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문제 정의
- 본 연구는 항균활성 및 생육 촉진용 다기능성 미생물제제를 개발하고자 한라산에서 분리한 균주의 항균활성 능력, 단백질 분해 능력 및 Auxin 생성능력을 in vitro 검정과 생물검정을 통해 조사하였다.
제안 방법
- 분리한 균주의 Auxin 생산능력을 조사하기 위해 L-Tryptophan을 0.02% 첨가한 King’s B broth 배지(peptone 2%, K2PO4 0.15%, MgSO4ㆍ7H2O 0.15%, glycerol 1.5%) 5 ml에 분리한 균주를 접종한 후 30℃의 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
- 채집한 토양 10 g을 90 ml의 멸균수가 들어있는 시험관에 넣고 1시간 동안 28℃ shaking incubator에서 진탕 배양한 후 시료를 10-3부터 10-5까지 10배 단위로 단계적으로 희석하고 희석액 150 ㎕를 TSA(Tryptic soy agar), LB(Luria Bertani), King’s B 배지에 분주하여 도말한 후 28℃ incubator에서 24시간 배양하였다. 배양된 균주를 형태적, 색깔별로 분리한 후 TSA 배지에 다시 배양하여 실험에 사용하였으며 배양과정 중 TSA 배지에서 생장하지 않는 균주는 처음에 분리되었던 배지에서 계대배양하였다.
- 분리한 균주를 주요 식물병원균 8종(Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum)과 대치배양하여 균사생장 억제능력을 조사하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지 중앙에 치상하고 분리된 각각의 분리균주 현탁액에 침지한 paper disk를 열십자의 형태로 배치하였다.
- 분리한 균주를 주요 식물병원균 8종(Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum)과 대치배양하여 균사생장 억제능력을 조사하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지 중앙에 치상하고 분리된 각각의 분리균주 현탁액에 침지한 paper disk를 열십자의 형태로 배치하였다. 대치배양된 각각의 병원균을 최적 생장온도(B.
- 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer를 이용하여 절단한 후 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지 중앙에 치상하고 분리된 각각의 분리균주 현탁액에 침지한 paper disk를 열십자의 형태로 배치하였다. 대치배양된 각각의 병원균을 최적 생장온도(B. cinerea 18~20℃, S. sclerotinia 18℃, A. alternata, C. acutatum, F. oxysporum, P. capsici, P. ultimum, R. solani 28℃)에서 2~3일간 배양한 후 균사생장 억제능력을 조사하였다.
- 분리한 균주의 단백질분해 활성능력을 조사하기 위해 0.5% skim milk(Difco)가 첨가된 평판배지(peptone 0.6%, beef extract 0.3%, agar 2%)에 분리된 세균의 콜로니를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 picking 한 후 28℃ incubator에서 2~3일간 배양하여 단백질이 분해되어 나타난 투명환(clear zone)의 크기를 조사하였다(구 등, 2005; 이 등, 2006).
- 5%) 5 ml에 분리한 균주를 접종한 후 30℃의 incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 Salkowski 반응액(5% perchloric acid 100 ml, 0.05 M ferric choloride 2 ml)과 1:2 비율로 섞어 30분간 반응시킨 후 분홍색으로 발색되는 시료를 spectrophotometer로 535 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(정 등, 2006).
- 선발된 항균활성, 단백질분해 활성, Auxin 생산 균주의 종을 동정하기 위하여 16S 리보솜 RNA sequencing 분석을 하였다. 배양한 균주 45종의 colony를 (주)제노텍(Genotech, Korea)에 의뢰하였으며 기존의 NCBI의 gene bank 정보와 유사도를 비교하여 종을 동정하였다.
- 선발된 항균활성, 단백질분해 활성, Auxin 생산 균주의 종을 동정하기 위하여 16S 리보솜 RNA sequencing 분석을 하였다. 배양한 균주 45종의 colony를 (주)제노텍(Genotech, Korea)에 의뢰하였으며 기존의 NCBI의 gene bank 정보와 유사도를 비교하여 종을 동정하였다.
- 8종의 작물 주요 병에 대한 항균활성효과가 우수한 균주를 선발하여 토마토잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 검정하였다. 1% 차아염소산나트륨으로 소독한 토마토 잎 표면에 항균 활성 균주 배양액을 면봉으로 문질러 처리한 다음, 주사바늘로 상처를 내고 5 mm cork borer로 절단한 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 균사를 상처에 치상하여 인공접종하였으며 균주당 처리엽수는 3반복으로 수행하였다.
- 8종의 작물 주요 병에 대한 항균활성효과가 우수한 균주를 선발하여 토마토잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 검정하였다. 1% 차아염소산나트륨으로 소독한 토마토 잎 표면에 항균 활성 균주 배양액을 면봉으로 문질러 처리한 다음, 주사바늘로 상처를 내고 5 mm cork borer로 절단한 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 균사를 상처에 치상하여 인공접종하였으며 균주당 처리엽수는 3반복으로 수행하였다. 병원균이 접종된 토마토 잎을 병원균의 생장 최적온도인 20℃에서 3~5일간 배양한 후 발병정도를 조사하였다.
- 1% 차아염소산나트륨으로 소독한 토마토 잎 표면에 항균 활성 균주 배양액을 면봉으로 문질러 처리한 다음, 주사바늘로 상처를 내고 5 mm cork borer로 절단한 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 균사를 상처에 치상하여 인공접종하였으며 균주당 처리엽수는 3반복으로 수행하였다. 병원균이 접종된 토마토 잎을 병원균의 생장 최적온도인 20℃에서 3~5일간 배양한 후 발병정도를 조사하였다.
- 복합적인 기능을 가지는 친환경 미생물자재를 개발하기 위해 한라산에서 채집한 토양으로부터 단백질 분해활성, Auxin 생성, 항균활성을 가지는 미생물을 총 398균주 분리하여 기능성 검정을 실시하였다.
- 항균활성, 단백질분해활성, Auxin 생산의 기능을 가지는 45종의 선발균주는 16S rRNA 분석을 통해 종을 동정하였다. 그 결과 다양한 속에 속하는 미생물이 동정되었으며 Bacillus 속이 12균주로 가장 많았고 Streptomyces 8균주, Paenibacillus 속 5균주, Chryseobacterium 속 5균주, Pseudomonas 속 4균주, Rahnella 속 2균주, Lysinibacillus 속 2균주, Burkholderia 속 2균주로 동정되었으며, Enterobacter, Janthinobacterium, Microbacterium, Rhodococcus, Sphingomonas 속은 각각 1균주씩 동정되었다(Table 4).
대상 데이터
- 유용균주를 분리하기 위해서 2011년 6월 14일 한라산 해발 1000 m부터 정상까지 100 m의 간격으로 토양을 채취하였다. 토양시료는 상토층 5 cm를 제거한 후 그 이하의 토양을 채취하였다.
- 유용균주를 분리하기 위해서 2011년 6월 14일 한라산 해발 1000 m부터 정상까지 100 m의 간격으로 토양을 채취하였다. 토양시료는 상토층 5 cm를 제거한 후 그 이하의 토양을 채취하였다. 채집한 토양 10 g을 90 ml의 멸균수가 들어있는 시험관에 넣고 1시간 동안 28℃ shaking incubator에서 진탕 배양한 후 시료를 10-3부터 10-5까지 10배 단위로 단계적으로 희석하고 희석액 150 ㎕를 TSA(Tryptic soy agar), LB(Luria Bertani), King’s B 배지에 분주하여 도말한 후 28℃ incubator에서 24시간 배양하였다.
성능/효과
- 한라산의 산림부숙토에서 분리된 398균주를 식물 주요 병원균과 대치배양하여 항균활성을 조사한 결과, 172균주가 1종 이상의 병원균에 대해서 항균활성을 나타냈으며 이들 중 여러 종의 병원균에 대한 항균활성 효과를 동시에 보이는 26균주를 1차적으로 선발하였다. 선발된 균주는 8종의 식물병원균에 대해서 고르게 항균활성 효과를 보임으로써(Table 1, Fig.
- a)A degree of fungal growth suppression by bacterial strains was measured by investigating the diameters of clear zones caused by fungal growth inhibition; -: 0 mm, +: 1~2, ++: 3~4, +++: 5~6, ++++: 7 mm or above.
- 분리된 398균주의 단백질 분해활성 정도를 조사한 결과 203균주가 Skim milk 배지에서 투명환(clear zone)을 형성하여 단백질 분해효소를 생산하는 것으로 나타났으며 그 중 단백질 분해활성이 높은 34균주를 선발하였다(Table 2, Fig. 2).
- 한라산에서 분리된 세균 중 26균주가 Auxin을 생산하였으며(Table 3), Je45-1, Je7-6, Je32-3, Je21-11 균주는 535 nm에서의 흡광도가 각각 0.319, 0.240, 0.228, 0.218로 다른 균주들보다 Auxin의 생산 능력이 우수하였다. 특히 Je7-6, Je45-1 균주는 모두 Streptomyces 속에 속하는 방선균으로 항균활성, 단백질분해활성, Auxin 생성 등 기능적으로 우수한 효과가 있을 것으로 추정되지만 토마토잿빛곰팡이병에 대한 생물검정 결과는 기대에 미치지 못하였다.
- 218로 다른 균주들보다 Auxin의 생산 능력이 우수하였다. 특히 Je7-6, Je45-1 균주는 모두 Streptomyces 속에 속하는 방선균으로 항균활성, 단백질분해활성, Auxin 생성 등 기능적으로 우수한 효과가 있을 것으로 추정되지만 토마토잿빛곰팡이병에 대한 생물검정 결과는 기대에 미치지 못하였다. 그러나 방선균은 항생물질을 포함한 다양한 생리활성물질을 생산하고, 지금까지 알려진 약 10,000여 종의 항생물질 중 75% 이상이 방선균으로부터 분리되었을 만큼 기능적으로 우수하므로(Berdy, 1989; Higton, 1998) 농작물 병 방제를 위한 미생물 자재로 개발하기 위해 토마토잿빛곰팡이병을 제외한 다른 병해에 대한 생물검정 실험을 거쳐 보다 광범위한 항균활성 효과에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다.
- 항균활성, 단백질분해활성, Auxin 생산의 기능을 가지는 45종의 선발균주는 16S rRNA 분석을 통해 종을 동정하였다. 그 결과 다양한 속에 속하는 미생물이 동정되었으며 Bacillus 속이 12균주로 가장 많았고 Streptomyces 8균주, Paenibacillus 속 5균주, Chryseobacterium 속 5균주, Pseudomonas 속 4균주, Rahnella 속 2균주, Lysinibacillus 속 2균주, Burkholderia 속 2균주로 동정되었으며, Enterobacter, Janthinobacterium, Microbacterium, Rhodococcus, Sphingomonas 속은 각각 1균주씩 동정되었다(Table 4). 한라산 산림토양에서 분리한 항균 및 단백질 분해활성, 오옥신 생산균주는 갯벌이나 간척지 토양에서 분리된 균주에 비해 의 종 다양성이 풍부한 것으로 생각되며(Kim et al.
- 선발된 항균활성 균주의 토마토 잿빛곰팡이병 방제효과 In vitro 검정 결과 효과가 우수한 균주들을 토마토 잎에 병원균을 접종하여 방제율을 조사한 결과 13균주가 효과를 나타내었다(Table 5). Je28-4(Rhodococcus sp.
- 선발된 항균활성 균주의 토마토 잿빛곰팡이병 방제효과 In vitro 검정 결과 효과가 우수한 균주들을 토마토 잎에 병원균을 접종하여 방제율을 조사한 결과 13균주가 효과를 나타내었다(Table 5). Je28-4(Rhodococcus sp.) 균주의 방제효과가 80%로 가장 높았으며(Fig. 3), Je17-6(Streptomyces tsukiyonensis), Je20-8(Streptomyces psammoticus) 및 Je46-11(Bacillus amyloliquefaciens)도 66.7%의 방제효과를 나타냈다. 대치배양 결과 항균활성 효과가 낮아 Table 1에서 언급되지 않았던 Je18-2 균주는 토마토에 대한 생물검정 결과 예상 외로 80%의 높은 방제효과를 나타내었으며 항균활성 이외에도 Auxin 생산 능력이 있어(Table 3) 작물병의 생물적 방제제와 작물의 생장 촉진제로의 동시활용 가능성에 대한 추가적인 검토가 필요할 것으로 생각한다.
- 대치배양 결과 항균활성 효과가 낮아 Table 1에서 언급되지 않았던 Je18-2 균주는 토마토에 대한 생물검정 결과 예상 외로 80%의 높은 방제효과를 나타내었으며 항균활성 이외에도 Auxin 생산 능력이 있어(Table 3) 작물병의 생물적 방제제와 작물의 생장 촉진제로의 동시활용 가능성에 대한 추가적인 검토가 필요할 것으로 생각한다. 이 외에 Je1-8(Pseudomonas sp.), Je5-6(Streptomyces tsukiyonensis), Je33-9(Paenibacillus terrae), Je36-6(Streptomyces nigrogriseolus), Je37-6(Streptomyces cinnamoneus) 그리고, Je46-6(Paenibacillus polymyxa) 균주도 약간의 항균활성 효과가 있었다. 대치배양 결과 잿빛곰팡이병균에 효과가 가장 좋았던 Je9-2와 Je13-1 균주는 토마토 잎에 대한 생물검정 결과 예상과는 달리 효과가 우수하지 못하였는데, 이 부분에 대해서는 재실험을 통해 확인을 하여야 할 것으로 생각한다.
후속연구
- 한라산의 산림부숙토에서 분리된 398균주를 식물 주요 병원균과 대치배양하여 항균활성을 조사한 결과, 172균주가 1종 이상의 병원균에 대해서 항균활성을 나타냈으며 이들 중 여러 종의 병원균에 대한 항균활성 효과를 동시에 보이는 26균주를 1차적으로 선발하였다. 선발된 균주는 8종의 식물병원균에 대해서 고르게 항균활성 효과를 보임으로써(Table 1, Fig. 1) 추후 생물검정을 통해 여러 종의 식물 병에 대한 생물적 방제제로의 가능성을 확인해야 할 것으로 생각한다.
- 특히 Je7-6, Je45-1 균주는 모두 Streptomyces 속에 속하는 방선균으로 항균활성, 단백질분해활성, Auxin 생성 등 기능적으로 우수한 효과가 있을 것으로 추정되지만 토마토잿빛곰팡이병에 대한 생물검정 결과는 기대에 미치지 못하였다. 그러나 방선균은 항생물질을 포함한 다양한 생리활성물질을 생산하고, 지금까지 알려진 약 10,000여 종의 항생물질 중 75% 이상이 방선균으로부터 분리되었을 만큼 기능적으로 우수하므로(Berdy, 1989; Higton, 1998) 농작물 병 방제를 위한 미생물 자재로 개발하기 위해 토마토잿빛곰팡이병을 제외한 다른 병해에 대한 생물검정 실험을 거쳐 보다 광범위한 항균활성 효과에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다. 분리된 Auxin 생산 균주는 추후 생물검정을 통하여 뿌리발근 및 생장 실험을 통하여 효과를 확인해야 할 것이다.
- 그러나 방선균은 항생물질을 포함한 다양한 생리활성물질을 생산하고, 지금까지 알려진 약 10,000여 종의 항생물질 중 75% 이상이 방선균으로부터 분리되었을 만큼 기능적으로 우수하므로(Berdy, 1989; Higton, 1998) 농작물 병 방제를 위한 미생물 자재로 개발하기 위해 토마토잿빛곰팡이병을 제외한 다른 병해에 대한 생물검정 실험을 거쳐 보다 광범위한 항균활성 효과에 대한 확인이 필요할 것으로 생각된다. 분리된 Auxin 생산 균주는 추후 생물검정을 통하여 뿌리발근 및 생장 실험을 통하여 효과를 확인해야 할 것이다.
- 7%의 방제효과를 나타냈다. 대치배양 결과 항균활성 효과가 낮아 Table 1에서 언급되지 않았던 Je18-2 균주는 토마토에 대한 생물검정 결과 예상 외로 80%의 높은 방제효과를 나타내었으며 항균활성 이외에도 Auxin 생산 능력이 있어(Table 3) 작물병의 생물적 방제제와 작물의 생장 촉진제로의 동시활용 가능성에 대한 추가적인 검토가 필요할 것으로 생각한다. 이 외에 Je1-8(Pseudomonas sp.
- ), Je5-6(Streptomyces tsukiyonensis), Je33-9(Paenibacillus terrae), Je36-6(Streptomyces nigrogriseolus), Je37-6(Streptomyces cinnamoneus) 그리고, Je46-6(Paenibacillus polymyxa) 균주도 약간의 항균활성 효과가 있었다. 대치배양 결과 잿빛곰팡이병균에 효과가 가장 좋았던 Je9-2와 Je13-1 균주는 토마토 잎에 대한 생물검정 결과 예상과는 달리 효과가 우수하지 못하였는데, 이 부분에 대해서는 재실험을 통해 확인을 하여야 할 것으로 생각한다.
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