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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 바위솔속 식물체의 전세포추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 바위솔의 유연 관계를 분석하고 아울러 대사산물 패턴분석을 통해 바위솔속 식물의 신속한 종 식별 예측 체계를 확립하고자 하였다.
제안 방법
- 5)을 이용하여 수행하였다. Baseline 교정을 위해 FT-IR 스펙트럼 분석 영역의 양 끝점 (800 ~ 1800 cm-1)의 흡광도를 0으로 조정하였으며 실험상의 오차를 최소화하기 위하여 각 스펙트럼을 동일 면적으로 normalization하였다. 이후 데이터의 mean centering 과정을 거쳐 2차 미분한 다음 다변량 통계분석 분석을 위한 표준화된 데이터로 사용하였다.
- 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 IR globar 광원을 이용하여 DTGS 검출기로 분석 하였으며 스펙트럼은 총 400~ 4000 cm-1 범위, 4 cm-1 간격으로 총 128회 반복 조사 후 얻어진 평균 스펙트럼을 데이터 분석에 사용하였다. FT-IR 스펙트럼 조사는 각 시료당 3회 반복 조사하였다. FT-IR 스펙트럼 조사 및 데이터 변환에 사용된 프로그램은 Bruker에서 제공하는 OPUS Lab (ver.
- 각 시료 별 상층액 5 ul를 FT-IR 스펙트럼 조사용 silicon plate 위에 도말하여 FT-IR 스펙트럼을 조사하였다. FT-IR 스펙트럼은 FT-IR spectrometer (Bruker Tensor27)에 장착된 HTSXT 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트럼을 조사하였다. 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 IR globar 광원을 이용하여 DTGS 검출기로 분석 하였으며 스펙트럼은 총 400~ 4000 cm-1 범위, 4 cm-1 간격으로 총 128회 반복 조사 후 얻어진 평균 스펙트럼을 데이터 분석에 사용하였다.
- 시료가 첨가된 tube를 50℃ 수조에 넣고 20분간 방치 한 다음 13,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하였다. Tube 바닥의 침전물이 혼합되지 않도록 상층액을 조심스럽게 새 tube로 옮긴 후 FT-IR 스펙트럼을 조사하였다. 각 시료 별 상층액 5 ul를 FT-IR 스펙트럼 조사용 silicon plate 위에 도말하여 FT-IR 스펙트럼을 조사하였다.
- Tube 바닥의 침전물이 혼합되지 않도록 상층액을 조심스럽게 새 tube로 옮긴 후 FT-IR 스펙트럼을 조사하였다. 각 시료 별 상층액 5 ul를 FT-IR 스펙트럼 조사용 silicon plate 위에 도말하여 FT-IR 스펙트럼을 조사하였다. FT-IR 스펙트럼은 FT-IR spectrometer (Bruker Tensor27)에 장착된 HTSXT 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트럼을 조사하였다.
- FT-IR 스펙트럼은 FT-IR spectrometer (Bruker Tensor27)에 장착된 HTSXT 고효율 자동화 장치를 이용하여 스펙트럼을 조사하였다. 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 IR globar 광원을 이용하여 DTGS 검출기로 분석 하였으며 스펙트럼은 총 400~ 4000 cm-1 범위, 4 cm-1 간격으로 총 128회 반복 조사 후 얻어진 평균 스펙트럼을 데이터 분석에 사용하였다. FT-IR 스펙트럼 조사는 각 시료당 3회 반복 조사하였다.
- 식물체 상층부의 어린 잎을 제외하고 최대로 신장이 이루어진 성숙 잎을 각각 채취하였다. 대사체 분석을 위한 최소 시료 확보를 위해 제주바위솔, 삼척바위솔, 정선바위솔, 사천바위솔, 부산바위솔, 임계바위솔 및 진주바위솔처럼 비교적 넓은 잎을 가진 식물체는 각 개체당 2~4장의 잎을 절취하였으며, 중간 크기의 잎을 가진 바위솔은 잎 5~7장, 좀바위솔처럼 잎이 작은 경우 12 ~ 15장의 잎을 절취하였다. 절취된 각 개체 별 잎 시료는 액체질소에 급속 냉동시킨 다음 동결건조 전까지 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
- 본 연구에서는 바위솔 잎으로부터 전세포추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 다변량 통계분석 기법을 이용하여 신속하고 간편한 종 구분 및 예측 체계를 확립하였다. 바위솔, 좀바위솔, 제주바위솔 및 사천바위솔 잎추출물의 FT-IR 스펙트럼을 비교한 결과 1700 ~ 1800, 1500 ~ 1700, 그리고 950 ~ 1100 cm-1 부위에서 스펙트럼의 양적, 질적 패턴 변화가 크게 이루어짐을 알 수 있다 (Fig.
- PCA 및 PLS-DA 분석 결과로부터 얻어진 score를 이용하여 HCA (hierarchical clustering analysis) 분석을 수행하였으며 유사도 지수로 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean analysis)를 이용한 euclidean distance를 측정하여 각 시료의 유연 관계를 덴드로그램으로 표시하였다. 아울러 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 PLS-DA의 바위솔 종 판별 예측력을 조사하기 위해 총 213개의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 무작위로 training set (170개)와 test set (43개)로 나눈 다음 cross validation test를 수행하였다.
대상 데이터
- iwarenge (Makino) Hara ‘Jeju’), 정선바위솔 (O. iwarenge ‘Jeongsun’), 임계바위솔 (O. iwarenge ‘Yimge’), 진주바위솔 (O. margaritifolius Y. N. Lee ‘Jinju’), 사천바위솔 (O. malacophylla ‘Sacheon’) 및 부산바위솔 (O. malacophylla ‘Busan’) 등 총 9종의 바위솔 식물을 사용하였다.
- malacophylla ‘Busan’) 등 총 9종의 바위솔 식물을 사용하였다. 바위솔, 좀바위솔, 삼척바위솔, 제주바위솔, 정선면바위솔, 사천바위솔 및 부산바위솔의 경우 9개의 식물체를 확보하였으며, 임계바위솔과 진주바위솔의 경우 4개 식물체를 확보하였다 (Fig. 1). 배양환경 차이에 따른 대사산물 패턴의 차이를 최소화하기 위하여 모든 식물체는 동일한 조건에서 생육되고 있는 동일 농장 (충청남도 논산시)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 1). 배양환경 차이에 따른 대사산물 패턴의 차이를 최소화하기 위하여 모든 식물체는 동일한 조건에서 생육되고 있는 동일 농장 (충청남도 논산시)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 식물체 상층부의 어린 잎을 제외하고 최대로 신장이 이루어진 성숙 잎을 각각 채취하였다.
- 배양환경 차이에 따른 대사산물 패턴의 차이를 최소화하기 위하여 모든 식물체는 동일한 조건에서 생육되고 있는 동일 농장 (충청남도 논산시)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 식물체 상층부의 어린 잎을 제외하고 최대로 신장이 이루어진 성숙 잎을 각각 채취하였다. 대사체 분석을 위한 최소 시료 확보를 위해 제주바위솔, 삼척바위솔, 정선바위솔, 사천바위솔, 부산바위솔, 임계바위솔 및 진주바위솔처럼 비교적 넓은 잎을 가진 식물체는 각 개체당 2~4장의 잎을 절취하였으며, 중간 크기의 잎을 가진 바위솔은 잎 5~7장, 좀바위솔처럼 잎이 작은 경우 12 ~ 15장의 잎을 절취하였다.
- 그러나 본 cross-validation 결과는 random sampling에 따라서 예측을 하였으며 총 100번을 예측을 하여 정확도를 계산하였고 평균값으로 예측 정확도를 계산하였다. 첫 번째 예측을 예시로 보면, 각각 예측이 잘못된 경우는 정선바위솔 1개 시료를 제주바위솔로 예측하였으며 부산바위솔 1개 시료를 사천바위솔으로 각각 예측하였다 (Table 1). 그러나 정선바위솔 및 제주바위솔은 연화바위솔에 분류되고 부산바위솔 및 사천바위솔 역시 둥근바위솔에 분류되어 동일 종 내에 속하기 때문에 대사산물의 패턴이 거의 유사하였기 때문에 예측이 실패한 것으로 사료된다.
데이터처리
- FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석을 통하여 바위솔속 식물의 종 예측이 가능한지 여부를 cross-validation test를 수행하였다. 그 결과 바위솔 종 예측의 정확도는 92.
- FT-IR 스펙트럼 데이터의 다변량 통계분석을 위해 먼저 FT-IR 스펙트럼 데이터의 baseline 교정, normalization 및 mean centering 등 스펙트럼의 전처리 과정을 R 프로그램(ver 2.5)을 이용하여 수행하였다. Baseline 교정을 위해 FT-IR 스펙트럼 분석 영역의 양 끝점 (800 ~ 1800 cm-1)의 흡광도를 0으로 조정하였으며 실험상의 오차를 최소화하기 위하여 각 스펙트럼을 동일 면적으로 normalization하였다.
- 이와 같이 가공된 FT-IR 스펙트럼 데이터는 NIPALS 알고리즘 (Wold 1966)에 따라 PCA (Principal component analysis) 및 PLS-DA (Partial least squares discriminant analysis)분석을 수행하였다. PCA 및 PLS-DA 분석 결과로부터 얻어진 score를 이용하여 HCA (hierarchical clustering analysis) 분석을 수행하였으며 유사도 지수로 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean analysis)를 이용한 euclidean distance를 측정하여 각 시료의 유연 관계를 덴드로그램으로 표시하였다. 아울러 FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용하여 PLS-DA의 바위솔 종 판별 예측력을 조사하기 위해 총 213개의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 무작위로 training set (170개)와 test set (43개)로 나눈 다음 cross validation test를 수행하였다.
- 9%이었다. 그러나 본 cross-validation 결과는 random sampling에 따라서 예측을 하였으며 총 100번을 예측을 하여 정확도를 계산하였고 평균값으로 예측 정확도를 계산하였다. 첫 번째 예측을 예시로 보면, 각각 예측이 잘못된 경우는 정선바위솔 1개 시료를 제주바위솔로 예측하였으며 부산바위솔 1개 시료를 사천바위솔으로 각각 예측하였다 (Table 1).
이론/모형
- FT-IR 스펙트럼 조사는 각 시료당 3회 반복 조사하였다. FT-IR 스펙트럼 조사 및 데이터 변환에 사용된 프로그램은 Bruker에서 제공하는 OPUS Lab (ver. 6.5, Bruker Optics Inc.)를 사용하였다.
- 이후 데이터의 mean centering 과정을 거쳐 2차 미분한 다음 다변량 통계분석 분석을 위한 표준화된 데이터로 사용하였다. 이와 같이 가공된 FT-IR 스펙트럼 데이터는 NIPALS 알고리즘 (Wold 1966)에 따라 PCA (Principal component analysis) 및 PLS-DA (Partial least squares discriminant analysis)분석을 수행하였다. PCA 및 PLS-DA 분석 결과로부터 얻어진 score를 이용하여 HCA (hierarchical clustering analysis) 분석을 수행하였으며 유사도 지수로 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic mean analysis)를 이용한 euclidean distance를 측정하여 각 시료의 유연 관계를 덴드로그램으로 표시하였다.
성능/효과
- 4). PLS-DA plot을 보면 제주바위솔을 제외하고 대부분 바위솔속 식물들이 동일 종끼리 집단을 형성하며 집단간의 경계가 더욱 분명해짐을 알 수 있었다 (Fig. 4A). 특히 바위솔과 좀바위솔 집단의의 공간적 거리가 연화바위솔이나 둥근바위솔에 비해 매우 크게 나타났다.
- 이 결과는 바위솔속 식물의 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석을 통해 바위솔속 식물의 집단 구분이 가능함을 의미하는 것이다. PLS-DA 데이터로부터 얻어진 HCA dendrogram을 보면 총 9개의 바위솔속 실물들이 5개의 소집단으로 구분이 이루어짐을 알 수 있었다 (Fig. 4B). 바위솔이 가장 외곽에 위치하며 그사이에 좀바위솔이 위치하고 연화바위솔로 분류되어 있는 임계바위솔, 제주바위솔, 및 정선바위솔이 하나의 소그룹으로 집단을 구성하고 있음을 알 수 있었다.
- FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석을 통하여 바위솔속 식물의 종 예측이 가능한지 여부를 cross-validation test를 수행하였다. 그 결과 바위솔 종 예측의 정확도는 92.9%이었다. 그러나 본 cross-validation 결과는 random sampling에 따라서 예측을 하였으며 총 100번을 예측을 하여 정확도를 계산하였고 평균값으로 예측 정확도를 계산하였다.
- 3A). 또한 PCA score plot에서 동일 종에 속하는 각각의 개체들의 분포가 넓게 퍼져서 이루어져 각 집단의 경계가 겹쳐짐을 알 수 있었다 (Fig. 3A). 제주바위솔의 경우 삼척바위솔과 거의 겹치며 사천바위솔 역시 정선바위솔 및 부산바위솔과 집단 경계가 겹쳐짐을 알 수 있었다.
- 바위솔 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PCA 분석 결과 score 1과 2의 설명력은 각각 35.9%와 21.3%로 전체 변이량의 57.2%를 반영하고 있어 전체 데이터 set에서 이루어지는 변이량을 충분히 반영하지 못함을 알 수 있다 (Fig. 3A). 또한 PCA score plot에서 동일 종에 속하는 각각의 개체들의 분포가 넓게 퍼져서 이루어져 각 집단의 경계가 겹쳐짐을 알 수 있었다 (Fig.
- 본 연구에서는 바위솔 잎으로부터 전세포추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 다변량 통계분석 기법을 이용하여 신속하고 간편한 종 구분 및 예측 체계를 확립하였다. 바위솔, 좀바위솔, 제주바위솔 및 사천바위솔 잎추출물의 FT-IR 스펙트럼을 비교한 결과 1700 ~ 1800, 1500 ~ 1700, 그리고 950 ~ 1100 cm-1 부위에서 스펙트럼의 양적, 질적 패턴 변화가 크게 이루어짐을 알 수 있다 (Fig. 2). FT-IR 스펙트럼의 이 부위는 각각 lipids, amide I, II 그리고 carbohydrates 계열의 화합물들의 양적, 질적인 정보를 반영하는 부위로 따라서 이들 계열의 전반적인 대사산물이 국내에 자생중인 바위솔속 식물간에 차이가 있음을 의미하는 결과라 사료된다.
- 4B). 바위솔이 가장 외곽에 위치하며 그사이에 좀바위솔이 위치하고 연화바위솔로 분류되어 있는 임계바위솔, 제주바위솔, 및 정선바위솔이 하나의 소그룹으로 집단을 구성하고 있음을 알 수 있었다. 한편 둥근바위솔로 분류되어 있는 사천바위솔 및 부산바위솔은 동일 소그룹에 집단 형성이 이루어지지만 삼척바위솔은 둥근바위솔 집단에서 벗어나 별도의 그룹을 형성함을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 바위솔 잎으로부터 전세포추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 PLS-DA 방법을 이용하여 신속하고 간편한 종 구분 및 95.4% 정확도를 보이는 예측 체계를 확립하였다. 본 연구그룹에서는 본 기술을 통하여 고등식물의 종 구분 (Kim et al.
- 특히 바위솔과 좀바위솔 집단의의 공간적 거리가 연화바위솔이나 둥근바위솔에 비해 매우 크게 나타났다. 이 결과는 바위솔속 식물의 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석을 통해 바위솔속 식물의 집단 구분이 가능함을 의미하는 것이다. PLS-DA 데이터로부터 얻어진 HCA dendrogram을 보면 총 9개의 바위솔속 실물들이 5개의 소집단으로 구분이 이루어짐을 알 수 있었다 (Fig.
- 제주바위솔의 경우 삼척바위솔과 거의 겹치며 사천바위솔 역시 정선바위솔 및 부산바위솔과 집단 경계가 겹쳐짐을 알 수 있었다. 이 결과는 바위솔의 동일 집단 내 변이가 이종 집단 사이의 변이보다 크다는 것을 의미하며 궁극적으로 PCA 분석 만으로는 바위솔속 식물의 종 구분이 불가능 함을 의미한다. PCA 분석 데이터를 이용한 HCA dendrogram 역시 바위솔이 좀바위솔이나 둥근바위솔 및 연화바위솔과 다르게 집단을 형성하지만 RAPD (Lee et al.
- 한편 둥근바위솔로 분류되어 있는 사천바위솔 및 부산바위솔은 동일 소그룹에 집단 형성이 이루어지지만 삼척바위솔은 둥근바위솔 집단에서 벗어나 별도의 그룹을 형성함을 알 수 있었다. 진주바위솔의 경우 별도의 종으로 구분되고 있으나 본 연구 결과에서는 연화바위솔 집단에 그룹을 형성함을 알 수 있었다. RAPD (random Amplification of Polymorphic DNA)를 이용한 바위솔속 식물의 집단 구분 결과를 보면 연화바위솔과 둥근바위솔이 유연관계가 높으며 바위솔과 좀바위솔은 비교적 유연관계가 높지 않음을 보고한바 있다 (Lee et al.
- 4A). 특히 바위솔과 좀바위솔 집단의의 공간적 거리가 연화바위솔이나 둥근바위솔에 비해 매우 크게 나타났다. 이 결과는 바위솔속 식물의 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석을 통해 바위솔속 식물의 집단 구분이 가능함을 의미하는 것이다.
- 바위솔이 가장 외곽에 위치하며 그사이에 좀바위솔이 위치하고 연화바위솔로 분류되어 있는 임계바위솔, 제주바위솔, 및 정선바위솔이 하나의 소그룹으로 집단을 구성하고 있음을 알 수 있었다. 한편 둥근바위솔로 분류되어 있는 사천바위솔 및 부산바위솔은 동일 소그룹에 집단 형성이 이루어지지만 삼척바위솔은 둥근바위솔 집단에서 벗어나 별도의 그룹을 형성함을 알 수 있었다. 진주바위솔의 경우 별도의 종으로 구분되고 있으나 본 연구 결과에서는 연화바위솔 집단에 그룹을 형성함을 알 수 있었다.
후속연구
- 2007, 2009)이 가능함을 보고한 바 있다. 따라서 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석 방법은 방법의 간편성과 신속성을 고려할 때 바위솔속 식물의 신속한 식별 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다. 아울러 본 연구에서 확립된 대사체 기반 식별체계는 현재 시장에서 유통되고 있는 바위솔속 식물들의 지역적 기반 분류체계를 보다 정확한 계통분류학적 분류체계로 재구축하는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
- 아울러 동위효소를 이용한 바위솔속 식물의 유연관계 분석을 통해 한국산 바위솔속 종간에는 유전적 동질성이 낮으며 이는 지리적 종분화 과정을 통하여 점진적인 분화가 이루어짐을 시사한 바 있다 (Kim and Park 2005). 따라서 본 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석 결과는 삼척바위솔을 제외하고는 RAPD (Lee et al. 2001), 형태적 특징 (Lee et al. 2003) 및 동위효소를 기초로 한 바위솔속 식물간의 분류학적 유연관계 보고와 거의 일치 함을 알 수 있어 향후 이를 통한 바위솔속 식물의 신속한 종 구분 체계 확립이 가능할 것으로 기대된다.
- 따라서 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA 분석 방법은 방법의 간편성과 신속성을 고려할 때 바위솔속 식물의 신속한 식별 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대된다. 아울러 본 연구에서 확립된 대사체 기반 식별체계는 현재 시장에서 유통되고 있는 바위솔속 식물들의 지역적 기반 분류체계를 보다 정확한 계통분류학적 분류체계로 재구축하는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
- 2009) 의 품종 식별 (2009)이 가능함을 보고한 바 있다. 향후 대사산물 추출 조건의 다양화 및 표준화 그리고 보다 다양하고 많은 수의 바위솔 시료 분석이 이루어진다면 PLS-DA 방법을 통한 종예측 함수의 신뢰도를 높일 수 있을 것으로 사료되며 이를 기반으로 바위솔의 신속하고 정확한 유연관계 규명 및 종 예측체계 개발이 가능할 것으로 기대된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.