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문제 정의
- 일반적으로 IAP family 중 일부는 caspase와 직접적으로 결합함으로써 그들의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있으므로 apoptosis 유발에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서 WELVR 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발에 IAP family가 관여하는지의 여부를 조사하였다. Fig.
- 이러한 IAP family 중 일부는 caspase와 직접적인 결합을 함으로써 caspase의 활성을 억제하여 apoptosis를 억제하는 것으로 알려져 있으므로 IAP family들의 잠재적인 역할에 대한 관심이 높아지고 있다(34,35). 따라서 본 연구에서는 WELVR이 여러 종류의 caspase 중 caspase-3, -8 및 -9의 발현 및 활성에 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였으며, 기질단백질들의 발현과 더불어 IAP family의 발현 변화를 조사하였다. 먼저 caspase의 발현 및 활성 정도를 확인한 결과, 조사된 세 종류의 caspase 모두 불활성형 단백질의 발현 감소 또는 활성형 단백질의 발현 증가와 더불어 in vitro 활성 정도가 증가되는 것으로 나타났으며, caspase-3의 기질단백질인 PARP, βcatenin 및 PLC-γ1의 경우에도 WELVR 처리 농도 의존적으로 단편화 유발이 증가되는 것으로 나타났다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 콩다닥냉이의 생리활성 평가 중, 항암활성에 관한 자료 조사를 위하여 콩다닥냉이 잎 및 뿌리의 열수 추출물을 이용하여 HCT116 인체 대장암세포의 증식억제에 관한 생화학적 기전의 해석을 시도하였다. 이를 위하여 이들 추출물에 의한 대장암세포 증식억제 현상이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 조사하였으며, apoptosis 조절 관련 주요 두 경로인 extrinsic 및 intrinsic pathway에 관여하는 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 HCT116 인체 대장암세포에서 콩다닥냉이잎 및 뿌리 열수 추출물(WELVL 및 WELVR)이 유발하는 항암효과 및 항암기전을 조사하였다. 이를 위하여 WELVL 및 WELVR이 함유된 배지에서 48시간 동안 배양된 암세포들을 대상으로 증식억제 정도를 조사한 결과, 정상배지에서 자란 암세포와 비교해서 WELVL 및 WELVR의 처리 농도가 증가할수록 증식억제 현상이 증가하는 것으로 나타났다(Fig.
- Caspase의 활성화는 대부분의 apoptosis 유발 과정에 동반되며, apoptosis 유발에 대한 직접적인 증거가 될 수 있음이 많은 선행연구를 통해서 검증되어져 왔다. 본 연구에서는 caspase 중, apoptosis 조절에 중심이 되는 caspase-3, -8및 -9의 발현 및 활성의 변화 정도를 Western bolt analysis 및 in vitro caspase activity assay를 통하여 조사하였다. Fig.
- 본 연구에서는 콩다닥냉이 추출물의 항암활성을 조사하기 위하여 잎 및 뿌리의 열수 추출물(WELVL 및 WELVR) 이 HCT116 대장암세포의 증식 억제와 연관된 apoptosis 유도 기전에 관한 연구를 시도하였다. 본 연구의 결과에 의하면 HCT116 세포에 WELVL 및 WELVR을 처리하였을 경우에 유발되는 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 증식억제 및 apoptosis 유도 효과는 WELVL에 비하여 WELVR에서 높게 나타났다.
- 따라서 본 연구에서는 콩다닥냉이의 생리활성 평가 중, 항암활성에 관한 자료 조사를 위하여 콩다닥냉이 잎 및 뿌리의 열수 추출물을 이용하여 HCT116 인체 대장암세포의 증식억제에 관한 생화학적 기전의 해석을 시도하였다. 이를 위하여 이들 추출물에 의한 대장암세포 증식억제 현상이 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 조사하였으며, apoptosis 조절 관련 주요 두 경로인 extrinsic 및 intrinsic pathway에 관여하는 몇 가지 중요한 유전자들의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 150 μg의 단백질이 함유된 50 μL의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer[40 mM HEPES(pH 7.4), 20% glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-DTT]50 μL를 혼합하여 각 sample 당 총 volume이 100 μL가 되게 하였다.
- Apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 WELVR이 처리된 배지에서 자란 암세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃,암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35 mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT(Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 WELVR 및 WELVL이 처리된 세포를 모은 다음 상층액을 제거하고 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution을 500 μL 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다.
- Caspase의 활성 정도를 확인하기 위하여 정상 및 WELVR 이 처리된 배지에서 48시간 배양된 세포를 모은 뒤 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량하였다. 150 μg의 단백질이 함유된 50 μL의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer[40 mM HEPES(pH 7.
- WELVL 및 WELVR의 처리에 따른 증식억제 현상이 암세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 WELVL 및 WELVR을 다양한 농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 도립 현미경을 이용하여 관찰하였다. Fig.
- 각 PCR 산물들을 양적 차이를 확인하기 위하여 1×TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 100 V에서 전기영동을 하였다.
- 7B에 나타난 바와 같이 WELVR 처리에 따라 caspase-3, -8 및 -9의 활성이 모두에서 증가하였음을 확인할 수 있었다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 몇 가지 기질단백질의 발현에 미치는 WELVR의 영향을 조사하였다. Fig.
- 다음은 WELVR 처리에 따른 apoptosis 유발 과정에서, apoptosis 조절에 중심이 되는 mitochondria의 기능 손상 연관성을 조사하였다. 이를 위하여 정상 또는 WELVR이 함유된 배지에서 배양된 세포들을 모아서 dual-emission fluorescent dye인 JC-1을 처리하여 염색한 후 DNA flow cytometric analysis를 이용하여 MMP의 손실 정도를 조사 하였다.
- 3A에 나타난 바와 같이 WELVR을 처리하지 않았을 경우에는 DNA 단편화에 따른 DNA laddering 현상을 관찰할 수 없었지만 WELVR 처리농도 증가에 따라 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰할 수 있었다. 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 이용하여 apoptosis가 유발되었을 것으로 예상되는 sub-G1기에 해당하는 세포를 측정한 결과는 Fig. 3B에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 정상배지에서 자란 암세포에서의 sub-G1기의 세포의 빈도는 약 4.
- 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 TRIzol reagent(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit(Intron, Seongnam, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다.
- 반응시킨 세포를 2,000 rpm으로 원심분리하여 상층액을 버리고 다시 500 μL의 차가운 PBS를 첨가하고 35 mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur에 적용시켜 WELVR 처리에 따른 MMP의 변화 정도를 분석하였다.
- Apoptosis 유발 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 WELVR이 처리된 배지에서 자란 암세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃,암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35 mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA content 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT(Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
- 분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 antibody를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 시킨 다음 2차 antibody를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence(ECL) solution(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film 에 감광시켜 특정단백질의 발현양을 분석하였다. Mitochondrial membrane potential(MMP, Δψm) 분석 WELVR이 처리된 암세포의 MMP 변화 정도를 측정하기 위하여 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 세포들만 모은 다음 500 μL의 PBS를 첨가하여 충분히 섞은 후, 10 μM JC-1(Sigma)을 처리하여 20분 동안 37℃에서 반응시켰다.
- 조건 하에서 배양하였다. 배지는 매 48시간마다 교환해주었고, 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-ethylenediamine tetraacetic aci(EDTA, Gibco BRL)를 처리하여 세포를 부유시킨 다음 적정수의 세포를 분주하여 재배양하였다.
- , Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 각각의 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit(Intron, Seongnam, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들을 양적 차이를 확인하기 위하여 1×TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 DNA gel loading solution을 섞어서 loading 한 후 100 V에서 전기영동을 하였다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride(PMSF), 5 mM dithiothreitol(DTT)]를 첨가하여 4℃에서30분간 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리 하여그 상층액을 취하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer(Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate(SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다.
- 세포 배양용 100 mm petri dishes에 세포를 3×105개/mL 정도로 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 WELVR 및 WELVL을 적정농도로 희석 처리하여 48시간 동안 배양한 후, 도립 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다.
- 암세포의 증식에 미치는 WELVL 및 WELVR의 영향 WELVL 및 WELVR의 처리에 따른 인체 대장암세포주인 HCT116 세포의 증식억제 정도를 알아보기 위하여 준비된 세포에 WELVL 및 WELVR을 적정농도로 처리하여 48시간 경과 후 MTT assay를 이용하여 조사하였다. Fig.
- 여기에 caspase 종류에 따른 기질 5 μL를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
- Louis, MO, USA) 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
- 2). 이러한 현상들은 WELVR 처리군에서 더욱 강하게 나타났으므로 WELVR 처리에 따른 DNA 단편화 현상 및 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사함으로써 apoptosis 유발과의 연관성을 재확인하였다. 먼저 apoptosis 증거로서 사용되는 DNA 단편화 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사한 결과, WELVR 처리에 의하여 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되어 나타나는 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었다(Fig.
- DNA pellet에 RNase A가 적당량 들어있는 TE buffer를 이용하여 녹인 후, 6×gel loading dye(Bioneer)를 섞어 주었다. 이를 1.6% agarose gel을 이용하여 1시간 동안 50 V로 전기영동 시킨 후 ethidium bromide(EtBr, Sigma)로 염색하여 DNA fragmentation 현상을 확인한 다음 ultra vilolet(UV) 하에서 관찰하였다.
- 이를 암세포에 처리하기 위해서 적정 농도로 성장배지에 첨가하여 녹인 다음, 0.22 μm의 pore size를 가진 주사기용 필터유닛을 사용하거나 1회용 펌프 필터 유닛을 사용하여 미생물 및 불순물을 걸러낸 다음, 세포의 성장배지를 갈아주면서 직접 처리하였다.
- 다음은 WELVR 처리에 따른 apoptosis 유발 과정에서, apoptosis 조절에 중심이 되는 mitochondria의 기능 손상 연관성을 조사하였다. 이를 위하여 정상 또는 WELVR이 함유된 배지에서 배양된 세포들을 모아서 dual-emission fluorescent dye인 JC-1을 처리하여 염색한 후 DNA flow cytometric analysis를 이용하여 MMP의 손실 정도를 조사 하였다. Fig.
- 결과에서 나타난 바와 같이 정상 배지에서 자란 암세포의 경우에는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나, WELVL 및 WELVR이 처리된 암세포의 경우 처리농도가 증가할수록 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 처리농도 의존적으로 증가되었다. 이상의 결과에서 WELVL 및 WELVR에 의한 HCT116 세포에서의 증식억제 및 형태변화가 apoptosis와 연관이 있음을 알 수 있었으며, 이러한 현상들은 WELVL 처리군에 비교하여 WELVR 처리군에서 더욱 강하게 유발되는 것으로 나타났으므로 이후의 실험은 WELVR 처리군을 대상으로 진행하였다.
- 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의하여 유발되는 암세포의 증식억제 및 형태변화가 apoptosis와 연관이 있다는 것을 재확인하기 위하여 정상 및 WELVR이 처리된 배지에서 HCT116 세포를 이용하여 DNA 단편화 현상 및 sub-G1기 세포의 빈도를 조사하였다. 먼저 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA 단편화 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사한 결과, Fig.
- 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 EtBr를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다.
대상 데이터
- (Santa Cruz, CA, USA) 및 CalBiochem(San Diego, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey antirabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science Corp.(Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 또한 caspases의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kits는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용된 HCT116 인체 대장암세포는 한국생명공학연구소(KRIBB, Deajeon, Korea)에서 분주 받아 사용하였으며, 암세포의 배양을 위해 90%의 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco BRL)에 1%의 penicillin 및 streptomycin(Gibco BRL)이 포함된 성장배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배지는 매 48시간마다 교환해주었고, 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.
- 본 연구에 사용된 콩다닥냉이는 부산광역시 기장지역에서 채취한 것으로서 잎 열수 추출물(water extract of L. virginicum leaf, WELVL) 및 뿌리 열수 추출물(water extract of L. virginicum root, WELVR)을 얻기 위하여 흐르는 물로 충분히 세척하고 건조시킨 후 잘게 분쇄하였다. 건조된 콩다닥냉이 뿌리와 잎을 100 g당 1 L의 증류수를 첨가하여 환류 냉각장치가 장착된 가열기에서 180～200℃의 온도로 3시간 동안 끓인 후, 상층액만 분리하여 3,000 rpm에서 20분간 원심분리 시켜 찌꺼기를 제거한 다음 Whatman 필터(No.
- 여기에 caspase 종류에 따른 기질 5 μL를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 AspGlu-Val-Asp(DEVD)-p-nitroaniline(pNA)이었고 caspase8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)-pNA였다.
데이터처리
- 5 mg/mL 농도가 되게 희석하여 2 mL씩 분주하고 3시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethylsulfoxide(DMSO, Amresco)를 1 mL씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μL씩 옮겨서 ELISA reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준오차를 Microsoft Excel 프로그램으로 구하였다.
이론/모형
- Cells were treated with the indicated concentrations of WELVL and WELVR for 48 hr. The growth inhibition was measured by the metabolic-bye-based MTT assay. Results are expressed as percentage of the vehicle treated control±SD of three separate experiments.
- WELVR 처리에 의한 HCT116 세포에서의 apoptosis 유발에 있어서 먼저 death receptor에 속하는 유전자들이 관여하는 지를 확인하기 위하여 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. Fig.
성능/효과
- WELVL 및 WELVR의 처리에 따른 증식억제 현상이 암세포의 형태에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 WELVL 및 WELVR을 다양한 농도로 처리하여 48시간 동안 배양한 후 도립 현미경을 이용하여 관찰하였다. Fig. 2A에서 볼 수 있듯이 WELVL 및 WELVR의 처리농도가 증가할수록 암세포의 밀도가 감소하면서 길고 분지를 형성하는 듯한 구조로 바뀌었으며, 부착력을 상실하고 배지 위로 부유 되는 경향성이 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 암세포의 부착능력 상실 및 암세포의 분화가 수반되었을 가능성을 의미하는 것으로 생각되며 WELVL 및 WELVR 처리에 의한 형태적 변화 정도가 증식억제와 부합되는 결과였다.
- WELVR 처리에 의한 HCT116 세포에서의 apoptosis 유발에 있어서 먼저 death receptor에 속하는 유전자들이 관여하는 지를 확인하기 위하여 RT-PCR 및 Western blot analysis 방법으로 조사하였다. Fig. 4의 결과에서 볼 수 있듯이 Fas, DR4, DR5 및 TRAIL의 경우에는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만 FasL의 경우에는 전사 및 번역수준 모두에서 WELVR 처리군에서 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 이는 WELVR에 의한 apoptosis 유발에 있어서 death receptor가 관여할 가능성을 보여주는 결과라고 생각된다.
- 이를 위하여 정상 또는 WELVR이 함유된 배지에서 배양된 세포들을 모아서 dual-emission fluorescent dye인 JC-1을 처리하여 염색한 후 DNA flow cytometric analysis를 이용하여 MMP의 손실 정도를 조사 하였다. Fig. 6에 나타난 바와 같이 WELVR을 처리하지 않았을 경우에는 MMP의 변화가 거의 관찰되지 않았지만 WELVR 처리 농도가 증가할수록 MMP의 손실 정도가 증가하여 최고 농도인 1.5 mg/mL 처리군에서는 약 55% 정도의 MMP 손실이 유발되어, WELVR에 의한 apoptosis 유발에 mitochondria의 기능 이상이 연관되어 있다는 것을 보여주는 결과이다.
- 본 연구에서는 caspase 중, apoptosis 조절에 중심이 되는 caspase-3, -8및 -9의 발현 및 활성의 변화 정도를 Western bolt analysis 및 in vitro caspase activity assay를 통하여 조사하였다. Fig. 7A에서 나타난 바와 같이 caspase-3 및 -8의 경우에는 불활성형 단백질의 발현이 WELVR 처리 농도 의존적으로 감소되었으며, caspase-9의 경우에는 활성형 단백질의 발현이 WELVR 처리에 따라 증가되어, WELVR 처리에 의하여 이들 caspase가 활성화되었을 가능성을 보여주었다. 이를 정량적으로 재확인하기 위하여 in vitro assay를 실시한 결과, Fig.
- Fig. 7A에서 볼 수 있듯이 WELVR의 처리 농도 증가에 따라 DNA repair와 genomic stability에 관여하는 PARP, 세포내 골격 유지와 세포 유착에 관여하는 β-catenin 및 세포의 성장과 증식에 중요한 역할을 하는 PLC-γ1 단백질의 단편화 현상이 매우 증가되었다.
- 1). WELVL 및 WELVR 처리에 따른 증식억제 현상은 처리농도 의존적으로 암세포의 밀도 감소와 더불어 부착력 상실 및 심한 형태적 변형이 유발되었으며, 특히 apoptosis 특징 중 하나로서 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단을 유발함으로써 나타나는 apoptotic body의 현저한 증가가 동반되었다(Fig. 2). 이러한 현상들은 WELVR 처리군에서 더욱 강하게 나타났으므로 WELVR 처리에 따른 DNA 단편화 현상 및 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사함으로써 apoptosis 유발과의 연관성을 재확인하였다.
- 2B에 나타낸 바와 같다. 결과에서 나타난 바와 같이 정상 배지에서 자란 암세포의 경우에는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나, WELVL 및 WELVR이 처리된 암세포의 경우 처리농도가 증가할수록 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 처리농도 의존적으로 증가되었다. 이상의 결과에서 WELVL 및 WELVR에 의한 HCT116 세포에서의 증식억제 및 형태변화가 apoptosis와 연관이 있음을 알 수 있었으며, 이러한 현상들은 WELVL 처리군에 비교하여 WELVR 처리군에서 더욱 강하게 유발되는 것으로 나타났으므로 이후의 실험은 WELVR 처리군을 대상으로 진행하였다.
- 5에 나타난 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 전사 및 번역 수준 모두에서 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2 및 Bcl-XL의 발현 감소와 함께 pro-apoptotic 유전자인 Bax 및 Bad의 발현 증가가 WELVR 처리 농도 의존적으로 유발되는 것으로 나타났다. 또한 활성화된 caspase-8에 의한 mitochondria 기능 이상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bid의 발현도 WELVR 처리에 의하여 감소하는 것으로 조사되었다.
- 3B에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 정상배지에서 자란 암세포에서의 sub-G1기의 세포의 빈도는 약 4.76%로 매우 낮았으나 WELVR의 처리 농도의 증가에 따라 sub-G1기에 해당하는 세포의 빈도가 증가하여 1.5 mg/mL 처리군에서는 약 24.91%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 WELVR에 의한 HCT116 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 연관이 있음을 알 수 있었다.
- 한편 Bcl-2 family 중 Bid의 경우에는 extrinsic pathway에 의하여 활성화된 caspase-8에 의하여 단편화된 형태인 tBid의 형성이 유발됨으로써 mitochondria의 기능이상에 관여하는 것으로 알려져 있다(25,26). 따라서 WELVR 처리에 의해 유발된 apoptosis에 있어서 extrinsic pathway 및 intrinsic pathway에 관여하는 유전자들이 어떠한 영향을 미치는 지를 확인한 결과, WELVR 처리군에서 FasL의 발현 증가와 더불어 Bcl-2 및 Bcl-XL의 발현 감소와 Bax 및Bad의 발현 증가가 관찰되었다(Fig. 4 및 Fig. 5). 또한 Bid의 발현 감소 및 MMP의 손실 정도가 증가하였으므로 tBid의 형성 및 mitochondria의 기능이상에 따른 cytochrome c의 방출이 동반되었을 것으로 추정된다.
- 7). 또한 IAP family에 속하는 XIAP, cIAP-1 및 cIAP-2의 발현이 감소하는 것으로 나타나 WELVR 처리에 의한 apoptosis의 유발에서 IAP family가 caspase의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 생각할 수 있다.
- 결과에서 알 수 있듯이 전사 및 번역 수준 모두에서 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2 및 Bcl-XL의 발현 감소와 함께 pro-apoptotic 유전자인 Bax 및 Bad의 발현 증가가 WELVR 처리 농도 의존적으로 유발되는 것으로 나타났다. 또한 활성화된 caspase-8에 의한 mitochondria 기능 이상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bid의 발현도 WELVR 처리에 의하여 감소하는 것으로 조사되었다. 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 최소한 Bcl-2 family가 중요한 역할을 하고 있음을 의미하는 것이며, 특히 Bcl-2 family의 발현 변화에 따른 MMP의 변화와 더불어 apoptosis 유발 관련 효소들의 활성화가 이루어지고 있음을 시사한다.
- 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의하여 유발되는 암세포의 증식억제 및 형태변화가 apoptosis와 연관이 있다는 것을 재확인하기 위하여 정상 및 WELVR이 처리된 배지에서 HCT116 세포를 이용하여 DNA 단편화 현상 및 sub-G1기 세포의 빈도를 조사하였다. 먼저 apoptosis 유발의 직접적인 증거에 해당하는 DNA 단편화 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사한 결과, Fig. 3A에 나타난 바와 같이 WELVR을 처리하지 않았을 경우에는 DNA 단편화에 따른 DNA laddering 현상을 관찰할 수 없었지만 WELVR 처리농도 증가에 따라 apoptosis가 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering을 관찰할 수 있었다. 동일 조건에서 배양된 세포들을 대상으로 PI 염색을 이용하여 핵을 염색한 후 DNA flow cytometry 분석을 이용하여 apoptosis가 유발되었을 것으로 예상되는 sub-G1기에 해당하는 세포를 측정한 결과는 Fig.
- 이러한 현상들은 WELVR 처리군에서 더욱 강하게 나타났으므로 WELVR 처리에 따른 DNA 단편화 현상 및 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사함으로써 apoptosis 유발과의 연관성을 재확인하였다. 먼저 apoptosis 증거로서 사용되는 DNA 단편화 여부를 agarose gel 전기영동으로 조사한 결과, WELVR 처리에 의하여 endonuclease가 활성화되어 chromosomal DNA가 단편화되어 나타나는 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 3A). 이러한 apoptosis 유발정도를 정량적으로 확인하기 위하여 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사한 결과, WELVR 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하는 것으로 나타났다(Fig.
- 먼저 caspase의 발현 및 활성 정도를 확인한 결과, 조사된 세 종류의 caspase 모두 불활성형 단백질의 발현 감소 또는 활성형 단백질의 발현 증가와 더불어 in vitro 활성 정도가 증가되는 것으로 나타났으며, caspase-3의 기질단백질인 PARP, βcatenin 및 PLC-γ1의 경우에도 WELVR 처리 농도 의존적으로 단편화 유발이 증가되는 것으로 나타났다(Fig. 7).
- 본 연구에서는 콩다닥냉이 추출물의 항암활성을 조사하기 위하여 잎 및 뿌리의 열수 추출물(WELVL 및 WELVR) 이 HCT116 대장암세포의 증식 억제와 연관된 apoptosis 유도 기전에 관한 연구를 시도하였다. 본 연구의 결과에 의하면 HCT116 세포에 WELVL 및 WELVR을 처리하였을 경우에 유발되는 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 증식억제 및 apoptosis 유도 효과는 WELVL에 비하여 WELVR에서 높게 나타났다. 특히 WELVR에 의한 apoptosis 유발에는 FasL의 발현 증가를 통한 caspase-8의 활성화와 이로 인한 Bid 단백질의 단편화와 함께 Bcl-2 family의 발현 변화를 통한 mitochondria의 기능 이상과 이로 인한 caspase-9 및 -3의 활성화, 그리고 기질단백질들의 분해가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
- 3A). 이러한 apoptosis 유발정도를 정량적으로 확인하기 위하여 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도를 조사한 결과, WELVR 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 3B). 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의한 HCT116 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 HCT116 인체 대장암세포에서 콩다닥냉이잎 및 뿌리 열수 추출물(WELVL 및 WELVR)이 유발하는 항암효과 및 항암기전을 조사하였다. 이를 위하여 WELVL 및 WELVR이 함유된 배지에서 48시간 동안 배양된 암세포들을 대상으로 증식억제 정도를 조사한 결과, 정상배지에서 자란 암세포와 비교해서 WELVL 및 WELVR의 처리 농도가 증가할수록 증식억제 현상이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1). WELVL 및 WELVR 처리에 따른 증식억제 현상은 처리농도 의존적으로 암세포의 밀도 감소와 더불어 부착력 상실 및 심한 형태적 변형이 유발되었으며, 특히 apoptosis 특징 중 하나로서 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단을 유발함으로써 나타나는 apoptotic body의 현저한 증가가 동반되었다(Fig.
- 7A에서 나타난 바와 같이 caspase-3 및 -8의 경우에는 불활성형 단백질의 발현이 WELVR 처리 농도 의존적으로 감소되었으며, caspase-9의 경우에는 활성형 단백질의 발현이 WELVR 처리에 따라 증가되어, WELVR 처리에 의하여 이들 caspase가 활성화되었을 가능성을 보여주었다. 이를 정량적으로 재확인하기 위하여 in vitro assay를 실시한 결과, Fig. 7B에 나타난 바와 같이 WELVR 처리에 따라 caspase-3, -8 및 -9의 활성이 모두에서 증가하였음을 확인할 수 있었다. 다음으로 활성화된 caspase-3에 의하여 특이하게 분해가 일어나는 몇 가지 기질단백질의 발현에 미치는 WELVR의 영향을 조사하였다.
- 이상의 결과를 살펴볼 때 IAP family의 발현 감소가 caspase의 활성화를 증가시킬 수 있는 역할을 함으로써 WELVR 처리에 의한 apoptosis의 유발에 관여한다는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 살펴보면 WELVR 처리에 따른 HCT116 세포의 apoptosis 유발은 FasL의 발현 증가 및 IAP family의 발현 억제와 연관된 caspase-8의 활성화와 Bcl-2 family의 발현 변화에 의해서 유발된 MMP의 손실에 따른 caspase-9 및 -3의 활성화와 더불어 기질단백질들의 분해가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 8에 나타난 바와 같이 IAP family 중, survivin은 큰 변화가 관찰되지 않았지만 XIAP, cIAP-1 및 cIAP-2의 경우에는 전사와 번역수준 모두에서 WELVR 처리 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 IAP family의 발현 감소가 caspase의 활성화를 증가시킬 수 있는 역할을 함으로써 WELVR 처리에 의한 apoptosis의 유발에 관여한다는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 살펴보면 WELVR 처리에 따른 HCT116 세포의 apoptosis 유발은 FasL의 발현 증가 및 IAP family의 발현 억제와 연관된 caspase-8의 활성화와 Bcl-2 family의 발현 변화에 의해서 유발된 MMP의 손실에 따른 caspase-9 및 -3의 활성화와 더불어 기질단백질들의 분해가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
- 5 mg/mL의 농도에서는 WELVL 및 WELVR 처리군에서 각각 약 70% 및 71%의 정도의 증식억제효과가 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 WELVL 및 WELVR 모두 증식억제효과가 나타났지만, WELVR 처리군이 WELVL 처리군에 비교해서 증식억제효과가 강하게 나타났다.
- 91%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 WELVR에 의한 HCT116 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 연관이 있음을 알 수 있었다.
- 3B). 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의한 HCT116 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있었다. 한편 본 연구에 사용된 WELVR 농도는 동일 실험 조건에서 RAW 264.
- 또한 활성화된 caspase-8에 의한 mitochondria 기능 이상에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bid의 발현도 WELVR 처리에 의하여 감소하는 것으로 조사되었다. 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 최소한 Bcl-2 family가 중요한 역할을 하고 있음을 의미하는 것이며, 특히 Bcl-2 family의 발현 변화에 따른 MMP의 변화와 더불어 apoptosis 유발 관련 효소들의 활성화가 이루어지고 있음을 시사한다.
- 1에서 나타난 바와 같이 WELVL 및 WELVR 모두 처리 농도가 증가함에 따라 암세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 특히 0.25 mg/mL의 농도에서부터 전체적으로 WELVL 처리군보다는 WELVR 처리군에서 암세포의 증식이 강하게 억제되었으며, 1.5 mg/mL의 농도에서는 WELVL 및 WELVR 처리군에서 각각 약 70% 및 71%의 정도의 증식억제효과가 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 WELVL 및 WELVR 모두 증식억제효과가 나타났지만, WELVR 처리군이 WELVL 처리군에 비교해서 증식억제효과가 강하게 나타났다.
- 본 연구의 결과에 의하면 HCT116 세포에 WELVL 및 WELVR을 처리하였을 경우에 유발되는 증식 억제 및 형태 변화는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있었으며, 증식억제 및 apoptosis 유도 효과는 WELVL에 비하여 WELVR에서 높게 나타났다. 특히 WELVR에 의한 apoptosis 유발에는 FasL의 발현 증가를 통한 caspase-8의 활성화와 이로 인한 Bid 단백질의 단편화와 함께 Bcl-2 family의 발현 변화를 통한 mitochondria의 기능 이상과 이로 인한 caspase-9 및 -3의 활성화, 그리고 기질단백질들의 분해가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 또한 IAP family의 발현 감소로 인한 caspase의 활성 증가도 어느 정도 관여하는 것으로 생각되어진다.
- 이상의 결과에서 WELVR 처리에 의한 HCT116 세포의 증식억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있었다. 한편 본 연구에 사용된 WELVR 농도는 동일 실험 조건에서 RAW 264.7 대식세포에서 세포독성을 전혀 나타내지 않았기에(data not shown), WELVR가 정상세포에서 보다는 암세포에서 세포독성 효과가 더 높을 것으로 추정된다.
후속연구
- 또한 IAP family의 발현 감소로 인한 caspase의 활성 증가도 어느 정도 관여하는 것으로 생각되어진다. 따라서 WELVR 처리에 의하여 유발되는 apoptosis는 extrinsic pathway 및 intrinsic pathway를 모두 경유하는 multiple apoptotic pathway에 의하여 조절되는 것으로 생각되며, 이러한 결과들은 인체 암세포에서 콩다닥냉이의 항암작용을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이고 나아가 콩다닥냉이 추출물을 포함한 그와 유사한 항암제 후보물질들의 연구 기초자료로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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