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문제 정의
- 본 연구에서는 동해안의 주요 수산물인 오징어 가공 과정에서 발생되는 껍질로부터 단백질 가수분해물을 제조하고, 그 가수분해물로부터 ACE 저해 펩티드를 분리 정제하여 그 특성을 알아보고자 한다.
제안 방법
- ACE 저해 펩티드의 저해 패턴은 기질농도에 따른 반응속도를 측정하여 결정하였다. 반응속도를 측정하기 위해 반응액 내에 효소와 기질 반응활성을 측정하였으며, Lineweaver-Burk plot을 통하여 산출하였다.
- ACE 저해활성이 가장 높은 분획물은 HPLC에서 YMC C18 column (5 μm, ∅ 10 × 250 mm)을 사용하여 ACE 저해 펩티드를 분리정제하였다.
- 각 획분은 동결건조를 실시한 후, 일정량을 정평하여 ACE 저해활성을 측정하였다. ACE저해활성이 가장 좋은 획분은 동일한 column으로 재 분리하여 단일 획분으로 분리정제하였다.
- Control 및 blank 군은 가수분해액 대신 증류수 50 μL를 가하여 실험하였으며, ACE 저해 활성은 저해 활성이 50%일 때의 저해제 농도인 IC50값으로 나타내었다.
- ACE 저해활성이 가장 높은 분획물은 HPLC에서 YMC C18 column (5 μm, ∅ 10 × 250 mm)을 사용하여 ACE 저해 펩티드를 분리정제하였다. HPLC에서 용리액은 이동상으로 증류수와 acetonitrile를 사용하였으며, 선형상 농도구배법으로 50분 동안 2.0 mL/min의 유속으로 분획된 용출액을 215 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 획분은 동결건조를 실시한 후, 일정량을 정평하여 ACE 저해활성을 측정하였다.
- 5 mL로 조절하였으며, 분리된 각 획분은 분광광도계 215 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 분획물들은 동결건조한 후, ACE 저해활성을 측정하였다. ACE 저해활성이 가장 높은 분획물은 HPLC에서 YMC C18 column (5 μm, ∅ 10 × 250 mm)을 사용하여 ACE 저해 펩티드를 분리정제하였다.
- 0 mL/min의 유속으로 분획된 용출액을 215 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 획분은 동결건조를 실시한 후, 일정량을 정평하여 ACE 저해활성을 측정하였다. ACE저해활성이 가장 좋은 획분은 동일한 column으로 재 분리하여 단일 획분으로 분리정제하였다.
- ACE 저해 펩티드의 저해 패턴은 기질농도에 따른 반응속도를 측정하여 결정하였다. 반응속도를 측정하기 위해 반응액 내에 효소와 기질 반응활성을 측정하였으며, Lineweaver-Burk plot을 통하여 산출하였다.
- 오징어 껍질 가수분해물로부터 ACE 저해 펩티드를 분리정제하기 위하여, Sephadex G-25 gel column chromatography 및 HPLC (Agilent 1100, USA)를 이용하여 분리정제하였다. 먼저 겔여과는 Sephadex G-25를 충진한 column (∅ 2.
- 오징어 껍질가수분해물 50 μL에 ACE 효소액 50 μL를 가한 후, 37℃에서 10분간 항온처리 하였다.
- 오징어 껍질의 가수분해는 잘게 절단된 생시료의 단백질 함량이 1 g이 되도록 하여 수행하였다. 정평한 시료에 100 mL 완충용액에 넣고 항온조에서 1시간 방치 후, 기질:효소비가 100:1이 되도록 효소를 가하여 6시간 동안 반응시켰다.
- 오징어 껍질의 단백질 가수분해는 산업적 상용 효소인alcalase (from Bacillus licheniformis, 2.4 AU/g), αchymotrypsin (from bovine pancreas, 40~60 units/mg protein), neutrase (from Bacillus amyloliquefaciens, 1.5 AU/g), papain (from papaya latex, 1.5~10 units/mg), pepsin (from porcine gastric mucosa, 400~800 units/mg protein) 및 trypsin (from porcine pancreas, 1,000~2,000 units/mg solid)을 사용하여 실시하였다.
- 2 mL를 분취하였다. 이 분취액을 건조기에서 80℃로 완전히 건조시킨 후 증류수 0.5 mL를 가하여 용해시켜, 분광광도계(JASCO, V-550)로 흡광도 (228 nm)를 측정하였다. ACE 저해활성은 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.
- 2)로 25 mL 정용하였다. 이 중 일부를 취하여 아미노산 자동분석기 (L-8800, Hitachi사, Japan)로 분석하였다.
대상 데이터
- Baker사 (USA)에서 구입하였고, HPLC column은 YMC C18 column (Kyoto, Japan)을 사용하였다. ACE 저해활성 측정에 사용된 ACE와 기질로서 Hippuryl-Histidyl- Leucine (HHL)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였으며, 그 밖의 시약은 분석용 특급시약을 사용하였다.
- 실험에 사용한 오징어 (Todarodes pacificus) 껍질은 2010년 6월, 강릉시 주문진항에서 구입하여 사용하였다. 오징어 껍질을 가수분해하기 위해 사용된 효소로 Alcalase와 Neutrase은 Novozyme사 (Denmark)에서 구입하였고, α-chymotrypsin, trypsin, papain은 Sigma-Aldrich사 (St.
- 일반적으로 ACE 저해 펩티드는 아연 결합 ligand, hydrogen결합 및 C말단의 아미노산 그룹과 같은 여러 개의 작용부위를 가지고 있다 (Andrews, Carson, Caselli, Spark and Woods, 1985). 오징어 껍질 유래의 ACE 저해 펩티드는 보고된 ACE저해 펩티드가 가지고 있는 아미노산 서열의 C말단에서 강력한 ACE 저해 활성을 나타내는 아미노산인 tyrosine, phenylalanine, proline 중 proline이 존재하였다. Cheung et al.
- 오징어 껍질을 가수분해하기 위해 사용된 효소로 Alcalase와 Neutrase은 Novozyme사 (Denmark)에서 구입하였고, α-chymotrypsin, trypsin, papain은 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, pepsin은 Junsei사 (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, pepsin은 Junsei사 (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 오징어껍질 가수분해물로부터 ACE 저해 펩티드를 정제하기 위하여 HPLC (Agilent 1100, California, USA)를 사용하였으며, 펩티드를 분리 정제하는데 필요한 HPLC용 acetonitrile은 J.T. Baker사 (USA)에서 구입하였고, HPLC column은 YMC C18 column (Kyoto, Japan)을 사용하였다. ACE 저해활성 측정에 사용된 ACE와 기질로서 Hippuryl-Histidyl- Leucine (HHL)는 Sigma-Aldrich (St.
이론/모형
- ACE 저해 펩티드의 분자량은 liquid chromatography- massspectrometry (LC-MS)를 이용하여 electrospray ionization (ESI)방법으로 측정하였다. 또한 아미노산 서열 분석은 Q-TOF 2 Mass Spectrometer (Micromass, Manchester, UK)를 이용하여 Mass Spectrometry에 의하여 실시하였다.
- 가수분해도 측정은 Kim et al. (1990) 이 언급한 방법에 따라 가수분해물 1 mL를 95℃의 물중탕에서 5분간 열처리하여 효소를 불활성화 시킨 다음 20% trichloroacetic acid (TCA)용액 1 mL를 가하여 30분간 방치 후, 반응액은 원심분리 (3000 rpm, 10 min)하여 침전물을 제거하였다. 원심분리 후 얻어진 상층 (징)액의 단백질 정량은 Lowry et al.
- ACE 저해 펩티드의 분자량은 liquid chromatography- massspectrometry (LC-MS)를 이용하여 electrospray ionization (ESI)방법으로 측정하였다. 또한 아미노산 서열 분석은 Q-TOF 2 Mass Spectrometer (Micromass, Manchester, UK)를 이용하여 Mass Spectrometry에 의하여 실시하였다.
- 오징어 껍질 가수분해물의 ACE 저해활성 측정은 Cushman과 Cheung (1971)의 방법에 준하여 측정하였다. 오징어 껍질가수분해물 50 μL에 ACE 효소액 50 μL를 가한 후, 37℃에서 10분간 항온처리 하였다.
- 오징어껍질의 아미노산 조성은 AOAC (1990)방법에 따라 시료 50 mg을 정평하여 ampoule에 넣고, 6 N HCl 2.0 mL를 가하여 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 가수분해액을 glass filter로 여과하고 감압 건조하여 HCl을 제거한 후, 아미노산 자동분석기용 sodium citrate buffer (Na+ form, pH 2.
- (1990) 이 언급한 방법에 따라 가수분해물 1 mL를 95℃의 물중탕에서 5분간 열처리하여 효소를 불활성화 시킨 다음 20% trichloroacetic acid (TCA)용액 1 mL를 가하여 30분간 방치 후, 반응액은 원심분리 (3000 rpm, 10 min)하여 침전물을 제거하였다. 원심분리 후 얻어진 상층 (징)액의 단백질 정량은 Lowry et al. (1951) 법으로 측정하였으며, 다음 계산식을 이용하여 가수분해도를 구하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 6종의 효소에 의한 오징어 껍질의 가수분해도는 neutrase를 이용하였을 때 81.23%로 다른 효소에 비해 가장 높게 나타났다. 각 가수분해물들의 ACE 저해활성은 Fig.
- HPLC에서 분리정제된 C-4 획분의 분자량 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 분자량은 657 Da 이였으며, 아미노산 서열은 Ser-Ala-Gly-Ser-Leu-Val-Pro의 7개의 아미노산 잔기로 구성되어 있었다 (Fig 6). 최종 분리정제된 ACE 저해 펩티드의 IC50값은 766.
- 3 (B))에 나타내었다. Sephadex G-25 column에서 분리된 6개의 획분(F1~F6) 중 F4 획분의 ACE 저해활성이 가장 우수하였다. F4획분은 ODS column을 사용하여 HPLC에서 분리정제 하여, 그 결과를 Fig.
- , 2010)는 Val-Tyr-Ala-Pro, Val-Ile-Ile-Phe 및 Met-Ala-Trp로 나타났다. Tuna frame 및 cuttlefish 유래의 ACE 저해 펩티드의 아미노산 서열에서 공통적으로 C말단 위치에서 proline 및 phenylalanine이 존재하였으며, proline 및 phenylalanine이 존재하는 펩티드의 ACE저해활성이 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 본 연구결과와 비교하였을 때, 오징어 껍질에서 분리된 ACE 저해 펩티드의아미노산 서열에서도 C말단에 proline이 존재하였다.
- 23%로 다른 효소에 비해 가장 높게 나타났다. 각 가수분해물들의 ACE 저해활성은 Fig. 2에서와 같이, pepsin 가수분해물의 IC50값이 5.84 mg/mL로 다른 가수분해물들에 비해 높은 ACE 저해활성을 나타내었다.
- 자연계의 단백질에는 tri-, tetra- 펩티드의 존재 확률이 매우 적다. 그러므로 오징어 껍질로 분리정제된 ACE 저해 펩티드는 저분자량이며, C말단에 proline를 가지고 있으므로 생리활성 및 체내의 안전성이 우수하여 기능성 식품 소재로 이용가능성이 높을 것으로 사료되었다.
- Tuna frame 및 cuttlefish 유래의 ACE 저해 펩티드의 아미노산 서열에서 공통적으로 C말단 위치에서 proline 및 phenylalanine이 존재하였으며, proline 및 phenylalanine이 존재하는 펩티드의 ACE저해활성이 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 본 연구결과와 비교하였을 때, 오징어 껍질에서 분리된 ACE 저해 펩티드의아미노산 서열에서도 C말단에 proline이 존재하였다.
- 본 연구에서 ACE 저해 펩티드의 활성은 pepsin 가수분해물에 비하여 분리정제 단계별로 증가하였으며 (Table 3), 최종분리정제된 C-4 획분의 ACE 저해활성값은 pepsin 가수분해물에 비하여 26.6배 증가하였다. 분리정제단계에 따른 저해활성값의 증가는 분리정제 단계의 획분에서 유리아미노산 및 불순물이 제거되기 때문이다.
- HPLC에서 분리된 각 분획물의 흡광도를 측정한 결과, 9개 (A∼I)의 획분으로 분리되었다. 분리된 각 획분은 동결건조한 후 ACE 저해활성을 측정하였으며, 획분 C의 IC50 값이 1.30 mg/mL로 다른 획분과 비교하여 가장 높게 나타났다 (Fig. 4 (B)).
- 오징어 껍질의 아미노산 조성비를 분석한 결과, 주요 아미노산은 glycine (19.62%), alanine (9.45%) 및 aspartic acid (8.48%)로 나타났으며, taurine의 구성비는 2.89%으로 나타났다 (Table 1). Taurine은 식품음료 및 화장품 산업에서 유용한 물질로 널리 이용되고 있으며 (Janeke et al.
후속연구
- 본 연구 결과에서, 오징어 껍질로부터 분리정제된 ACE 저해 펩티드는 C말단에 proline를 가지고있어 ACE 저해활성을 나타내는 것으로서 항고혈압제 및 기능성 식품소재로의 이용성이 높을 것이라 기대된다.
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