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문제 정의
- 본 연구는 큰방가지똥 메탄올 추출물과 각각의 분획들의항산화 활성을 측정함과 동시에 tyrosinase저해활성, α-glucosidase, α-amylase, angiotensin I converting enzyme (ACE)활성을 측정하여 항당뇨나 항고혈압에 기능성 식품이나 약효로서의 이용 가능성을 알아 보고자 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 6 g을 얻었다. 상기 추출물을 물로 녹인 후 hexane, MC, EtOAc, BuOH등 용매 극성 순으로 세 번씩 분획하고 용매별 분획을 합병하고 농축하여 hexane (83.3 g), methylene chloride (MC) (5.6 g), EtOAc (12.3 g), BuOH (30.6 g) 및 H2O (271.4 g) 분획을 얻었다. 상기분획들을 동결건조하여 -40℃에서 보관하며, 본 실험에 사용하였다.
- 즉, 실험방법에 따라 조제한 추출물에 Folin-Ciocalteu시액 첨가하고, 실온에서 5%의 탄산나트륨 (Na2CO3)용액을 넣은 다음 잘 혼합하여 실온에서 30분간 반응 후, 분광도계 (EL×800, Biotec, USA)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 표준시약으로 gallic acid를 사용하여 표준곡선을 작성하고, 총 페놀성 화합물의 함량은 mg gallic acid equivalent로 계산하였다.
- 실험방법에 따라 조제한 추출물에 diethylene glycol과 1 N NaOH를 가하고 잘 혼합한 후 30℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 검량곡선은 quercetin (Sigma Co., USA)을 이용하여 작성 하였으며 총 플라보이드 함량을 mg quercetin equivalent로계산하였다.
- L-Ascorbic acid와 BHT (Butylated hydroxytoluene)를 positive 대조군으로 사용하였다. EC50 (µg·mL-1) 는 DPPH 라디칼 소거활성이 50% 나타내는 추출물의 농도를 나타내는 것이다.
- Angiotensin 전환효소(ACE) 저해활성 − ACE저해 활성은 Cushman 등18)의 방법을 일부 수정하여 다음과 같이 측정하였다.
- α-Amylase 저해활성 측정 − 시료의 α-amylase저해활성은 환원당 분석법17)을 응용하여 효소원으로 porcine pancreas type VI-B amylase를 사용하고 기질로서 0.5% starch를 이용하여 효소활성을 측정하였다.
- 반응액은 495 nm에서 흡광도를 측정한 후 tyrosinase 효소활성 저해율을 구하였다. 효소활성 저해율은 시험시료가 포함되지 않은 반응액을 대조군으로 하여 계산하였다.15)
- 5 M NaOH) 500 µL를 넣고 100℃에서 15분간 끓여 발색 시킨후 충분히 냉각시켰다. 이반응액에 3배량의 물을 가하고 잘 교반 한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 저해도를 계산하였다. 이때 활성비교를 위하여 acarbose를 사용하였다.
- 5 mL에 25 mg Hip-His-Leu을 녹인 것) 50 µL를 넣은 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 1 N HCl 250 µL로 반응을 정지시켰다. 이 반응액에 유리되어 나오는 hippuric acid의 양을 228 nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였고 시료를 첨가하지 않은 것을 대조구로 하여 아래식으로 저해활성을 계산하여 비교하였다.
- Tyrosinase의 활성 저해 − Tyrosinase의 활성 저해 분석에 의한 미백활성 효과는 멜라닌 합성의 중요한 효소인 tyrosinase의 작용결과 생성되는 L-DOPA (Dihydroxiphenylalanine) 생성물의 흡광도를 흡수분광 광도계 (U-2001 spectrometer, Hitachi, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 각각의 샘플 50 µL에 0.35 U의 α-glucosidase 효소액 50 µL를 넣고 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후 3 mM p-NPG 100 µL를 가하여 37℃에서 10분간 반응시키고, 0.1 M Na2CO3 750 µL를 가하여 반응을 정지 시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.
- 큰방가지똥의 생리활성을 평가하여 천연물 유래 기능성 소재를 개발하기 위하여 메탄올 추출물 및 용매분획물의 항산화활성, tyrosinase 저해 활성 α-glucosidase와 α-amylase 억제능 및 ACE 저해활성을 측정하였다.
대상 데이터
- 실험재료 및 추출방법 − 본 실험에 사용한 큰방가지똥 (Sonchus asper (L) Hill) 지상부분은 중국 하남성 씬썅 (新券)시에서 채집한 것으로 음건된 10 kg을 이용하여 MeOH3 L로 60℃ 수욕에서 24시간씩 세번 추출하고 추출액을 합하고 감압 농축하여 MeOH추출물 405.6 g을 얻었다.
데이터처리
- 생리 활성 실험에서는 모든 샘플과 부동한 농도에서 3반복으로 실험 하였으며, 통계 프로그램은 SPSS 11.5에서 one-way ANOVA중 Duncan's multiple range test를 사용하여 분석하였다.
이론/모형
- 총플라보노이드 함량 − 총 플라보노이드 함량은 Davis12) 방법을 이용하였다.
- 총페놀함량 − 총 페놀성 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색으로 발색되는것을 이용한 Folin-Ciocalteu방법에 따라 분석하였다.
- α-Glucosidase 억제활성 측정 − 큰방가지똥추출물과 용매분획물의 α-glucosidase 억제활성은 Hwang 등16)의 방법에 의하여 측정하였다.
성능/효과
- 1,2) 당뇨병은 환경적, 유전적 및 대사적 요인에 의해 췌장에 있는 β-세포에서의 인슐린 분비장애와 말초조직에 대한 인슐린 저항에 의해 나타나고 고혈당을 특징으로 한다.
- 1,2) 당뇨병은 환경적, 유전적 및 대사적 요인에 의해 췌장에 있는 β-세포에서의 인슐린 분비장애와 말초조직에 대한 인슐린 저항에 의해 나타나고 고혈당을 특징으로 한다.3) 당뇨병은 고혈당 상태가 오랜 시간 지속됨에 따라 뇌중풍, 심근경색, 협심증, 시신경손상, 족부궤양 등 만성합병증이 발생하게 되는 대사성질환으로서 현재 우리나라 인구의 약 10%가 이 질병을 앓고 있으며, 그 발병률 또한 급격히 증가하고 있는 추세이다.4)
- 큰방가지똥 추출물에 존재하는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 Table I과 같다. 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 EtOAc층에서 180.71 mg GAE/g, 145.86 mg QE/g으로 나타났으며, 폴리페놀 함량은 MC, BuOH, Hexane층에서도 61.43 mg GAE/g, 54.29 mg GAE/g, 52.14 mg GAE/g으로 다소 높게 나타났지만, 플라보노이드 함량은 BuOH 층 37.23 mg QE/g 이외 다른 분획에서는 모두 10 mg QE/g 이하로 낮게 나타났다. 따라서 큰방가지똥에도 높은 폴리페놀을 함유하여 항산화효과 및 다른 생리활성 효과가 우수할 가능성이 높을 것으로 생각된다.
- 23) 메탄올 추출물의 각 용매별 분획물의 환원력을 측정한 결과 Fig. 1와 같이 시료 농도가 증가할수록 환원력도 증가하는 경향을 보였으며, 그 중에서도 EtOAc 분획물이 1000 µg/mL과 500 µg/mL에서 1.902와 1.634의 흡광도로 환원력이 가장 높게 나타났다.
- Fig. 3에서 보여주는 바처럼 α-glucosidase 저해활성에서는 EtOAc분획물이 1000 µg/ mL에서 56.22%의 활성을 나타내었으며, 500 µg/mL에서는 31.72%으로 다소 높은 활성은 나타내었다.
- 634의 흡광도로 환원력이 가장 높게 나타났다. 특히 EtOAc 분획물의 환원력은 하고초 줄기의 메탄올, 에탄올, 물 추출물에 비해 더 높은 환원력을 보였다.24)
- 29) Fig. 4에서 큰방가지똥 메탄올 추출물의 EtOAc분획이 α-amylase저해 활성에서는 1000 µg/ mL과 500 µg/mL농도에서 각각 46.58%와 31.72%로 다소 높은 저해 활성을 나타낸 반면 hexane분획물은 거의 활성을 나타내지 않았다.
- 본 연구에서는 큰방가지똥 메탄올 추출물과 각 용매분획물의 ACE 저해활성을 2 mg/mL와 1 mg/mL의 농도에서 측정한 결과, EtOAc분획이 62.03%와 46.97%로 다소 높게 나타났으며, MC 분획은 2 mg/mL농도에서 86.34%로 높게 나타났지만 1 mg/mL 농도에서는 35.13%로 다소 낮게 나타났으며, 대조군 captopril (0.1 mg/mL)은 41.96%로 나타났다 (Fig. 5). 메탄올 추출물과 물, n-butanol 및 n-hexane 분획물은 유사한 활성을 보였고 EtOAc 분획과 MC분획에서 비교적 높은 ACE 저해활성을 나타내었다.
- 5). 메탄올 추출물과 물, n-butanol 및 n-hexane 분획물은 유사한 활성을 보였고 EtOAc 분획과 MC분획에서 비교적 높은 ACE 저해활성을 나타내었다. ACE 저해활성이 우수한 것으로 보고된 식물 추출물의 ACE 저해활성을 분석한 결과 10 mg/mL농도에서 파인애플 세이지의 잎은 91.
- 메탄올 추출물과 물, n-butanol 및 n-hexane 분획물은 유사한 활성을 보였고 EtOAc 분획과 MC분획에서 비교적 높은 ACE 저해활성을 나타내었다. ACE 저해활성이 우수한 것으로 보고된 식물 추출물의 ACE 저해활성을 분석한 결과 10 mg/mL농도에서 파인애플 세이지의 잎은 91.2%,33) 헛개나무 메탄올과 물 추출물의 ACE 저해활성은 4 mg/mL농도에서 81.1% 및 75.8%의 억제활성을 보였다.34) 본 연구에서 큰방가지똥 메탄올 추출물과 각 분획물중 EtOAc 와 MC분획은 2 mg/mL의 농도에서도 ACE 저해활성이 62.
- 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량 측정 결과 EtOAc분획에서 180.71 mg GAE/g과 145.86 mg QE/g로 높은 함량을 나타내었으며, DPPH free radical 소거 활성 (EC50)은 33.55 µg/mL로 우수한 활성을 나타내었고, 환원력에서도 EtOAc분획이 1.9의 높은 흡광도를 나타내었으며, tyrosinase 저해 활성도 EtOAc 분획이 47.38%로 다소 높게 나타났으며, α-glucosidase 와 α-amylase 억제능에서도 EtOAc 분획이 56.22%와 46.58%를 나타내었으며, ACE 저해활성에서는 MC분획이 86.34%와 EtOAc 분획이 62.03%로 높은 활성을 나타내었다.
후속연구
- 63%로 나타내어 기타 분획물에 비해 비교적 높은 저해율을 나타내었다. 한편, Ra 등27)은 총페놀함량 및 항산화 효과와 tyrosinase 활성의 저해는 상관관계가 있다고 하였는데 이는 큰방가지똥 메탄올 추출물의 EtOAc분획에 총 페놀함량이 높은 것과 관련이 있는 것으로 사료되며 tyroxinase 활성을 억제하는 단일 물질분리에 대한 추가적인 연구 필요성이 제기되었다.
- 따라서 본 실험의 결과를 토대로 보았을 때 큰방가지똥 메탄올 추출물의 EtOAc분획이 αglucosidase나 α-amylase 의 저해활성이 다소 높게 나타났으며, 또한 쇠뜨기나 6년근 황기보다 더 좋은 활성을 나타내므로 항당뇨 또는 혈당강하 효과를 기대하며, 기능성 소재로 활용 가능성을 제시한다.
- 따라서 ACE 저해물질은 ACE의 활성을 억제함으로써 고혈압을 직접적으로 억제할 수 있다.32) 이미 알려진 고혈압 치료제는 합성 약물들로 높은 특이성 때문에 유의한 부작용을 나타낼 가능성을 가지고 있기 때문에 이러한 문제점을 해소하기 위해 ACE 저해활성을 가진 물질들은 천연물로부터 검색하는 연구가 다양하게 이루어 지고있으며 이들이 ACE저해 약물들을 대신할 수 있을 것으로 기대한다.
- 34) 본 연구에서 큰방가지똥 메탄올 추출물과 각 분획물중 EtOAc 와 MC분획은 2 mg/mL의 농도에서도 ACE 저해활성이 62.03%와 86.34%로 높았으며, 특히 l acetate 분획물은 1 mg/mL의 낮은 농도에서도 46.97%의 높은 ACE 억제활성을 보였으므로 항고혈압 효과가 있는 천연물로 활용 가능하며, 차후 MC와 EtOAc 분획물로부터 ACE 저해활성물질의 분리 및 동정 등의 대한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 03%로 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 큰방가지똥의 생리활성을 이용한 항당뇨와 항고혈압에 의약품 개발이나 기능성 소재로의 활용이 가능 할 것으로 사료된다.
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