) 비율이 증가하는 것에 반해, 불포화지방산(16：1과 18：3 등) 비율의 감소를 보였으며, 이에 따라 포화지방산에 대한불포화지방산의 비율이 pH 2.
- 본 실험 결과 봉선화 잎에는 putrescine(Put), spermidine(Spd), spermine(Spm)의 3종류의 polyamine이 존재하는 것으로 나타났다(그림 3). 3종류의 polyamine 모두 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 증가하는 경향을 보였다. 특히 봉선화에 가장 많이 존재하는 Spd의 경우 pH 5.
- 45%를 나타내어 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 또한 불포화지방산인 16：1 및 18：3의 비율은 pH 5.6 처리에서 각각 6.28% 및 49.55%를 나타내었으나 pH 2.0 처리에서 각각 5.42% 및 47.75%를 나타내어 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 이에 따라 인지질의 포화지방산에 대한 불포화지방산의 비율이 pH 2.
- H2O2는 superoxide를 SOD가 소거한 결과로 생성된 것으로 그 자체로는 세포에 미치는 해는 적으나 Fe2+와 반응하여 산화력이 매우 높은 hydroxy radical을 생성하여 생체막의 과산화를 일으키는 것으로 알려져 있다(Lee 등 1999). 또한 산성비에 의한 지질과산화 산물인 malondialdehyde 함량 증가가 봉선화를 이용한 Kim(2005)의 실험에서 보고되어 있는데 이를 종합해볼 때 인공산성비에 의해 활성산소의 일종인 H2O2가 생성되고 이로 인해 생체 막 지질의 변화가 일어날 것으로 추측된다. 생체내의 막 지질은 활성산소 생성에 민감하게 반응하는 부분으로 알려져 있다(Foyer 등 1994; Zeeshan과 Prasad 2009).
- Polyamine은 일반적으로 항 노화물질로 알려져 있으며, 생체막의 지질과산화를 억제하는 것으로 알려져 있다(Walters 2003). 본 실험 결과 봉선화 잎에는 putrescine(Put), spermidine(Spd), spermine(Spm)의 3종류의 polyamine이 존재하는 것으로 나타났다(그림 3). 3종류의 polyamine 모두 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 증가하는 경향을 보였다.
- 일반적으로 산성비는 식물 잎에 황화 및 괴사를 일으키는 것으로 보고되어 있다(Haines 등 1980). 본 실험에서 2주간의 인공산성비 처리는 봉선화에 극심한 가시피해와 생육억제를 초래하였으며, 인공산성비의 pH가 낮아질수록 피해는 심한 것으로 나타났다(그림 1). 특히 pH 3.
- Catalase는 SOD 등과 함께 대표적인 활성산소 소거에 관여하는 효소로 알려져 있다(Turrens 2010). 본 실험에서 pH 4.0, 3.0, 2.0의 인공산성비 처리에 의해 Catalase의 활성이 pH 5.6에 비해 크게 증가하는 것으로 나타났다. Catalase의 활성 증가는 오존이나 UV-B 등에 의해서도 일어난다고 보고되어 있으며(Mcclung 1997; Yan 등 2010), 인공산성비에 의해 생성된 H2O2 등의 활성산소의 무독화를 위해 증가한 것으로 사료된다.
- 오이를 이용한 실험에서 산성비에 의한 엽록소 함량 감소(Wyrwicka와 Sklodowska 2006)와 각 엽록소 단위 당 광합성 활력 저하가 보고되어 있다(Neves 등 2009). 본 실험에서 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 엽록소 함량이 감소하는 것으로 나타나 pH 2.0 처리에서는 대조구인 pH 5.6 처리에 비하여 약 50% 전후의 엽록소 함량 감소를 나타내었다(그림 2). 엽록소는 빛에너지를 흡수하는 광 수용체이므로, 인공산성비에 의한 엽록소 감소는 광합성 저하 및 건물생산의 저하로 이어질 것으로 추측된다.
- 인지질과 당지질 모두 인공산성비에 의해 포화지방산이 증가하고 불포화지방산이 감소하는 것으로 나타났다. 봉선화에는 주로 3종류의 polyaimne이 존재하며 이들 모두 인공산성비의 pH가 낮을수록 증가하는 것으로 나타났다. Catalase의 활성도 인공산성비의 pH가 낮을수록 증가하였다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때, 인공산성비는 활성산소 생성에 의한 생육억제, 및 지방산 변화를 일으키는 것으로 추정되며, polyamine 함량 증가와 catalase 활성 증가는 산성비의 피해를 최소화하기 위한 방어기작이 작용한 것으로 사료된다.
- Catalase의 활성도 인공산성비의 pH가 낮을수록 증가하였다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, 인공산성비에 의해 활성산소 생성되고, 지방산의 변화를 일어나며, polyamine 증가와 catalase 활성 증가는 산성비의 피해를 최소화하기 위한 방어기작이 작용한 것으로 사료된다.
- 75%를 나타내어 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 이에 따라 인지질의 포화지방산에 대한 불포화지방산의 비율이 pH 2.0 처리에서 2.18을 나타내어 대조인 pH 5.6 처리의 2.44에 비해 약 11% 감소하는 것으로 나타났다(표 2).
- 인공산성비의 pH가 낮을수록 생육피해가 심하게 나타났다. 인공산성비의 pH가 낮을수록 엽록소 함량은 감소하였으며 H2O2 함량은 증가하였다. 인지질과 당지질 모두 인공산성비에 의해 포화지방산이 증가하고 불포화지방산이 감소하는 것으로 나타났다.
- 인공산성비의 pH가 낮을수록 엽록소 함량은 감소하였으며 H2O2 함량은 증가하였다. 인지질과 당지질 모두 인공산성비에 의해 포화지방산이 증가하고 불포화지방산이 감소하는 것으로 나타났다. 봉선화에는 주로 3종류의 polyaimne이 존재하며 이들 모두 인공산성비의 pH가 낮을수록 증가하는 것으로 나타났다.
- 인공산성비에 의한 인지질의 구성도 당지질의 구성변화와 유사한 경향을 나타내었다(표 2). 인지질의 포화지방산인 16：0 및 18：0의 비율이 pH 5.0 처리에서 각각 25.88% 및 3.19%를 나타내었으나, pH 2.0 처리에서 각각 27.98% 및 3.45%를 나타내어 인공산성비의 pH가 낮아짐에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 또한 불포화지방산인 16：1 및 18：3의 비율은 pH 5.
- 12%에 비해 약 3% 감소하는 것으로 나타났다. 즉 당지질의 경우 인공산성비처리에 의해 포화지방산(16：0, 18：0) 비율이 증가하는 것에 반해, 불포화지방산(16：1과 18：3 등) 비율의 감소를 보였으며, 이에 따라 포화지방산에 대한불포화지방산의 비율이 pH 2.0 처리에서 8.57을 나타나 대조구인 pH 5.6 처리의 10.38에 비해 약 17.5% 감소한 것으로 나타났다(표 1).
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