벼줄무늬잎마름병(Rice stripe tenuivirus; RSV)은 벼에 발생하는 주요 바이러스병으로 2000년대 이후 서해안을 중심으로 벼에 발생하여 큰 피해를 주고 있다. RSV는 벼의 주요 해충인 애멸구에 의해 영속적으로 전염되기 때문에 애멸구의 적절한 방제로 피해를 경감시킬 수 있다. RSV의 방제전략을 수립하기 위해서는 RSV와 애멸구 간의 생태학적 연구가 필요하며, 특히 애멸구의 흡즙 및 감염생태가 결정적인 키포인트가 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 RSV에 감염된 벼에서 애멸구의 흡즙 및 감염특성을 조사하였다. 애멸구의 영기별 RSV 전염능력을 조사한 결과, RSV 감염주에서 3일 이상 흡즙한 4령충 이상에서 바이러스 전염능력이 높았다. RSV 이병주를 3일간 흡즙하였을 때 성충의 전염능력은 44.8%인데 비해 4령충과 5령충의 전염능력은 69.2%와 67.9%로 성충보다 4, 5령충의 전염능력이 높았다. 이병주 흡즙시 온도에 따른 보독충의 전염능력 조사 결과에서는 $30^{\circ}C$에서 전염능력이 가장 높았으며, $30^{\circ}C$에서 3일간 흡즙하였을 때 전염능력은 93.3%로 $25^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$의 70.6%, 43.8%에 비해 현저히 높았다.
벼줄무늬잎마름병(Rice stripe tenuivirus; RSV)은 벼에 발생하는 주요 바이러스병으로 2000년대 이후 서해안을 중심으로 벼에 발생하여 큰 피해를 주고 있다. RSV는 벼의 주요 해충인 애멸구에 의해 영속적으로 전염되기 때문에 애멸구의 적절한 방제로 피해를 경감시킬 수 있다. RSV의 방제전략을 수립하기 위해서는 RSV와 애멸구 간의 생태학적 연구가 필요하며, 특히 애멸구의 흡즙 및 감염생태가 결정적인 키포인트가 될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 RSV에 감염된 벼에서 애멸구의 흡즙 및 감염특성을 조사하였다. 애멸구의 영기별 RSV 전염능력을 조사한 결과, RSV 감염주에서 3일 이상 흡즙한 4령충 이상에서 바이러스 전염능력이 높았다. RSV 이병주를 3일간 흡즙하였을 때 성충의 전염능력은 44.8%인데 비해 4령충과 5령충의 전염능력은 69.2%와 67.9%로 성충보다 4, 5령충의 전염능력이 높았다. 이병주 흡즙시 온도에 따른 보독충의 전염능력 조사 결과에서는 $30^{\circ}C$에서 전염능력이 가장 높았으며, $30^{\circ}C$에서 3일간 흡즙하였을 때 전염능력은 93.3%로 $25^{\circ}C$와 $20^{\circ}C$의 70.6%, 43.8%에 비해 현저히 높았다.
Rice stripe virus (RSV) has been the main viral disease of rice plant in western coastal region of Korea since 2000. The control of the vector insect, small brown planthopper (Laodelphax striatellus), is the most effective management method of the persistently-transmitted viral disease. Thus, ecolog...
Rice stripe virus (RSV) has been the main viral disease of rice plant in western coastal region of Korea since 2000. The control of the vector insect, small brown planthopper (Laodelphax striatellus), is the most effective management method of the persistently-transmitted viral disease. Thus, ecological study between RSV and the vector insect was needed and investigated in order to make effective control plan, especially about study on the feeding and transmission of the virus by the vector insect. Each larval stage of vector insect differed in vector competence; larvae over 4th stage were shown as higher transmission after feeding on RSV-infected rice plant. These 4th and 5th larvae had higher transmission rates, 69.2% and 67.9% respectively, than 44.8% of the adult stage. The vector competence, however, was changed according to temperature; the highest transmission rate was 93.3% on $30^{\circ}C$ in comparison to 70.6% on $25^{\circ}C$ and 43.8% on $20^{\circ}C$.
Rice stripe virus (RSV) has been the main viral disease of rice plant in western coastal region of Korea since 2000. The control of the vector insect, small brown planthopper (Laodelphax striatellus), is the most effective management method of the persistently-transmitted viral disease. Thus, ecological study between RSV and the vector insect was needed and investigated in order to make effective control plan, especially about study on the feeding and transmission of the virus by the vector insect. Each larval stage of vector insect differed in vector competence; larvae over 4th stage were shown as higher transmission after feeding on RSV-infected rice plant. These 4th and 5th larvae had higher transmission rates, 69.2% and 67.9% respectively, than 44.8% of the adult stage. The vector competence, however, was changed according to temperature; the highest transmission rate was 93.3% on $30^{\circ}C$ in comparison to 70.6% on $25^{\circ}C$ and 43.8% on $20^{\circ}C$.
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문제 정의
본 연구에서는 기후환경 및 재배여건의 변화에 따른 효율적인 RSV의 방제전략을 수립하기 위한 기초자료 축적을 목표로 RSV를 매개하는 애멸구의 흡즙 및 감염특성을 조사하는 동시에 과거에 수행되었던 전염생태 연구와의 비교분석을 시도하였다.
제안 방법
4령충의 애멸구를 이용하여 앞에서와 같은 방법으로 RSV 를 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃의 생육상에서 흡즙기간을 1, 2, 3일로 조절하고 30일 후에 ELISA로 RSV의 보독여부를 확인하였다. 처리당 초기접종 개체수는 20마리로 하였다.
5 μl를 포함하는 반응액의 최종농도를 RNase free water를 이용해 25 μl로 맞춘 후 real-time RT-PCR하였다. 95℃에서 5분간 전처리하고 95℃에서 30초간 denaturation, 58℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 45초간 polymerization하였으며 매 cycle의 polymerization 후에 형광량을 측정하였다. PCR의 반복 cycle은 35cycle로 하였으며 annealing temperature는 온도 gradient 실험을 통해 58℃로 결정하였다.
PCR의 반복 cycle은 35cycle로 하였으며 annealing temperature는 온도 gradient 실험을 통해 58℃로 결정하였다. PCR이 끝난 후 55℃에서 0.5℃ 간격으로 30초씩 온도를 95℃까지 증가시키면서 melting curve 분석을 하였다.
Primer는 예비실험을 거쳐 선발된 RSV-1(5′-CAGCCGCCACTTTCACTTTC TTA-3′) 과 RSV-a(5′-AGGCTATGATGCTGCAACTCTGAT-3′)를 각각 upstream과 downstream primer로 사용하였다.
시료를 제거하고 80 μl의 PBS-T로 tube를 3회 washing한 후 최종적으로 증류수로 washing하였다. Real-time RT-PCR은 Bio-Rad사의 iCycler iQ instrument와 SYBR GreenⅠSupermix kit를 이용하여 two-step RT-PCR로 실시하였다. Primer는 예비실험을 거쳐 선발된 RSV-1(5′-CAGCCGCCACTTTCACTTTC TTA-3′) 과 RSV-a(5′-AGGCTATGATGCTGCAACTCTGAT-3′)를 각각 upstream과 downstream primer로 사용하였다.
애멸구가 이병주를 흡즙한 후 보독충 체내에서 바이러스가 검출되는 시간을 확인하기 위하여 흡즙 1, 2, 3, 6, 12, 24시간 후 3령 및 성충 보독 애멸구의 바이러스 검출여부를 RT-PCR로 분석하였다. 또한 애멸구 체내에서 바이러스 이동양상을 정량적으로 분석하기 위하여 애멸구 성충을 RSV 감염주에서 3시간 흡즙시키고 겨풀에 옮긴 1, 2, 3, 6, 12, 24시간 후에 5마리씩을 취하여 구침과 머리, 복부로 나누어 해부하고 별도로 hemolymph를 취한 후 부위별로 IC(Immunocapture) real-time RT-PCR하였다. 애멸구의 해부는 40X 해부현미경 하에서 곤충핀과 미세절단 해부가위를 이용해 먼저 복부를 절개해 hemolymph를 채취한 다음 구침과 머리, 복부로 절단하였다.
보독충을 온실에서 계대사육하면서 1령에서 5령 유충 및 성충을 채집하여 test tube에 이식한 건전한 묘령 14일의 추청벼 1주당 1마리씩 접종하였으며 각 영기별로 흡즙기간은 1～5일까지 1일 간격으로 처리하였다. 접종이 끝난 후 애멸구를 수거해 ELISA로 RSV의 보독여부를 확인한 후 무독충에 의해 흡즙된 벼는 폐기하였으며 보독충에 의해 흡즙된 벼만 포트에 정식하고 접종 30일 후 ELISA로 바이러스의 감염 여부를 확인하였다.
애멸구가 이병주를 흡즙한 후 보독충 체내에서 바이러스가 검출되는 시간을 확인하기 위하여 흡즙 1, 2, 3, 6, 12, 24시간 후 3령 및 성충 보독 애멸구의 바이러스 검출여부를 RT-PCR로 분석하였다. 또한 애멸구 체내에서 바이러스 이동양상을 정량적으로 분석하기 위하여 애멸구 성충을 RSV 감염주에서 3시간 흡즙시키고 겨풀에 옮긴 1, 2, 3, 6, 12, 24시간 후에 5마리씩을 취하여 구침과 머리, 복부로 나누어 해부하고 별도로 hemolymph를 취한 후 부위별로 IC(Immunocapture) real-time RT-PCR하였다.
애멸구의 RSV 경란전염을 조사하기 위해 수원과 연천, 강화, 서울에서 채집한 벼에 애멸구 집단을 방사하여 보독충을 만든 후 보독충 개체군별로 30 cm × 20 cm × 15 cm 크기의 아크릴 cage에서 사육하면서 세대가 경과할 때마다 채집하여 ELISA로 RSV 보독여부를 조사함으로써 경란전염을 확인하였으며 애멸구 19세대에 걸쳐 수행하였다.
이병주를 흡즙한 애멸구에서 RSV를 검출하기 위해서는 3령충에서는 6시간, 성충에서는 3시간이 소요되었으며(Table 3) 흡즙을 통해 애멸구 체내에 들어간 RSV의 이동과 체내 부위별 축적의 경시적 변화를 조사하기 위해 IC real-time RT-PCR을 이용해 정량적인 분석을 하였다. 구침과, 복부, 머리 및 hemolymph로 분리한 각각의 시료를 분석한 결과 바이러스 흡즙 후 1시간 안에는 주로 구침에 많은 바이러스가 존재하며 gut를 포함하는 복부에도 많은 바이러스가 존재함을 알 수 있었다.
보독충을 온실에서 계대사육하면서 1령에서 5령 유충 및 성충을 채집하여 test tube에 이식한 건전한 묘령 14일의 추청벼 1주당 1마리씩 접종하였으며 각 영기별로 흡즙기간은 1～5일까지 1일 간격으로 처리하였다. 접종이 끝난 후 애멸구를 수거해 ELISA로 RSV의 보독여부를 확인한 후 무독충에 의해 흡즙된 벼는 폐기하였으며 보독충에 의해 흡즙된 벼만 포트에 정식하고 접종 30일 후 ELISA로 바이러스의 감염 여부를 확인하였다. 처리당 초기접종 개체수는 30마리로 하였다.
추출된 RSV 의 RNA를 역전사 반응을 시킨 후 PCR은 RSV 주형에 상보 적인 cDNA 1 μl와 upstream과 downstream primer(5 pmol) 각 1 μl, 2X의 SYBR GreenⅠSupermix(100 mM KCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8.4, 0.4 mM each dNTP, 50 U/ml iTaq DNA polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I, 20 nM fluorescein) 12.5 μl를 포함하는 반응액의 최종농도를 RNase free water를 이용해 25 μl로 맞춘 후 real-time RT-PCR하였다.
대상 데이터
일본식물방역협회에서 구입한 RSV IgG(2 ㎍/ml)를 200 μl 용량의 PCR용 micro tube에 50 μl씩 넣고 37℃에서 2시간 incubation하였다.
4령충의 애멸구를 이용하여 앞에서와 같은 방법으로 RSV 를 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃의 생육상에서 흡즙기간을 1, 2, 3일로 조절하고 30일 후에 ELISA로 RSV의 보독여부를 확인하였다. 처리당 초기접종 개체수는 20마리로 하였다.
접종이 끝난 후 애멸구를 수거해 ELISA로 RSV의 보독여부를 확인한 후 무독충에 의해 흡즙된 벼는 폐기하였으며 보독충에 의해 흡즙된 벼만 포트에 정식하고 접종 30일 후 ELISA로 바이러스의 감염 여부를 확인하였다. 처리당 초기접종 개체수는 30마리로 하였다.
성능/효과
4일 이상의 흡즙에서도 4령충과 5령충의 전염능력은 70% 이상으로 높았다. 1령 충과 2령충의 경우에는 RSV 감염주를 3일 이상 흡즙하였을 경우에도 높은 전염능력을 획득하지 못하였으며 전체적으로 애멸구 성충의 전염능력보다 4, 5령충의 전염능력이 높았다.
애멸구의 영기별 RSV의 전염능력을 조사한 결과 RSV 감염주에서 3일 이상 흡즙한 4령충 이상이 바이러스 전염능력이 높았다(Table 1). 1령충과 2령충은 1일간 흡즙하였을 때 전염력을 획득하지 못하였고 3, 4령충이나 성충도 1일 흡즙 시에는 10% 이하의 전염능력을 보였다. 이병주를 3일간 흡 즙하였을 때 4령충과 5령충의 전염능력은 69.
구침과, 복부, 머리 및 hemolymph로 분리한 각각의 시료를 분석한 결과 바이러스 흡즙 후 1시간 안에는 주로 구침에 많은 바이러스가 존재하며 gut를 포함하는 복부에도 많은 바이러스가 존재함을 알 수 있었다. 2시간이 지나면서부터는 구침의 바이러스는 감소하고 3시간째부터는 hemolymph의 바이러스 양이증가하였으며 12시간 경과 후부터는 머리의 바이러스 양이 증가함을 알 수 있었다. 전반적으로 구침의 바이러스는 시간이 경과하면서 농도가 감소하는데 반해 hemolymph와 머리의 바이러스는 증가하며 복부의 바이러스 농도는 시간이 경과하더라도 큰 변화가 없이 유지되었다(Fig.
0%였다. 4일 이상의 흡즙에서도 4령충과 5령충의 전염능력은 70% 이상으로 높았다. 1령 충과 2령충의 경우에는 RSV 감염주를 3일 이상 흡즙하였을 경우에도 높은 전염능력을 획득하지 못하였으며 전체적으로 애멸구 성충의 전염능력보다 4, 5령충의 전염능력이 높았다.
이병주를 흡즙한 애멸구에서 RSV를 검출하기 위해서는 3령충에서는 6시간, 성충에서는 3시간이 소요되었으며(Table 3) 흡즙을 통해 애멸구 체내에 들어간 RSV의 이동과 체내 부위별 축적의 경시적 변화를 조사하기 위해 IC real-time RT-PCR을 이용해 정량적인 분석을 하였다. 구침과, 복부, 머리 및 hemolymph로 분리한 각각의 시료를 분석한 결과 바이러스 흡즙 후 1시간 안에는 주로 구침에 많은 바이러스가 존재하며 gut를 포함하는 복부에도 많은 바이러스가 존재함을 알 수 있었다. 2시간이 지나면서부터는 구침의 바이러스는 감소하고 3시간째부터는 hemolymph의 바이러스 양이증가하였으며 12시간 경과 후부터는 머리의 바이러스 양이 증가함을 알 수 있었다.
보독충의 경란전염을 조사하기 위해 서울과, 연천, 강화, 수원에서 채집한 이병주에 건전애멸구를 흡즙시켜 보독충을 만든 후 19세대까지 계대사육을 하면서 후세대의 바이러스 감염율을 조사한 결과 20～60%대의 RSV 보독충율을 세대의 경과에 상관없이 지속적으로 유지하면서(Fig. 2) 경란전염을 하는 것으로 확인되었다. 본 논문에서는 애멸구의 19세대 이후로는 경란전염율을 더 이상 조사하지 못 하였지만 기존의 성적(Shinkai, 1962)을 참고로 할 때 더 많은 세대에까지 경란전염이 유지될 것으로 생각한다.
애멸구의 영기별 RSV의 전염능력을 조사한 결과 RSV 감염주에서 3일 이상 흡즙한 4령충 이상이 바이러스 전염능력이 높았다(Table 1). 1령충과 2령충은 1일간 흡즙하였을 때 전염력을 획득하지 못하였고 3, 4령충이나 성충도 1일 흡즙 시에는 10% 이하의 전염능력을 보였다.
이병주 흡즙시의 온도에 따른 보독충의 전염능력을 확인한 결과 30℃에서 전염능력이 가장 높았다(Table 2). 30℃에서 3일간 흡즙하였을 때 전염능력은 93.
1령충과 2령충은 1일간 흡즙하였을 때 전염력을 획득하지 못하였고 3, 4령충이나 성충도 1일 흡즙 시에는 10% 이하의 전염능력을 보였다. 이병주를 3일간 흡 즙하였을 때 4령충과 5령충의 전염능력은 69.2%와 67.9%였 으며 3령충의 전염능력은 50.0%였다. 4일 이상의 흡즙에서도 4령충과 5령충의 전염능력은 70% 이상으로 높았다.
2시간이 지나면서부터는 구침의 바이러스는 감소하고 3시간째부터는 hemolymph의 바이러스 양이증가하였으며 12시간 경과 후부터는 머리의 바이러스 양이 증가함을 알 수 있었다. 전반적으로 구침의 바이러스는 시간이 경과하면서 농도가 감소하는데 반해 hemolymph와 머리의 바이러스는 증가하며 복부의 바이러스 농도는 시간이 경과하더라도 큰 변화가 없이 유지되었다(Fig. 1). 이 실험에서 얻은 결과는 매미충의 체내에서 Maize streak geminivirus의 이동양상을 조사한 결과(Lett et al.
후속연구
애멸구는 개체가 워낙 작기 때문에 gut의 정밀한 절단에는 어려움이 있어 복부를 통째로 절단하였기 때문에 오염의 문제가 있었을 것이며 정밀성에 한계가 있었을 것이다. 따라서 핵산 probe 를 이용한 in vitro hybridization이나 형광항체법을 이용하여 보다 면밀한 검토가 이뤄져야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
벼줄무늬잎마름병이란 무엇인가?
벼줄무늬잎마름병(Rice stripe tenuivirus; RSV)는 우리나라에서 벼검은줄오갈병(Rice black-streaked dwarf virus; RBSDV), 벼오갈병(Rice dwarf virus; RDV)과 함께 벼에 발생하는 주요 바이러스로 우리나라에는 1930년대부터 낙동강 주변의 영남 지방에 발생하여 큰 피해를 일으켜 왔으며, 2000년대 이후 전국적으로 발생면적이 증가하여 큰 문제가 되고 있는 병해이다. RSV는 벼, 옥수수 등 화본과 37종을 기주로 하며 벼에 발생하는 주요해충인 애멸구(Laodelphax striatellus; mall brown planthopper-SBPH)에 의해 영속적 으로 경란전염하는데(Toriyama, 1983a) RSV에 감염된 벼는 초기의 퇴록 줄무늬가 진전되면서 결국에는 출수되지 않고 고사하여 수량감소에 결정적인 역할을 하게 된다.
벼줄무늬잎마름병은 무엇에 의해 영속적으로 경란전염 되는가?
벼줄무늬잎마름병(Rice stripe tenuivirus; RSV)는 우리나라에서 벼검은줄오갈병(Rice black-streaked dwarf virus; RBSDV), 벼오갈병(Rice dwarf virus; RDV)과 함께 벼에 발생하는 주요 바이러스로 우리나라에는 1930년대부터 낙동강 주변의 영남 지방에 발생하여 큰 피해를 일으켜 왔으며, 2000년대 이후 전국적으로 발생면적이 증가하여 큰 문제가 되고 있는 병해이다. RSV는 벼, 옥수수 등 화본과 37종을 기주로 하며 벼에 발생하는 주요해충인 애멸구(Laodelphax striatellus; mall brown planthopper-SBPH)에 의해 영속적 으로 경란전염하는데(Toriyama, 1983a) RSV에 감염된 벼는 초기의 퇴록 줄무늬가 진전되면서 결국에는 출수되지 않고 고사하여 수량감소에 결정적인 역할을 하게 된다.
애멸구가 1세대 성충이 되는 과정은 무엇인가?
RSV를 매개하는 애멸구는 대개 4령충의 형태로 논두렁이나 논의 화본과 잡초 등에서 월동약충은 2월 하순~3월 상순에 5령이 된 후 3월 중순경 우화하여 1세대 성충이 된다. 1세대 성충은 화본과 잡초나 보리, 밀, 이탈리안라이그라스에 산란하고 이 알에서 부화한 약충이 보리나 밀밭에서 서식하면서 5월 중하순경 이후 우화하여 2세대 성충이 되며 2세대 성충은 장시형으로 광범위하게 분산하여 대대적으로 논에 날아든다(Maramorosch & Harris, 1979).
참고문헌 (12)
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Toriyama, S. (1983) Rice stripe virus. CMI/AAB Description of Plant viruses, No. 269.
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