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문제 정의
- 하지만 지금까지 개발된 방법들은 세균과 바이러스를 각각 따로 검출해야 하는 단점이 있으며, 또한 Multiplex IC/RT-PCR 방법과 Multiplex real-time PCR 방법 등은 검사 비용이 많이 드는 단점이 있다. 이에, 세균과 바이러스를 동시에 검출하면서 시간과 비용을 절감할 수 있는 One-step Multiplex RT-PCR 방법을 국내 최초로 개발하여 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1 µl의 5', 3'-primer (10 µM), 5 µl의 10× buffer, 1 µl의 dNTP mixture(2.5 mM), 2.5 µl의 MgCl2(50 mM), 1 µl의 AMV RT Taq polymerase, 2 µl DNA Taq polymerase와 DEPC D.W.를 첨가하여 전체 부피를 50 µl로 조절하였다.
- 1 ng이 되도록 희석한 후에 PCR 민감도 검사에 이용하였다. 10 ng으로 정량한 여러 세균과 바이러스 추출 RNA를 동량으로 혼합하여 Multiplex RT-PCR을 수행한 후 프라이머 특이성을 확인하였다.
- gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 사용하였다. 5종의 세균과 바이러스를 동시 진단할 경우에 각각 프라이머간의 간섭 현상이 없는 조합을 선발하여 One-step multiplex RT-PCR에 이용하였다.
- Cmm, Ecc, Xcv는 독특한 병원성 인자 발현유전자인 flhDC, regAB, xopD의 exon 부분의 염기서열을, PMMoV와 TMGMV는 외피단백질 유전자의 염기서열을 NCBI 홈페이지를 이용하여 탐색하고 증폭산물이 일정한 크기로 각각 구별될 수 있도록 증폭산물의 크기를 고려하여 각각의 병원균을 검출할 수 있는 프라이머를 3세트씩 합성하였다(Table 2). 합성된 8개의 프라이머 조합(I~VIII) (Table 3)과 Table 1에 열거된 가지과 작물 종자 전염병원균인 Xcv, Ecc, Cmm, PMMoV, TMGMV에서 추출된 RNA를 이용하여 One-step multiplex RT-PCR 을 수행하는데 최적의 온도조건을 탐색하였다.
- 3. Detection sensitivity test (A, B, C, D and E) with 10 fold diluted RNA samples which were extracted from each pathogen. M, size marker (100 bp DNA ladder), Lane 1, 100 ng RNA extracted from each pathogen; Lane 2, 10 ng RNA extracted from each pathogen; Lane 3, 1 ng RNA extracted from each pathogen; Lane 4, 0.
- Total RNA 추출. Nutrient agar 플레이트에서 배양된 세균과 구입한 바이러스 항원으로부터 RNA를 추출하였다. RNA 추출은 NucleoSpin® RNA II kit(Macherey-Nagel, Germay)를 이용하여 추출하였고 추출된 RNA는 Qubit® fluorometer(Invitrogen, USA)를 이용하여 정량분석하였다.
- 1. One-step Multiplex RT-PCR performed with primer combinations (I~VIII ) and mixed RNA samples which were extracted from pathogens at Tm 50℃, 53℃, 55℃, 58℃ and 60℃. Amplified products were well separated on 1.
- 특이적으로 합성한 프라이머 조합(Table 2)를 이용하였다. One-step multiplex RT-PCR은 RobusTTM I RT-PCR kit(Finnzymes, Filand)의 조건을 약간 수정하여 수행하였다. 자세한 반응액 조성과 PCR 조건은 프라이머의 특이성을 검정하기 위한 PCR 조건과 종자에서 병원균을 검출하기 위한 PCR 조건 등 2가지로 나누어서 수행하였다.
- PCR 온도조건은 Tm을 50℃, 53℃, 55℃, 58℃, 60℃로 각각 설정하고 42℃에서 60분간 Reverse Transcription 반응을 시키고 94°C 2분간 denaturation 시킨 다음, 94℃에서 30초, Tm에서 30초, 72℃ 에서 1분간의 과정으로 40회 반복 수행한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켰다.
- RNA 추출은 NucleoSpin® RNA II kit(Macherey-Nagel, Germay)를 이용하여 추출하였고 추출된 RNA는 Qubit® fluorometer(Invitrogen, USA)를 이용하여 정량분석하였다.
- Reproducibility test for developed One-step multiplex RT-PCR result using RNA extracted from commercial tomato (A) and pepper (B, C) seeds (‘commercial variety name’) (A) M, size marker (100 bp DNA ladder); Lane 1, ‘Younghwa2’; Lane 2, ‘Seanggeurang chorok’; Lane 3, ‘Sun cherry250’; Lane 4, ‘New Cheonggang’; Lane 5, ‘Ebistiwai’; (B) M, size marker (100 bp DNA ladder); Lane 1, ‘Eumji20’; Lane 2, ‘Eumji20’; Lane 3, ‘Samdo Wang’; Lane 4, ‘PR the ssen’; Lane 5, ‘New PR’; Lane 6, ‘Eumji22’; (C) M, size marker (100 bp DNA ladder); Lane 1, ‘Camio red’; Lane 2, ‘Samdo Wang’; Lane 3, ‘PR the ssen’; Lane 4, ‘New PR’; Lane 5, ‘Eumji22’.
- 합성된 8개의 프라이머 조합(I~VIII) (Table 3)과 Table 1에 열거된 가지과 작물 종자 전염병원균인 Xcv, Ecc, Cmm, PMMoV, TMGMV에서 추출된 RNA를 이용하여 One-step multiplex RT-PCR 을 수행하는데 최적의 온도조건을 탐색하였다. Table 2에서 열거된 프라이머 염기서열을 근거로 Tm을 50℃, 53℃, 55℃, 58℃, 60℃로 각각 설정하였다. 여러 가지 바이러 스와 세균에서 추출한 RNA를 혼합한 시료에 합성된 프라이머 세트 조합(Table 3)를 넣고 RT-PCR을 수행한 결과, Tm값이 60℃이고 프라이머 조합(combination I, Fig.
- michiganensis (Cmm), Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc)와 바이러스 병원균 Pepper mild mottle virus (PMMoV) and Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV)를 종자로부터 동시검출하기 위한 One-step Multiplex RT-PCR을 개발하였다. 각각의 병원균을 특이적으로 증폭시키는 병원균 검출용 프라이머 15세트를 primer-blast 프로그램을 이용하여 제작하였고 각각의 병원균을 특이적으로 검출할 수 있는 5세트의 프라이머 세트(Cmm-F/R, Ecc-F/R, Xcv-F/R, PMMoV-F/R, TMGMV-F/R)를 선발하였다.
- 병원균 검출 특이 프라이머 제작. 가지과 작물에 발생하는 종자 전염 바이러스(2종)과 세균(3종)의 검출을 위한 프라이머 15셋트를 제작하였다(Table 2). 프라이머 제작 프로그램은 NCBI 홈페이지에서 이용 가능한 primer-blast(http://www.
- carotovora (Ecc)와 바이러스 병원균 Pepper mild mottle virus (PMMoV) and Tobacco mild green mosaic virus (TMGMV)를 종자로부터 동시검출하기 위한 One-step Multiplex RT-PCR을 개발하였다. 각각의 병원균을 특이적으로 증폭시키는 병원균 검출용 프라이머 15세트를 primer-blast 프로그램을 이용하여 제작하였고 각각의 병원균을 특이적으로 검출할 수 있는 5세트의 프라이머 세트(Cmm-F/R, Ecc-F/R, Xcv-F/R, PMMoV-F/R, TMGMV-F/R)를 선발하였다. 이들 프라이머 세트는 프라이머간의 또는 병원균 cDNA간의 간섭없이 타겟 병원균만을 검출하였다.
- 개발된 PCR 검출 방법을 실제 생산 판매 중인 가지과 작물 고추(20품종)와 토마토(10품종) 종자시료에 적용하여 병원균을 검출하였다. 코팅 처리된 종자의 경우 코팅 처리 물질이 PCR 반응을 저해할 수도 있기 때문에 종자를 멸균된 증류수로 잘 씻어 내어 하루 동안 건조시킨 후에 RNA 추출 방법을 이용하여 추출하였다.
- 반면에 다른 조건하의 PCR 결과에서는 프라이머 상호간에 간섭을 받아 증폭이 되지 않거나 비특이적으로 증폭된 DNA밴드를 확인하였다. 따라서 최적의 PCR 조건은 Tm 값은 60℃이고 프라이머 combination I을 최적의 PCR 조건으로 설정하였다.
- 각각의 병원균을 특이적으로 증폭시키는 병원균 검출용 프라이머 15세트를 primer-blast 프로그램을 이용하여 제작하였고 각각의 병원균을 특이적으로 검출할 수 있는 5세트의 프라이머 세트(Cmm-F/R, Ecc-F/R, Xcv-F/R, PMMoV-F/R, TMGMV-F/R)를 선발하였다. 이들 프라이머 세트는 프라이머간의 또는 병원균 cDNA간의 간섭없이 타겟 병원균만을 검출하였다. 가지과 작물 중에서 유통 중인 고추종자 20품종과 토마토종자 10품종에 대한 종자 감염 병원균 검출을 위한 PCR을 수행한 결과, 2개 품종의 토마토종자에서 Ecc가 검출되었고 4개 품종의 고추종자에서도 Ecc가 검출되었다.
- One-step multiplex RT-PCR은 RobusTTM I RT-PCR kit(Finnzymes, Filand)의 조건을 약간 수정하여 수행하였다. 자세한 반응액 조성과 PCR 조건은 프라이머의 특이성을 검정하기 위한 PCR 조건과 종자에서 병원균을 검출하기 위한 PCR 조건 등 2가지로 나누어서 수행하였다. 프라이머 특이성 검정을 위한 PCR 조건은 추출 키트를 이용하여 각각의 병원균에서 추출한 50 µl의 RNA중에 2 µl의 Templete (RNA)를 이용하였고, 종자에서 병원균 검출을 위한 PCR 조건은 50 µl의 추출 RNA중에 5 µl를 이용하였다.
- 증폭된 DNA가 Ecc DNA와 동일한지를 검증하기 위해 NucleoSpin® ExtractII kit(Macherey-Nagel, Germay)를 이용하여 증폭된 단편을 추출하였고 이를 sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
- PCR 민감도와 프라이머 특이성 확인. 추출된 RNA를 100 ng으로 정량한 후 10배 희석법으로 각각 100, 10, 1, 0.1 ng이 되도록 희석한 후에 PCR 민감도 검사에 이용하였다. 10 ng으로 정량한 여러 세균과 바이러스 추출 RNA를 동량으로 혼합하여 Multiplex RT-PCR을 수행한 후 프라이머 특이성을 확인하였다.
- 개발된 PCR 검출 방법을 실제 생산 판매 중인 가지과 작물 고추(20품종)와 토마토(10품종) 종자시료에 적용하여 병원균을 검출하였다. 코팅 처리된 종자의 경우 코팅 처리 물질이 PCR 반응을 저해할 수도 있기 때문에 종자를 멸균된 증류수로 잘 씻어 내어 하루 동안 건조시킨 후에 RNA 추출 방법을 이용하여 추출하였다. 유통되고 있는 10개의 토마토 품종 종자시료 중 2개의 품종에서 Positive control의 Ecc의 증폭 단편과 같은 크기로 증폭된 DNA 단편을 확인하였다 (Fig.
- One-step multiplex RT-PCR 조건. 특이적으로 합성한 프라이머 조합(Table 2)를 이용하였다. One-step multiplex RT-PCR은 RobusTTM I RT-PCR kit(Finnzymes, Filand)의 조건을 약간 수정하여 수행하였다.
- 프라이머 특이성 검정을 위한 PCR 조건은 추출 키트를 이용하여 각각의 병원균에서 추출한 50 µl의 RNA중에 2 µl의 Templete (RNA)를 이용하였고, 종자에서 병원균 검출을 위한 PCR 조건은 50 µl의 추출 RNA중에 5 µl를 이용하였다.
- Cmm, Ecc, Xcv는 독특한 병원성 인자 발현유전자인 flhDC, regAB, xopD의 exon 부분의 염기서열을, PMMoV와 TMGMV는 외피단백질 유전자의 염기서열을 NCBI 홈페이지를 이용하여 탐색하고 증폭산물이 일정한 크기로 각각 구별될 수 있도록 증폭산물의 크기를 고려하여 각각의 병원균을 검출할 수 있는 프라이머를 3세트씩 합성하였다(Table 2). 합성된 8개의 프라이머 조합(I~VIII) (Table 3)과 Table 1에 열거된 가지과 작물 종자 전염병원균인 Xcv, Ecc, Cmm, PMMoV, TMGMV에서 추출된 RNA를 이용하여 One-step multiplex RT-PCR 을 수행하는데 최적의 온도조건을 탐색하였다. Table 2에서 열거된 프라이머 염기서열을 근거로 Tm을 50℃, 53℃, 55℃, 58℃, 60℃로 각각 설정하였다.
대상 데이터
- 바이러스와 세균 분리 균주. 세균인 Xcv, Ecc, Cmm는 농촌진흥청 유전자원센터(Gene bank)에서 분양을 받아 사용하였으며, 바이러스인 PMMoV 및 TMGMV는 미국 Agdia사에서 항원을 구매하여 사용하였다(Table 1). 그리고 각각의 병원균은 −80℃의 초저온 냉동고(대한과학, Wisecryo® WUF-11)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 코팅 처리된 종자의 경우 코팅 처리 물질이 PCR 반응을 저해할 수도 있기 때문에 종자를 멸균된 증류수로 잘 씻어 내어 하루 동안 건조시킨 후에 RNA 추출 방법을 이용하여 추출하였다. 유통되고 있는 10개의 토마토 품종 종자시료 중 2개의 품종에서 Positive control의 Ecc의 증폭 단편과 같은 크기로 증폭된 DNA 단편을 확인하였다 (Fig. 4). 증폭된 DNA가 Ecc DNA와 동일한지를 검증하기 위해 NucleoSpin® ExtractII kit(Macherey-Nagel, Germay)를 이용하여 증폭된 단편을 추출하였고 이를 sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다.
이론/모형
- 가지과 작물에 발생하는 종자 전염 바이러스(2종)과 세균(3종)의 검출을 위한 프라이머 15셋트를 제작하였다(Table 2). 프라이머 제작 프로그램은 NCBI 홈페이지에서 이용 가능한 primer-blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 사용하였다. 5종의 세균과 바이러스를 동시 진단할 경우에 각각 프라이머간의 간섭 현상이 없는 조합을 선발하여 One-step multiplex RT-PCR에 이용하였다.
성능/효과
- 5% agarose gel에 110 volts로 90분간 전기영동을 수행하였을 때 증폭산물들이 크기 별로 뚜렷이 구별되었다. Multiplex RT-PCR을 수행하기 위한 최적의 Tm 은 60℃로 결정하고 각각의 병원균에서 추출한 RNA를 100 ng부터 0.1 ng까지 10배 희석법을 이용하여 희석시킨 시료로 One-step RT-PCR을 수행한 결과, 1 ng까지 PCR 증폭 산물을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 증폭된 DNA가 Ecc DNA와 동일한지를 검증하기 위해 NucleoSpin® ExtractII kit(Macherey-Nagel, Germay)를 이용하여 증폭된 단편을 추출하였고 이를 sequencing 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. NCBI Blast 프로그램을 이용한 분석된 염기서열의 homology 결과 Ecc의 유전자 염기서열과 100%의 homology를 보여 검출된 병원균이 Ecc임을 확인하였다. 따라서 개발된 One-step multiplexRT-PCR 방법이 종자의 cDNA와 간섭없이 성공적으로 RTPCR이 수행되어 특이적으로 Ecc를 검출하였다는 것을 확인할 수 있었다.
- 2의 lane 6). PCR 결과는 1.5% agarose gel에 110 volts로 90분간 전기영동을 수행하였을 때 증폭산물들이 크기 별로 뚜렷이 구별되었다. Multiplex RT-PCR을 수행하기 위한 최적의 Tm 은 60℃로 결정하고 각각의 병원균에서 추출한 RNA를 100 ng부터 0.
- Xcv, Ecc, Cmm, PMMoV, TMGMV에서 추출된 RNA를 20 ng/µl으로 정량한 후, 혼합한 후에 Tm온도를 60℃로 설정하고 Table 2의 프라이머 combination I에서 각각의 병원균에 해당되는 프라이머와 프라이머 combination I를 넣고 PCR 수행한 결과, 타겟 병원균에 대하여 특이적인 증폭 산물을 얻었고(Fig. 2의 lane 1, 2, 3, 4, 5) 프라이머 combination I를 넣고 수행한 multiplex PCR 결과에서도 각각의 프라이머와 RT(Reverse Transcription) 단계에서 만들어진 병원균들의 cDNA들이 상호간섭 없이 5가지의 병원균 DNA에 특이적으로 결합하고 증폭되어 농도가 일정한 DNA 증폭산물을 얻었다(Fig. 2의 lane 6).
- 이들 프라이머 세트는 프라이머간의 또는 병원균 cDNA간의 간섭없이 타겟 병원균만을 검출하였다. 가지과 작물 중에서 유통 중인 고추종자 20품종과 토마토종자 10품종에 대한 종자 감염 병원균 검출을 위한 PCR을 수행한 결과, 2개 품종의 토마토종자에서 Ecc가 검출되었고 4개 품종의 고추종자에서도 Ecc가 검출되었다. 특히 고추 종자에선 Ecc가 검출된 4개 품종 외에 1개 품종에서 PMMoV, TMGMV가 동시 검출되었다.
- 6A). 그리고 생산 판매중인 고추 종자를 이용한 실험결과(Fig. 5)에서 PMMoV와 TMGMV가 동시 검출된 1품종과, Ecc가 검출된 1품종을 disease control로 지정하고 병원균이 검출되지 않은 3품종을 healthy control로 지정하여 문헌에 명시된 프라이머와 PCR 조건(Kang 등, 2003; Kim 등, 2006) 을 이용하여 PCR을 수행한 결과, PMMoV와 TMGMV가동시 검출된 품종에선 310 bp와 510 bp의 PMMoV와 TMGMV에 각각 특이적인 병원균 DNA가 증폭되었고 Ecc가 검출된 품종에서도 550 bp의 Ecc 병원균 DNA가증폭되었다. 병원균이 검출되지 않은 3 품종에서는 병원균 DNA가 증폭되지 않았다(Fig.
- NCBI Blast 프로그램을 이용한 분석된 염기서열의 homology 결과 Ecc의 유전자 염기서열과 100%의 homology를 보여 검출된 병원균이 Ecc임을 확인하였다. 따라서 개발된 One-step multiplexRT-PCR 방법이 종자의 cDNA와 간섭없이 성공적으로 RTPCR이 수행되어 특이적으로 Ecc를 검출하였다는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 생산 판매되는 20개의 고추 품종 종자시료를 이용한 PCR 검출 결과에선 4개의 품종에서 Ecc와 같은 크기의 증폭 DNA 단편을 얻었고 1개의 품종에선 PMMoV와 TMGMV의 단편과 같은 크기의 증폭 DNA을 얻었다(Fig. 5). 마찬가지로 증폭된 단편의 유전자를 분석하여 homology를 조사한 결과 Ecc, PMMoV, TMGMV와 100%의 homology를 보여 특이적으로 Ecc, PMMoV, TMGMV를 검출하였다는 것을 확인할 수 있었다.
- 5). 마찬가지로 증폭된 단편의 유전자를 분석하여 homology를 조사한 결과 Ecc, PMMoV, TMGMV와 100%의 homology를 보여 특이적으로 Ecc, PMMoV, TMGMV를 검출하였다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 1개의 시료에서 바이러스인 PMMoV, TMGMV가 동시 검출된 것이 의미하는 점은 개발된 PCR 방법이 복합 감염된 종자 시료에서 여러 가지의 병원균을 성공적으로 동시 검출 할 수 있다는 것을 의미한다(Fig.
- 5). 병원균 검출 결과 토마토 품종 10개의 시료 중에 2개의 품종에서, 고추 품종 20개의 시료 중에 5개 품종에서 병원균 검출 결과를 보였다. 기존의 multiplex PCR 방법은 세균과 바이러스로 각각 단독으로 개발되어서 세균과 바이러스를 검출하기 위해서는 PCR을 개별적으로 수행하였기 때문에 시간과 비용이 이중으로 소비되었지만 본 실험에서 개발된 multiplexPCR 방법을 적용한다면 세균과 바이러스를 동시에 검출할 수 있으므로 시간과 비용을 절감하면서 효율적으로 종자 감염 병원균을 검출할 수 있을 것이다.
- 생산 판매중인 토마토 종자를 이용한 실험결과(Fig. 4)에서 Ecc가 검출된 1품종(disease control)과 병원균이 검출되지 않은 3개의 품종(healthy control)을 대상으로 문헌에 명시된 Ecc 검출용 프라이머와 PCR 조건(Kang 등, 2003)을 이용하여 PCR을 수행한 결과, disease control에선 550 bp의 Ecc 병원균 DNA가 증폭되었고 3품종의 healthy control 에선 병원균 DNA가 증폭되지 않았다(Fig. 6A). 그리고 생산 판매중인 고추 종자를 이용한 실험결과(Fig.
- Table 2에서 열거된 프라이머 염기서열을 근거로 Tm을 50℃, 53℃, 55℃, 58℃, 60℃로 각각 설정하였다. 여러 가지 바이러 스와 세균에서 추출한 RNA를 혼합한 시료에 합성된 프라이머 세트 조합(Table 3)를 넣고 RT-PCR을 수행한 결과, Tm값이 60℃이고 프라이머 조합(combination I, Fig. 1에서 빨간색 표시) 조건에서 각각의 병원균에 특이적으로 증폭되는 DNA 밴드를 확인하였다. DNA 밴드의 indensity에는 다소 차이를 보이는 이유는 추출한 RNA를 정량하지 않고 바로 PCR에 이용하였기 때문으로 추측 된다.
- 특히 고추 종자에선 Ecc가 검출된 4개 품종 외에 1개 품종에서 PMMoV, TMGMV가 동시 검출되었다. 이로 인해 개발된 One-step multiplex RT-PCR은 서로 간섭 현상 없이 병원균을 효율적으로 검출할 수 있음을 보여 주었다.
- 마찬가지로 증폭된 단편의 유전자를 분석하여 homology를 조사한 결과 Ecc, PMMoV, TMGMV와 100%의 homology를 보여 특이적으로 Ecc, PMMoV, TMGMV를 검출하였다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 1개의 시료에서 바이러스인 PMMoV, TMGMV가 동시 검출된 것이 의미하는 점은 개발된 PCR 방법이 복합 감염된 종자 시료에서 여러 가지의 병원균을 성공적으로 동시 검출 할 수 있다는 것을 의미한다(Fig. 5). 병원균 검출 결과 토마토 품종 10개의 시료 중에 2개의 품종에서, 고추 품종 20개의 시료 중에 5개 품종에서 병원균 검출 결과를 보였다.
후속연구
- 이러한 결과로본 연구에서 개발된 병원균 동시 검출 PCR 방법은 PMMoV, TMGMV, Ecc 검출에 대해선 재현성을 가지고 있다는 것을 확인하으나, Xcv, Cmm는 감염시료를 확보하지 못하여 검사 결과의 재현성을 확인하지 못하였으므로 추후에 감염시료를 확보하여 재현성을 검정할 예정입니다. 그러나 개발된 One-step Multiplex RT-PCR 방법으로 유통 중인 고추와 토마토 종자에 적용하여 활용성을 확인하였기에 1) 종자전염 병원균의 검정, 2) 건전도 관련 민원 발생 종자의 감염율 분석, 3) 농업현장에서 보다 신속하고 정확한 진단 등에 활용하고자 한다.
- 병원균 검출 결과 토마토 품종 10개의 시료 중에 2개의 품종에서, 고추 품종 20개의 시료 중에 5개 품종에서 병원균 검출 결과를 보였다. 기존의 multiplex PCR 방법은 세균과 바이러스로 각각 단독으로 개발되어서 세균과 바이러스를 검출하기 위해서는 PCR을 개별적으로 수행하였기 때문에 시간과 비용이 이중으로 소비되었지만 본 실험에서 개발된 multiplexPCR 방법을 적용한다면 세균과 바이러스를 동시에 검출할 수 있으므로 시간과 비용을 절감하면서 효율적으로 종자 감염 병원균을 검출할 수 있을 것이다.
- 6B, C). 이러한 결과로본 연구에서 개발된 병원균 동시 검출 PCR 방법은 PMMoV, TMGMV, Ecc 검출에 대해선 재현성을 가지고 있다는 것을 확인하으나, Xcv, Cmm는 감염시료를 확보하지 못하여 검사 결과의 재현성을 확인하지 못하였으므로 추후에 감염시료를 확보하여 재현성을 검정할 예정입니다. 그러나 개발된 One-step Multiplex RT-PCR 방법으로 유통 중인 고추와 토마토 종자에 적용하여 활용성을 확인하였기에 1) 종자전염 병원균의 검정, 2) 건전도 관련 민원 발생 종자의 감염율 분석, 3) 농업현장에서 보다 신속하고 정확한 진단 등에 활용하고자 한다.
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