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문제 정의
- 임상에서 울금, 결명자와 마우의 단미를 사용하는 것보다 세 약물을 배오한 감비경신환(2)를 사용한 것이 내장지방 개선효과가 더 있는 것으로 나타나 동물 실험상에서도 같은 효과가 있는지를 검증하고자 본실험을 수행하게 되었다. 본 연구에서는 8주령의 고지방식이 유발 수컷 마우스 비만모델을 이용하여 감비경신환(2)의 투여가 체중 증가량, 식이효율, 혈중 비만조절 관련 지표와 독성지표, 지방조직의 무게는 어떻게 변화하는지, 특히 내장지방의 개선에는 어떤 영향을 주는 지에 대해서 조사하였다.
- 본 연구에서는 고지방식이 마우스 비만모델을 이용하여 감비경신환(2)(GGH(2))의 투여가 체중증가량의 변화에 따라 중성지방과 지방무게 특히 내장지방에 어떤 영향을 미치는 지에 대해서 알아보았다.
- 임상에서 울금, 결명자와 마우의 단미를 사용하는 것보다 세 약물을 배오한 감비경신환(2)를 사용한 것이 내장지방 개선효과가 더 있는 것으로 나타나 동물 실험상에서도 같은 효과가 있는지를 검증하고자 본실험을 수행하게 되었다. 본 연구에서는 8주령의 고지방식이 유발 수컷 마우스 비만모델을 이용하여 감비경신환(2)의 투여가 체중 증가량, 식이효율, 혈중 비만조절 관련 지표와 독성지표, 지방조직의 무게는 어떻게 변화하는지, 특히 내장지방의 개선에는 어떤 영향을 주는 지에 대해서 조사하였다.
제안 방법
- 8주 동안 약물을 투여한 뒤에 부검하여 생식기주변 백색지방조직(epididymal adipose tissue, EAT),후복벽 주변 백색지방조직(retroperitoneal adipose tissue, RAT), 사타구니 주변 피하지방조직(inguinal adipose tissue, IAT)과 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)의 무게를 측정하였다.
- GGH(2)-1, GGH(2)-2와 GGH(2)-3이 식욕과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 체중은 매주 2회, 사료섭취량은 매주 1회 9주 동안 측정하였고, 이를 근거로 하여 식이효율을 계산하였다.
- GGH(2)-1, GGH(2)-2와 GGH(2)-3이 체중 증가량에는 어떤 변화를 주는지 알아보기 위하여 매주 2회 9주 동안 체중을 측정하고, 이를 근거로 하여 체중 증가량을 계산하였다.
- GGH(2)가 고지방식이 마우스 비만모델 지방세포의 조직학적, 형태학적 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여 지방조직을 hematoxylin-eosin 염색법으로 염색한 후 현미경 및 image analysis system으로 관찰하였다. 정상군과 비교하여 대조군에서 지방세포의 크기가 크게 증가되었다(normal, 2745.
- GGH(2)에 의하여 체중감량효과가 고지방식이 마우스 비만모델의 지방세포와 간세포의 조직학적, 형태학적 변화에 반영하는지를 조사하였다.
- GGH(2)의 투여가 식이효율에는 어떤 변화를 주고 혈중 leptin 농도에는 어떻게 반영되는 지에 대해서 알아보았다.
- GGH(2)의 투여가 혈중 간장 독성지표인 asparate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT)와 체중조절과 관련된 지표인 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, free fatty acid, triglyceride, glucose, insulin의 농도를 조사하였다. 왜냐하면 GGH(2)의 비만조절효과가 약리작용에 의한 경우도 있지만 이의 독성으로도 생길 수 있기 때문이다.
- 포매과정(embedding)을 거쳐 약 3 ㎛의 두께로 박절(paraffin-section)하여 slide 위에 조직을 얹고 건조시킨 후 hematoxylin-eosin 염색을 하였다. Slide의 물기를 없애고 mounting medium(Sigma, MO, USA)을 떨어뜨린 후 조직과 cover glass 주위에 공기가 생기지 않도록 주의하면서 cover glass를덮어 영구보존 할 수 있도록 하였다. 조직의 사진촬영과 지방세포의 수 및 크기분석은 image analysis system(Image Pro-Plus, MD, USA)을 이용하였다.
- 공시동물로서는 KOATECH(Gyeonggi province, South Korea)에서 공급한 8주령의 C57BL/6N 수컷 마우스 40마리를 사용하였다. 각 군 당 8마리를 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시하고, 이를 실험에 사용하였다.
- 고지방식이 유발 수컷마우스 비만모델을 이용하여 GGH(2)의 투여가 체중 증가량과 지방조직의 무게, 식이효율과 혈중 leptin 농도, 혈중 비만관련 지표, 그리고 지방조직과 간조직의 조직학적, 형태학적 변화를 분석하고 평가하여 다음의 결론을 얻었다.
- 군당 8마리 수컷을 공시하였으며, GGH(2)를 125, 250, 500㎎/㎏의 농도별로 8주간 경구 투여하였다(Table 2).
- 혈액 채취는 실험시작 9주 후 12시간 절식한 뒤 diethyl ether로 마취한 다음 개복하여 복대정맥에서 혈액 1㎖을 채취하였으며, 고속원심분리기(Micro 12, Hanil, Korea)를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 분리된 혈장은 냉동고(-20℃)에 보관하고 혈액생화학분석기(Selectra 2, Vitalab, Netherlands)를 사용하여 asparate aminotransferase, alanine aminotransferase, triglyceride, total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol(HDL-cholesterol), low density lipoprotein cholesterol(LDL-cholesterol), free fatty acid, glucose, insulin과 leptin의 혈중 농도를 각각 측정하였다.
- 사육환경은 온도 21±2 ℃, 습도 55±5 %, 환기횟수 15～17 회/hour, 조도 150～300 lux, 그리고 조명은 12시간 명암(점등: 06:00, 소등: 18:00)으로 조정하여 실험 기간동안 일정하게 SPF(specific pathogen free) 상태로 유지하였다.
- 식이효율은 아래의 공식에 대입시켜 최종 체중증가량을 총 사료섭취량으로 나누어 산출하고 통계 분석하였다.
- 채혈한 뒤에 부검하여 지방조직, 간장, 췌장, 비장, 심장과 신장의 무게를 측정하고, 이들의 크기와 색깔을 관찰하였다.
- 혈액 채취는 실험시작 9주 후 12시간 절식한 뒤 diethyl ether로 마취한 다음 개복하여 복대정맥에서 혈액 1㎖을 채취하였으며, 고속원심분리기(Micro 12, Hanil, Korea)를 이용하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 분리된 혈장은 냉동고(-20℃)에 보관하고 혈액생화학분석기(Selectra 2, Vitalab, Netherlands)를 사용하여 asparate aminotransferase, alanine aminotransferase, triglyceride, total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol(HDL-cholesterol), low density lipoprotein cholesterol(LDL-cholesterol), free fatty acid, glucose, insulin과 leptin의 혈중 농도를 각각 측정하였다.
대상 데이터
- (1) 감비경신환(2)의 조성약물은 화림제약(Busan, South Korea)에서 구입하고, 동의대학교 한의과대학 방제학교실에서 정선한 뒤 분말하였다.
- 공시동물로서는 KOATECH(Gyeonggi province, South Korea)에서 공급한 8주령의 C57BL/6N 수컷 마우스 40마리를 사용하였다. 각 군 당 8마리를 체중범위에 따른 무작위법에 의하여 군 분리를 실시하고, 이를 실험에 사용하였다.
- 13%의 수율을 얻었다. 대조물질은 autoclaved water(멸균수)를 사용하였다.
- 실험물질은 減肥輕身丸(2)의 95% 에탄올 추출물을 사용하여 다음과 같이 제조하였다(Table 1).
데이터처리
- 모든 값은 mean ± standard deviation(SD)으로 표시하며, OriginLab Version 7.5(OriginLab Corporation, MA, USA)의 one way ANOVA를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Slide의 물기를 없애고 mounting medium(Sigma, MO, USA)을 떨어뜨린 후 조직과 cover glass 주위에 공기가 생기지 않도록 주의하면서 cover glass를덮어 영구보존 할 수 있도록 하였다. 조직의 사진촬영과 지방세포의 수 및 크기분석은 image analysis system(Image Pro-Plus, MD, USA)을 이용하였다.
성능/효과
- 1. GGH(2)는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 체중 증가량과 지방무게 특히 내장지방의 무게가 감소하였고, 그 효과는 GGH(2)-3에서더 현저하였다.
- 2) GGH(2)에 의한 간조직의 지방축적 변화고지방식이의 비만형질을 나타내는 비만마우스는 정상 마우스와 비교하여 상당량의 지방이 축적된 지방간을 보여주었으나 이러한 비만마우스에 GGH(2)를 투여하면 간의 지방축적이 감소되었다. 지방세포의 morphology에 미치는 효과와 유사하게 간세포의 지방축적은 세 농도 모두에서 농도 의존적으로 대조군에 비하여 lesion score를 감소시켰으나 GGH(2)-3에서만 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며, 그 감소정도는 6.
- 2. GGH(2)는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 식이효율을 감소하였고, 그 효과는 GGH(2)-3에서 더 현저하였다.
- 3) 혈중 free fatty acid와 triglyceride 농도실험시작 8주 후 혈장 내 free fatty acid와triglyceride의 양을 측정한 결과, free fatty acid의값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 통계적인 유의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, GGH(2)-1에서 대조군에 비하여 높게 나타났고, GGH(2)-2에서 대조군과 비슷하였으며, GGH(2)-3에서 대조군에 비하여 낮은 경향을 보여주었다(Fig. 5-A). Triglyceride의 값은 GGH(2)-1에서 대조군에 비하여 통계적인 유의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, GGH(2)-2와 GGH(2)-3의 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig.
- 3. GGH(2)는 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 혈중 triglyceride의 농도가 낮은 것으로 나타났다.
- 4. GGH(2)는 대조군에 비하여 혈중 AST와 ALT의 농도에 이상이 없는 것으로 나타났다.
- 5. 체중감량효과와 일치하게 GGH(2)에 의하여 지방세포의 수는 증가하였고 그 크기는 감소하였으며, 간세포의 지방축적은 억제하였다.
- EAT, RAT와 IAT의 무게는 GGH(2)-1과 GGH(2)-2에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으며 GGH(2)-3에서는 통계적으로 유의하게 적은 것으로 나타났다. BAT의 무게는 GGH(2)-1에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으며 GGH(2)-2와 GGH(2)-3에서 통계적으로 유의하게 적은 것으로 나타났다(Fig. 1-B).
- EAT, RAT와 IAT의 무게는 GGH(2)-1과 GGH(2)-2에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으며 GGH(2)-3에서는 통계적으로 유의하게 적은 것으로 나타났다. BAT의 무게는 GGH(2)-1에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으며 GGH(2)-2와 GGH(2)-3에서 통계적으로 유의하게 적은 것으로 나타났다(Fig.
- GGH(2)-1은 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid의 농도 값은 약간 높았고, triglyceride의 농도값은 낮았으며, total cholesterol의 농도 값은 비슷하고, HDL-cholesterol의 농도 값은 약간 높았으며, LDL-cholesterol, glucose와 insulin의 농도값은 낮은 것으로 나타났으며, 모든 지표에서 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. GGH(2)-2는 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol과 insulin의 농도값은 낮은 것으로 나타났으며, HDL-cholesterol, glucose의 농도 값은 약간 높은 것으로 나타났으나triglyceride 지표에서만 통계적인 유의성이 있는 것으로 나타났다.
- GGH(2)-1은 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid의 농도 값은 약간 높았고, triglyceride의 농도값은 낮았으며, total cholesterol의 농도 값은 비슷하고, HDL-cholesterol의 농도 값은 약간 높았으며, LDL-cholesterol, glucose와 insulin의 농도값은 낮은 것으로 나타났으며, 모든 지표에서 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다. GGH(2)-2는 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol과 insulin의 농도값은 낮은 것으로 나타났으며, HDL-cholesterol, glucose의 농도 값은 약간 높은 것으로 나타났으나triglyceride 지표에서만 통계적인 유의성이 있는 것으로 나타났다. GGH(2)-3은 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol, glucose와 insulin의 농도 값은 낮았으며, HDL-cholesterol의 농도값은 비슷한 것으로 나타났으나, triglyceride 지표에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다.
- GGH(2)-2는 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol과 insulin의 농도값은 낮은 것으로 나타났으며, HDL-cholesterol, glucose의 농도 값은 약간 높은 것으로 나타났으나triglyceride 지표에서만 통계적인 유의성이 있는 것으로 나타났다. GGH(2)-3은 대조군에 비하여 혈중 free fatty acid, triglyceride, total cholesterol, LDL-cholesterol, glucose와 insulin의 농도 값은 낮았으며, HDL-cholesterol의 농도값은 비슷한 것으로 나타났으나, triglyceride 지표에서만 통계적인 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다. GGH(2)는 체중감량효과와 일치하게 total cholesterol, LDL-cholesterol, free fatty acid, glucose와 insulin의 농도값이 통계적으로 유의한 차이를 보여주지는 못하지만 낮아지는 경향을 보여주고 있어 GGH(2) 투여의 실질적인 체중 증가량 감소효과가 혈중 체중감량지표에 전반적으로 미미하지만 영향을 준다는 것을 입증해 주고 있음을 시사한다.
- 4-B). LDL-cholesterol의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 낮은 것으로 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없었으며 농도 의존적으로 낮아지는 경향을 보였다(Fig. 4-C).
- 5-A). Triglyceride의 값은 GGH(2)-1에서 대조군에 비하여 통계적인 유의한 차이는 없는 것으로 나타났으며, GGH(2)-2와 GGH(2)-3의 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났다(Fig. 5-B).
- 결론적으로 GGH(2)는 식이효율과 leptin 농도를 낮추고 혈중 비만지표들을 개선시키며 지방량 특히 내장지방량을 줄여 체중감량효과로 나타나고 지방간의 개선도 보여주며, 특히 내장지방에서 중요한 지표인 triglyceride의 개선을 통하여 복부지방의 개선에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 GGH(2)는 식이효율과 leptin 농도를 낮추고 혈중 비만지표들을 개선시키며 지방량 특히 내장지방량을 줄여 체중감량효과로 나타나고 지방간의 개선도 보여주며, 특히 내장지방에서 중요한지표인 triglyceride의 개선을 통하여 복부지방의 개선에 기여할 수 있음을 보여준다.
- 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 따라서 체중감량효과와 일치하게 GGH(2)에 의하여 지방세포의 수는 증가하였고 그 크기는 감소하였으며, 간세포의 지방축적은 억제하는 것을 알 수 있다.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 asparate aminotransferase와 alanine aminotransferase의 양을 측정한 결과, asparate aminotransferase의 값은 GGH(2)의 세 농도는 대조군에 비하여 높게 나타났으나 모두 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig. 3-A). Alanine aminotransferase의 값은 GGH(2)-1은 대조군에 비하여 약간 높게 나타났고, GGH(2)-2와 GGH(2)-3에서 대조군에 비하여 낮게 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다(Fig.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 glucose와 insulin의 양을 측정한 결과, glucose의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 통계적인 유의한 차이는 없었으며, GGH(2)-2는 대조군보다 약간 높게 나타났고, GGH(2)-1과 GGH(2)-3에서 대조군 보다 낮게 나타났다(Fig. 6-A). Insulin의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 통계적인 유의한 차이는 없었으나 농도 의존적으로 낮아지는 경향을 보여주었다(Fig.
- 실험시작 8주 후 혈장 내 leptin의 양을 측정한 결과, 그 값이 GGH(2)의 모든 농도에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으나 GGH(2)-3에서만이 대조군에 비하여 낮은 것으로 나타났다(Fig. 2-B).
- 실험시작 8주 후 혈장 내 total cholesterol, HDL-cholesterol과 LDL-cholesterol의 양을 측정한결과, total cholesterol의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 낮게 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없었으며 농도 의존적으로 낮아지는 경향을 보였다(Fig. 4-A). HDL-cholesterol의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 약간 높거나 비슷하게 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Fig.
- 이를 백분율로 환산할 경우, 대조군에 비하여GGH(2)-1은 1.04%, GGH(2)-2는 8.18%, GGH(2)-3은 12.96%의 식이효율이 낮은 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다.
- 이를 백분율로 환산할 경우, 대조군에 비하여GGH(2)-1은 1.04%, GGH(2)-2는 8.18%, GGH(2)-3은 12.96%의 체중 감량효과가 있는 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다.
- 2) GGH(2)에 의한 간조직의 지방축적 변화고지방식이의 비만형질을 나타내는 비만마우스는 정상 마우스와 비교하여 상당량의 지방이 축적된 지방간을 보여주었으나 이러한 비만마우스에 GGH(2)를 투여하면 간의 지방축적이 감소되었다. 지방세포의 morphology에 미치는 효과와 유사하게 간세포의 지방축적은 세 농도 모두에서 농도 의존적으로 대조군에 비하여 lesion score를 감소시켰으나 GGH(2)-3에서만 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며, 그 감소정도는 6.54%, 13.80%와 40.34%였다. 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 2) GGH(2)에 의한 간조직의 지방축적 변화고지방식이의 비만형질을 나타내는 비만마우스는 정상 마우스와 비교하여 상당량의 지방이 축적된 지방간을 보여주었으나 이러한 비만마우스에 GGH(2)를 투여하면 간의 지방축적이 감소되었다. 지방세포의 morphology에 미치는 효과와 유사하게 간세포의 지방축적은 세 농도 모두에서 농도 의존적으로 대조군에 비하여 lesion score를 감소시켰으나 GGH(2)-3에서만 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며, 그 감소정도는 6.54%, 13.80%와 40.34%였다. 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다(Fig.
- 지방세포의 크기는 GGH(2)-1, GGH(2)-2와 GGH(2)-3의 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소되었으며, 그 감소율은 15.20%, 17.68%와 30.40%로 나타났다(control, 7163.01±407.40 μm2; GGH(2)-1, 5273.26±128.24 μm2; GGH(2)-2, 5011.7±298.32 μ m2; GGH(2)-3, 3822.82±107.95 μm2, Fig. 7-A and B).
- 지방세포의 크기는 GGH(2)-1, GGH(2)-2와GGH(2)-3의 모두에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소되었으며, 그 감소율은 15.20%, 17.68%와 30.40%로 나타났다. 반면에, 대조군과 비교하여 GGH(2)-1, GGH(2)-2와 GGH(2)-3의 모두에서 통계적으로 유의하게 단위면적당 지방세포의 수를 증가시켰으며, 그 증가정도는 15.
- 체중 증가량의 경우, 대조군에 비하여 GGH(2)-1은 1.04%, GGH(2)-2는 8.18%, GGH(2)-3은 12.96%의 체중 감량효과가 있는 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. EAT의 경우, 대조군에 비하여 GGH(2)-1은 0.
- 96%으로 그 식이효율이 낮은 것으로 나타났으며, 세 농도 중 GGH(2)-3에서 그 정도가 더 큰 것으로 나타났다. 혈중 leptin농도의 값은 GGH(2)의 세 농도 모두에서 대조군에 비하여 통계적인 유의성이 없는 것으로 나타났으나 GGH(2)-3에서만이 대조군에 비하여 낮은 것으로 나타났다. 식이효율의 공식에서 의미하는 바와 같이 사료를 섭취하는 양이 많음에도 불구하고 체중의 증가가 적다는 것은 비만조절효과가 있는 것으로 생각할 수 있다.
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