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문제 정의
- 이처럼 삼지구엽초는 항산화, 항암, 간기능 증진, 고협압 억제효과 등 생리활성이 높아 활용성이 더욱 높은 것으로 판단되며, 이는 주성분인 icariin 함량 차이가 주원인인 것으로 보고되어 있으나(9), 삼지구엽초의 항돌연변이 및 면역활성에 관한 연구는 아직 미비하다. 따라서 본 연구에서는 삼지구엽초를 기능성식품 소재로서 활용하기 위하여 주성분인 icariin 함량에 따른 삼지구엽초 추출물의 항돌연변이 및 면역활성을 검토하고자 하였다.
- 예로부터 삼지구엽초는(Epimedium koreanum Nakai)는 한방에서 강장, 강정, 이뇨 등의 약재로 이용되어 왔다. 본 연구에서는, 삼지구엽초의 주성분인 icariin의 함량에 따른 항돌연변이 및 면역활성을 탐색하여 향후 기능성 식품소재로서 활용하고자 하였다. Ames test 결과, icariin 함량에 따른 삼지구엽초 추출물은 TA98 및 TA100 균주 모두에서 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 돌연변이원성이 없는 것으로 나타났다.
제안 방법
- Histidine/biotin이 첨가된 top agar를 2 mL씩 각 tube에 붓고 3초간 vortex하고 minimal glucose agar plate 상에 도말하고 평판 고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이(his+ revertant colony) 수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
- 이것을 20분간 preincubation한 다음 histidine/biotin이 첨가된 45℃의 top agar를 2 mL씩 각 tube에 붓고 minimal glucose agar plate 상에 도말하고 평판 고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이 수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 아래의 식에 의하여 계산하였으며, 대조구로는 삼지구엽초 추출물을 첨가하지 않은 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 사용하여 균 생육억제 유무를 판정하였다.
- 지금까지 세균시험계를 사용하여 삼지구엽초의 항돌연변이 효과를 연구한 보문은 전무한 실정이며, Ames test를 사용한 본 저자의 연구에 의해 처음으로 삼지구엽초의 돌연변이 억제효과를 강하게 나타내는 항돌연변이 물질이 icariin이라는 것을 확인할 수 있었다. 삼지구엽초 추출물로 강력한 발암물질인 4-Nitroquinoline-1-oxide(4NQO)를 사용하여 각각의 농도에 따른 항돌연변이원성 억제효과를 검토하였다. S.
- 삼지구엽초 추출물의 면역 증진 효과는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT; Sigma, St Louis, MD, USA) assay(17, 18)와 24 well plate에 세포를 2.0×104 cells/mL의 농도로 조절한 후 시료를 투여하여 8일 동안 배양시키며 매일매일 각 well의 cell을 hemacytometer로 세포수를 측정하여 생육증강도를 측정하는 두 가지 방법을 사용하였다.
- 삼지구엽초의 뿌리, 줄기, 잎 중 뿌리와 줄기는 증류수로 2-3차례 수세한 다음 음건하였고, 잘게 세절하였다. 이들 시료를 일정량 취하여 삼각플라스크에 넣고, 10배의 증류수를 사용하여 열수추출에서는 90℃에서 7시간 동안 2회 환류 추출하였고, 에탄올 추출은 70% 에탄올을 첨가하여 50℃에서 3시간동안 2회 환류 추출한 다음 No.
- 4)로 전체량이 700 μL가 되도록 하였다. 이것을 20분간 preincubation한 다음 histidine/biotin이 첨가된 45℃의 top agar를 2 mL씩 각 tube에 붓고 minimal glucose agar plate 상에 도말하고 평판 고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이 수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 돌연변이 억제효과의 정도(inhibition rate)는 아래의 식에 의하여 계산하였으며, 대조구로는 삼지구엽초 추출물을 첨가하지 않은 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 사용하여 균 생육억제 유무를 판정하였다.
- 삼지구엽초의 뿌리, 줄기, 잎 중 뿌리와 줄기는 증류수로 2-3차례 수세한 다음 음건하였고, 잘게 세절하였다. 이들 시료를 일정량 취하여 삼각플라스크에 넣고, 10배의 증류수를 사용하여 열수추출에서는 90℃에서 7시간 동안 2회 환류 추출하였고, 에탄올 추출은 70% 에탄올을 첨가하여 50℃에서 3시간동안 2회 환류 추출한 다음 No. 2 여과지로 각각 여과하였다. 여과액을 감압농축기를 사용하여 농축 후 동결건조기로 건조시킨 다음 본 실험에 사용하였다.
- 인간의 면역체계에서 중요한 역할을 하는 면역세포인 B cell과 T cell에 대하여 면역증진 효과를 확인하기 위하여 면역세포의 생육 촉진 효과를 생육도를 통하여 측정하였으며, 열수 추출물과 에탄올에 의한 추출물의 B cell (Rhamos)의 생육촉진 결과는 Fig. 5에 나타내었다. 열수 추출물의 경우 시료농도 1000 μL/mL에서 KE9408 1.
- 항돌연변이원성 실험은 microsomal enzyme의 대사활성에 의해서만 돌연변이원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 polycyclic aromatic hydrocarbon인 benzo(α)pyrene (B(α)P)을 사용하여 실험을 하였으며, S. typhimurium TA98에 대한 열수 추출물과 에탄올 추출물의 항돌연변이원성은 Fig. 1에 나타내었다.
대상 데이터
- 변이원성 및 항돌연변이원성 실험에 사용한 균주 Salmonella typhimurium TA98과 TA100은 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양 받아 사용하였다. 변이원성 및 항돌연변이 원성 실험은 Ames test를 개량한 preincubation mutagenicity 방법(16)으로 실시하였다.
- 본 실험에 사용한 면역 증진 효과 검증세포는 인간 면역세포인 T-cell (Molt-4)과 B-cell (Rhamos)을 이용하여 검증하였다. 삼지구엽초 추출물의 면역 증진 효과는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra-zolium bromide (MTT; Sigma, St Louis, MD, USA) assay(17, 18)와 24 well plate에 세포를 2.
- 본 실험에 사용한 삼지구엽초(Epimedium koreanium Nakai)는 경기도 농업기술원에서 재배되고 있는 삼지구엽초를 icariin 함량의 차이에 따라 KE9405(icariin 함량 0.20%), KE9408(icariin 함량 0.40%)와 KE9412(icariin 함량 0.59%) 품종을 제공받아 본 실험에 사용하였다(15).
- Histidine/biotin이 첨가된 top agar를 2 mL씩 각 tube에 붓고 3초간 vortex하고 minimal glucose agar plate 상에 도말하고 평판 고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이(his+ revertant colony) 수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 항 돌연변이 실험에 사용된 발암물질은 B(a)P 및 4NQO를 사용하였다. 미리 건열 멸균시킨 glass cap tube에 icariin 50 μL를 첨가한 다음 하룻밤 배양된 균주를 100 μL씩 주입한 후, 0.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하였고, Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 SAS(ver. 12.0, Statistical Analysis System, Milwaukee, WI, USA)를 이용하였다.
이론/모형
- 변이원성 및 항돌연변이원성 실험에 사용한 균주 Salmonella typhimurium TA98과 TA100은 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양 받아 사용하였다. 변이원성 및 항돌연변이 원성 실험은 Ames test를 개량한 preincubation mutagenicity 방법(16)으로 실시하였다. 건열 멸균시킨 glass cap tube에 각각의 삼지구엽초 추출물 50 μL씩 가하고, TA culture 배지에서 하룻밤 배양된 균주 100 μL를 가한 다음 0.
성능/효과
- 8에 나타내었다. Icariin 함량에 따른 삼지구엽초의 생 세포수를 측정한 결과 B cell과 T cell 모두에서 KE9405는 4일째, KE9408은 5일째, KE9412는 4일째 생육이 최대로 나타났다(Fig. 7-8). 열수 추출물은 B cell과 T cell 모두에서 KE9405가 대조군에 비해 각각 2.
- Ames test 결과, icariin 함량에 따른 삼지구엽초 추출물은 TA98 및 TA100 균주 모두에서 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 돌연변이원성이 없는 것으로 나타났다. 간접변이균인 B(a)P 항돌연변이 실험에서는 열수 및 에탄올 추출물이 각각 80% 그리고 90% 이상을 그리고, 직접변이균인 4NQO 항돌연변이균에서는 70% 이상으로 icariin 함량이 많은 순인 KE9412, KE9408, KE9405 순으로 항돌연변이 억제효과를 각각 나타내었다. 인간면역세포인 B와 T 세포를 이용한 면역활성 실험결과, 열수 추출물에서는 icariin 함량이 적은 KE9405가 1.
- 3 μL/mL과 비교하여 TA98 균주에서와 마찬가지로 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서, icariin 함량에 따른 삼지구엽초 추출물은 TA98 및 TA100 균주 모두에서 집락수가 음성대조군에 비하여 농도 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 돌연변이원성이 없는 것으로 나타났다(Table 1).
- 또한 다른 많은 연구결과에서 이들 화합물이 항산화효과를 유발 할 수 있다는 연구결과도 보고되어 있다(28-31). 따라서, 본 연구에서 삼지구엽초는 S. typhimurium strain TA98 및 TA100에 대한 돌연변이를 유발하지 않으며, 이러한 Ames test 결과 안전한 식품소재라 할 수 있다. 아울러 삼지구엽초가 항돌연변이능을 가지는 것으로 보아 이러한 안전성과 건강기능성을 활용한 식품소재로서 효용 가치가 높을 것으로 사료된다.
- 삼지구엽초의 항돌연변이원성을 알아본 결과, B(α)P나4NQO에서 전반적으로 TA98과 TA100 균주 모두에서 항돌연변이원성 활성이 높았다.
- 7-8). 생육촉진 실험과 생육활성 실험에서 에탄올 추출물보다 열수 추출물의 활성이 더 높게 측정되었으며, 이는 삼지구엽초에 포함된 면역활성 기능이 있는 유용성분 물질인 icariin이 높은 온도에서 나오는 수용성 물질로 사료되어진다. 또한 한약재로 상용되는 물질들의 면역활성과 삼지구엽초 추출물을 비교해 보면 대조구에 비해 B cell과 T cell에서 Kim 등(32)은 씀바귀 열수 추출물과 에탄올 추출물의 면역활성이 각각 1.
- 에탄올 추출물에서는 KE9408과 KE9412가 시료 농도 750 μL/mL에서 약 80% 정도의 항돌연변이를 나타내었고 시료농도 1000 μL/mL에서는 KE9405, KE9408, KE9412 모두에서 열수 추출물과 마찬가지로 저해율이 90% 이상을 나타냈으며(Fig. 1B), 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 시료 농도가 증가할수록 돌연변이 억제율(%)이 증가함을 나타내었다.
- 에탄올 추출물에서는 시료농도 500 μL/mL에서 KE9405, KE9408, KE9412 모두 항돌연변이 억제율이 65% 이상을 나타내었고, 시료농도 1000 μL/mL에서는 KE9405, KE9408, KE9412 모두에서 80% 이상의 억제효과를 보이고 있으며 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두, 시료농도가 증가할수록 돌연변이 억제효과도 높은 것으로 나타났다(Fig. 3B).
- 에탄올 추출물에서는 시료농도 750 μL/mL에서 KE9405, KE9408, KE9412 모두 70% 이상의 억제율을 보였고, 1000 μL/mL에서는 각 시료 모두 95%이상의 높은 억제율을 나타내었다(Fig. 2B).
- 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 시료 농도 1000 μ L/mL에서 돌연변이 저해율이 85%이상으로 나타냈으며(Fig. 4), 열수 추출물보다 에탄올 추출물의 돌연변이 억제 효과가 더 좋게 나타났다.
- 2B). 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 시료농도가 증가함에 따라 억제율(%)도 증가하였으며 열수 추출물과 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 비교해 보았을 때 항돌연변이 효과는 두 추출물 사이에서 별다른 차이를 보이지 않았다. 지금까지 세균시험계를 사용하여 삼지구엽초의 항돌연변이 효과를 연구한 보문은 전무한 실정이며, Ames test를 사용한 본 저자의 연구에 의해 처음으로 삼지구엽초의 돌연변이 억제효과를 강하게 나타내는 항돌연변이 물질이 icariin이라는 것을 확인할 수 있었다.
- 열수 추출물에서 KE9405와 KE9408이 시료 농도 500 μL/mL에서 inhibition이 80%이상을 나타냈으며, 시료농도 1000 μ L/mL에서는 KE9405, KE9408, KE9412 모두에서 90%이상 억제효과를 나타내었다(Fig. 1A).
- 열수 추출물에서는 시료농도 750 μL/mL에서 KE9408과 KE9412에서 70%의 돌연변이 억제효과를 나타냈으며, 1000 μL/mL에서는 모두 85% 이상의 억제 효과를 나타내었다(Fig. 3A).
- 열수 추출물에서는 시료농도 750 μL/mL에서 KE9408과 KE9412에서 돌연변이 억제율이 약 80%로 나타났으며, 1000 μL/mL에서는 KE9405, KE9408, KE9412 모두에서 90% 이상으로 icariin 함량이 많은 시료가 더 높은 억제율을 나타내었다(Fig. 2A).
- 7-8). 열수 추출물은 B cell과 T cell 모두에서 KE9405가 대조군에 비해 각각 2.27배, 1.72배의 활성을 나타내었고, 에탄올 추출물은 KE9408에서 B cell과 T cell에서 각각 1.65배, 1.34배를 나타내었다(Fig. 7-8). 생육촉진 실험과 생육활성 실험에서 에탄올 추출물보다 열수 추출물의 활성이 더 높게 측정되었으며, 이는 삼지구엽초에 포함된 면역활성 기능이 있는 유용성분 물질인 icariin이 높은 온도에서 나오는 수용성 물질로 사료되어진다.
- 열수 추출물의 경우 시료농도 1000 μL/mL에서 KE9408 1.3배, KE9412 1.2배, KE9405 1.0배의 순으로 생육촉진 활성을 나타냈으며(Fig. 5A), 에탄올 추출물에서는 열수 추출물과 달리 KE9412 1.17배, KE9408 1.1배, KE9405 1.05배의 순으로icariin 함량이 많을수록 생육촉진도 높게 나타났다(Fig. 5B).
- 6에 나타내었다. 열수 추출물의 생육촉진 활성은 KE9405, KE9408, KE9412의 순으로 대조군과 비교하여 각각 1.84배, 1.6배, 1.53배의 활성을 나타내었고(Fig. 6A), 에탄올 추출물의 생육촉진은 열수 추출물의 생육촉진과 반대로 KE9412 1.74배, KE9408 1.52배, KE9405 1.4배의 순으로 나타났으며(Fig. 6B), 에탄올 추출물보다 열수 추출물의 생육촉진활성이 더 높게 나타났다. B cell과 T cell의 생육 활성도를 배양 시간별로 8일 동안 생 세포수를 측정한 결과는 Fig.
- 간접변이균인 B(a)P 항돌연변이 실험에서는 열수 및 에탄올 추출물이 각각 80% 그리고 90% 이상을 그리고, 직접변이균인 4NQO 항돌연변이균에서는 70% 이상으로 icariin 함량이 많은 순인 KE9412, KE9408, KE9405 순으로 항돌연변이 억제효과를 각각 나타내었다. 인간면역세포인 B와 T 세포를 이용한 면역활성 실험결과, 열수 추출물에서는 icariin 함량이 적은 KE9405가 1.8배로 가장 높은 활성을 나타냈으나, 에탄올 추출물에서는 열수 추출물과는 반대로 icariin 함량이 많은 KE9412가 1.74배로 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 인하여, 삼지구엽초는 항돌연변이능과 면역활성 효능을 가지고 있으므로, 건강 기능성 식품 소재로의 효용 가치가 높을 것으로 판단된다.
- 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 시료농도가 증가함에 따라 억제율(%)도 증가하였으며 열수 추출물과 에탄올 추출물의 항돌연변이 효과를 비교해 보았을 때 항돌연변이 효과는 두 추출물 사이에서 별다른 차이를 보이지 않았다. 지금까지 세균시험계를 사용하여 삼지구엽초의 항돌연변이 효과를 연구한 보문은 전무한 실정이며, Ames test를 사용한 본 저자의 연구에 의해 처음으로 삼지구엽초의 돌연변이 억제효과를 강하게 나타내는 항돌연변이 물질이 icariin이라는 것을 확인할 수 있었다. 삼지구엽초 추출물로 강력한 발암물질인 4-Nitroquinoline-1-oxide(4NQO)를 사용하여 각각의 농도에 따른 항돌연변이원성 억제효과를 검토하였다.
후속연구
- typhimurium strain TA98 및 TA100에 대한 돌연변이를 유발하지 않으며, 이러한 Ames test 결과 안전한 식품소재라 할 수 있다. 아울러 삼지구엽초가 항돌연변이능을 가지는 것으로 보아 이러한 안전성과 건강기능성을 활용한 식품소재로서 효용 가치가 높을 것으로 사료된다.
- 74배로 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 인하여, 삼지구엽초는 항돌연변이능과 면역활성 효능을 가지고 있으므로, 건강 기능성 식품 소재로의 효용 가치가 높을 것으로 판단된다.
- 4배라고 보고하였으나, 본 연구의 시료인 삼지구엽초 추출물의 열수 추출물과 에탄올 추출물의 면역활성이 이들보다 높은 것으로 나타났다. 이러한 면역증진활성의 확인은 삼지구엽초의 향후 식품산업에 있어서의 면역증강 효능을 가진 삼지구엽초의 건강 기능성식품 개발에 매우 중요한 자료가 될 수 있으며, 약용식물의 부가가치를 좀더 높이고, 이에 따른 수요증대에도 기여할 것으로 사료되어진다.
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