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문제 정의
- 본 연구는 목질 자원 중에서도 당화하기 어려우며, 흔한 자원에 속하는 폐목재를 최소한의 공정으로 당화율을 높일 수 있는 방법을 찾기 위해 수행하였으며, 화학적 처리 없이 약 50%의 당전환율을 얻을 수 있었다. 이는 기존 화학적 전처리 방법만큼의 효율을 보여주는 결과이며, 다른 방법과 병행하여 팝핑법을 사용한다면 적은 효소 투입량으로도 당화율을 높일 수 있을 것이다.
제안 방법
- 공시시료의 전처리 전과 후의 화학적 성분을 알아보기 위해 회분분석, 유기용매 추출물 분석, 리그닌 분석, 홀로셀룰로스 분석을 실시하였다. 회분 함량은 회화로(575 ± 25℃)에서 완전히 회화시켜 구하였고, 알코올-벤젠혼합액(1 : 2, v/v)으로 유기물을 추출하여 유기용매 추출물 함량을 구하였으며, 유기용매로 추출한 후 탈지된 시료로 황산법을 이용하여 클라손 리그닌 함량을 구하고, Wise법을 사용하여 홀로셀룰로스 함량을 구하였다.
- 효소 가수분해 후 당화액의 전체 환원당의 함량은 100 ㎕ 시료를 10배 희석하여 DNS 용액을 섞어 5분간 끓인 후 550 nm에서 측정을 하였다. 그리고 당화액의 단당류는 Refractive index detector가 부착된 HPLC (Rezex RPM Pb2+, phenomenox, USA)로 분석하였다. 용리 용매로는 0.
- 효소 1 Unit는 ㎖당 분당, 1 µmol의 환원당을 생성하는 효소량으로 정의하였다. 그리고 이 단백질의 크기 및 순도를 알아보기 위해 단백질 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하였다.
- 0) 5 ㎖에 전처리 전과 후의 시료를 1% 농도로 넣고 효소를 처리하여 37℃, 진탕배양기에서 반응시켰으며 24, 48, 72 및 96시간 후에 각각 시료를 채취하였다. 또한 최적 투여량을 알아보기 위하여 셀룰레이즈와 자일란네이즈 효소를 단독 또는 혼합 처리하여 72시간 후 시료를 채취하여 당분석을 실시하였다.
- 또한 효소를 혼합해서 처리할 경우 최적의 혼합량을 알아보기 위하여 혼합 농도별 환원당을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과 셀룰레이즈와 자일란네이즈를 각각 30 U씩 넣은 경우 가장 효율이 낮았으며 50 U, 100 U, 200 U씩 넣은 것은 비슷한 결과를 보였다(Fig.
- 본 연구는 폐목재를 리파이너를 이용하여 잘게 분쇄한 후 230℃, 23 kg/cm2 압력 하에서 팝핑기를 이용하여 파쇄 처리 하였다. 이 방법은 기존 논문에서 연구되었던 화학적 처리를 병행하여 수증기 압력 하에서 적정 시간 폭쇄 처리(양과 김, 2001)를 하는 것과는 달리 본 연구실에서 발명한 팝핑기는 수증기 없이 고온, 고압상태에서 급격히 고압을 방출시키는 비교적 간단하게 처리할 수 있는 방법이다.
- 본 연구에서는 폐목재를 리파이너를 이용하여 잘게 분쇄한 후 230°C, 23 ㎏/cm2 압력 하에서 팝핑기를 이용한 처리법을 사용하여 전처리하였다.
- 시료의 효소 가수분해율을 측정하기 위하여 10 mM citrate buffer (pH 5.0) 5 ㎖에 전처리 전과 후의 시료를 1% 농도로 넣고 효소를 처리하여 37℃, 진탕배양기에서 반응시켰으며 24, 48, 72 및 96시간 후에 각각 시료를 채취하였다. 또한 최적 투여량을 알아보기 위하여 셀룰레이즈와 자일란네이즈 효소를 단독 또는 혼합 처리하여 72시간 후 시료를 채취하여 당분석을 실시하였다.
- 압력 하에서 팝핑기를 이용한 처리법을 사용하여 전처리하였다. 이 방법을 이용하여 전처리한 시료에 효소를 처리한 후 당화수율을 비교 분석하였다.
- 이때 FID (flame inonization detector)를 이용하여 검출하였고, DB-225 capillary column (30 m × 0.25 mm I. d., 0.25 µm film thickness, J & W)을 사용하였으며, FID 온도는 250℃, injector 220℃, 컬럼온도는 110에서 220°C까지 10℃/min로 승온하였다.
- 2) 고정액으로 처리한 후 동일 buffer로 세척한 다음 에탄올 농도별 계열 탈수를 실시하였다. 탈수된 시료는 isoamyl acetate로 치환 후 임계점 건조를 실시한 다음 ion sputter로 gold coating하여 주사형 전자현미경(Hitachi S-4000 SEM)을 관찰하였다.
- 팝핑 전처리 전과 후 시료를 효소처리 후 이들 시료에 2% glytaraldehyde + 2% paraformaldehyde (in 0.05 M cacodylate buffer, pH 7.2) 고정액으로 처리한 후 동일 buffer로 세척한 다음 에탄올 농도별 계열 탈수를 실시하였다. 탈수된 시료는 isoamyl acetate로 치환 후 임계점 건조를 실시한 다음 ion sputter로 gold coating하여 주사형 전자현미경(Hitachi S-4000 SEM)을 관찰하였다.
- 팝핑 전처리 전과 후 시료를 효소처리 후 이들 시료의 형태학적 변화와 효소가수분해 정도를 알아보기 위해 주사형 전자현미경을 관찰하였다(Fig 6). 그 결과 전처리 후 섬유소의 결정도가 떨어져서 부피가 팽창하였으며, 섬유소가 표면에 노출되었음을 알 수 있었다.
- 팝핑 전처리에 의한 전처리 효과를 알아보기 위해 팝핑 전과 후의 시료를 각각 효소 처리 후 환원당을 측정하였다. 팝핑 전처리를 한 시료가 전처리하지 않은 시료보다 효소 처리 후 당화효율 약 4배 증가하였으며, 팝핑 전후 시료 모두에서 셀룰레이즈 단독으로 처리한 것보다 혼합하여 처리할 경우 당화율이 증가하였다(Fig.
- 팝핑 처리 전후 50 mg으로 정칭한 시료에 효소 처리한 후 상등액에 효소 가수분해되어 나온 단당류 조성분을 알아보기 위해 HPLC 분석을 하고, 남은 잔사는 증류수를 이용하여 시료에 수용성으로 남은 당을 제거한 후 GC를 사용하여 중성당 분석을 하였다. 그 결과 전처리를 하지 않은 시료의 효소 처리 전과 후 남은 잔사의 글루코스 함량은 19.
대상 데이터
- 공시시료는 40∼60 mesh 분말로 만들어 화학실험에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 공시시료는 전남대학교 목공소에서 사용하고 남은 폐목재 칩을 이용하였다. 폐목재 칩은 리파이너를 이용하여 잘게 분쇄한 후 하룻동안 충분히 물에 적신 후 팝핑기를 사용하여 230°C, 23 ㎏/cm2 압력 하에서 파쇄 처리하였다.
- 본 실험에서 사용된 효소는 산업용 효소인 cellulase (Sigma C8564)와 xylanase (Fluka 95595)를 사용하였다. 이 효소의 특성을 알아보기 위해 Bradford 법을 사용하여 단백질을 정량하였다.
- 0) 500 ㎕와 조효소액 500 ㎕를 혼합하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후 생성된 환원당은 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법(Ghose, 1987) 에 따라 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 셀룰레이즈와 자일란네이즈의 기질로는 CMC (Sigma C5678)와 Xylan (Sigma X4252)을 각각 사용하였다. 효소 1 Unit는 ㎖당 분당, 1 µmol의 환원당을 생성하는 효소량으로 정의하였다.
- 6 ㎖/min의 속도로 물을 흘려주면서 시료 용액 20 ㎕를 주입하여 사용하였다. 표준시료로는 순수한 glucose (sigma G8270), xylose (sigma X1500)을 10 mM 인산 완충용액(pH 5.0)에 녹여 조제하였다. 또한 효소 가수분해 후 남아 있는 잔여물의 중성당 분석은 alditol acetate법 (Wi et al.
이론/모형
- 이 효소의 특성을 알아보기 위해 Bradford 법을 사용하여 단백질을 정량하였다. 각각 효소의 활성을 측정하기 위해서 1% 기질을 포함한 10 mM citrate buffer (pH 5.0) 500 ㎕와 조효소액 500 ㎕를 혼합하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후 생성된 환원당은 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법(Ghose, 1987) 에 따라 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 셀룰레이즈와 자일란네이즈의 기질로는 CMC (Sigma C5678)와 Xylan (Sigma X4252)을 각각 사용하였다.
- 0)에 녹여 조제하였다. 또한 효소 가수분해 후 남아 있는 잔여물의 중성당 분석은 alditol acetate법 (Wi et al., 2009)에 따라 처리한 후 inositol을 내부 표준시료로 하여, gas charomatography (shimazu 2010, Japan)를 이용하여 분석하였다. 이때 FID (flame inonization detector)를 이용하여 검출하였고, DB-225 capillary column (30 m × 0.
- 공시시료는 40∼60 mesh 분말로 만들어 화학실험에 사용하였다. 모든 분석법은 표준분석법에 따라 분석하였다(임산화학실험서, 향문사).
- 본 실험에서 사용된 효소는 산업용 효소인 cellulase (Sigma C8564)와 xylanase (Fluka 95595)를 사용하였다. 이 효소의 특성을 알아보기 위해 Bradford 법을 사용하여 단백질을 정량하였다. 각각 효소의 활성을 측정하기 위해서 1% 기질을 포함한 10 mM citrate buffer (pH 5.
- 회분 함량은 회화로(575 ± 25℃)에서 완전히 회화시켜 구하였고, 알코올-벤젠혼합액(1 : 2, v/v)으로 유기물을 추출하여 유기용매 추출물 함량을 구하였으며, 유기용매로 추출한 후 탈지된 시료로 황산법을 이용하여 클라손 리그닌 함량을 구하고, Wise법을 사용하여 홀로셀룰로스 함량을 구하였다.
성능/효과
- 또한 효소를 혼합해서 처리할 경우 최적의 혼합량을 알아보기 위하여 혼합 농도별 환원당을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과 셀룰레이즈와 자일란네이즈를 각각 30 U씩 넣은 경우 가장 효율이 낮았으며 50 U, 100 U, 200 U씩 넣은 것은 비슷한 결과를 보였다(Fig. 3). 이는 효소를 많이 넣게 되면 반응하는 기질보다 효소의 수가 많으므로 투입되는 효소가 증가하는 만큼 증가되지 않고 50 U씩만 처리되어도 충분한 효과를 볼 수 있는 것으로 보인다.
- 팝핑 전처리 전과 후 시료를 효소처리 후 이들 시료의 형태학적 변화와 효소가수분해 정도를 알아보기 위해 주사형 전자현미경을 관찰하였다(Fig 6). 그 결과 전처리 후 섬유소의 결정도가 떨어져서 부피가 팽창하였으며, 섬유소가 표면에 노출되었음을 알 수 있었다. 그리고 전처리 전 시료에 효소를 처리하였을때 효소가 표면에만 작용하여 표면이 매끄러워졌으며 군데군데에서만 효소 가수분해 양상을 볼 수 있었다.
- 팝핑 처리 전후 50 mg으로 정칭한 시료에 효소 처리한 후 상등액에 효소 가수분해되어 나온 단당류 조성분을 알아보기 위해 HPLC 분석을 하고, 남은 잔사는 증류수를 이용하여 시료에 수용성으로 남은 당을 제거한 후 GC를 사용하여 중성당 분석을 하였다. 그 결과 전처리를 하지 않은 시료의 효소 처리 전과 후 남은 잔사의 글루코스 함량은 19.45와 19.15 mg으로 함량 변화가 거의 없었다. 이는 전처리를 하지 않은 시료는 효소를 이용한 당화가 되지 않음을 보여주었다.
- 이는 효소를 많이 넣게 되면 반응하는 기질보다 효소의 수가 많으므로 투입되는 효소가 증가하는 만큼 증가되지 않고 50 U씩만 처리되어도 충분한 효과를 볼 수 있는 것으로 보인다. 그러므로 50 U씩만 처리하는 것이 가장 효율적으로 나타났다.
- 4). 그리고 글루코스와 자일로스 피크가 주된 피크이므로 이 당화된 수용액으로 발효 실험을 하기에 적합함을 알 수 있었다.
- 이러한 결과는 폐목재에 팝핑 처리를 함으로써 효소 당화율을 높일 수 있음을 보여주었다. 그리고 상등액 분석 결과, 팝핑 전처리하지 않은 시료에 효소를 처리한 경우 글루코스 피크와 자일로스 피크가 낮게 나왔으나, 팝핑 전처리된 시료에 효소를 처리한 경우 그 두 피크 모두 증가됨으로 보아 팝핑 전처리함으로써 당화율이 증가함을 알 수 있었다(Fig. 4). 그리고 글루코스와 자일로스 피크가 주된 피크이므로 이 당화된 수용액으로 발효 실험을 하기에 적합함을 알 수 있었다.
- 그 결과 전처리 후 섬유소의 결정도가 떨어져서 부피가 팽창하였으며, 섬유소가 표면에 노출되었음을 알 수 있었다. 그리고 전처리 전 시료에 효소를 처리하였을때 효소가 표면에만 작용하여 표면이 매끄러워졌으며 군데군데에서만 효소 가수분해 양상을 볼 수 있었다. 그에 비해 전처리 후 효소 처리한 시료에서는 섬유소 사이가 벌어져 있으므로 내부에도 효소가 작용할 수 있었다.
- 197 U/mg이었다(Table 2). 그리고 효소의 순도를 알아보기 위해서 SDS-PAGE를 실시한 결과 셀룰레이즈의 경우 비교적 하나의 밴드가 진하게 보였고, 자일란네이즈는 셀룰레이즈와 비슷한 곳에서 밴드가 보였고 비교적 작은 사이즈의 밴드가 보였다(Fig. 1). 이는 셀룰레이즈는 순도가 높아 활성이 높게 측정이 되었으며, 자일란네이즈는 다른 효소가 섞여 있어 활성이 낮게 나온 것으로 보인다.
- 2% 감소하였다(Table 3). 또한 팝핑된 시료에 효소를 처리한 후 글루코스와 자일로스의 당전환율은 각각 약 45.9%와 약 38.7%였다. 이러한 결과는 폐목재에 팝핑 처리를 함으로써 효소 당화율을 높일 수 있음을 보여주었다.
- 본 실험에서 사용된 상용화된 효소의 특성을 분석하기 위하여 활성을 알아 본 결과 셀룰레이즈는 17.22 U/mg이고, 자일란네이즈는 5.197 U/mg이었다(Table 2). 그리고 효소의 순도를 알아보기 위해서 SDS-PAGE를 실시한 결과 셀룰레이즈의 경우 비교적 하나의 밴드가 진하게 보였고, 자일란네이즈는 셀룰레이즈와 비슷한 곳에서 밴드가 보였고 비교적 작은 사이즈의 밴드가 보였다(Fig.
- 또한 기존에 사용되던 전처리 방법에 비해 투입되는 에너지 절감 효과와 화학적 처리를 하지 않고 효소 가수분해 효율을 높일 수 있는 방법이다. 본 연구 결과는 팝핑후 효소 가수분해 효율이 전처리 전보다 4배 정도 증가하였다. 이는 팝핑 처리를 한 후 폐목재의 화학적 결합구조가 끊어져 효소가 셀룰로스에 접근하기 쉽게 변하였기 때문이다.
- 사용된 폐목재의 전처리 전후 성분을 알아보기 위해 화학분석한 결과 홀로셀룰로오스의 경우 65.9%에서 58.76%로 전처리 후 약간의 손실을 보이며, 리그닌은 전처리 전에는 31.5%에서 34.6%로 증가하였고, 알코올-벤젠을 이용한 유기용매 추출물 함량은 전처리 전 1% 보다 4.9%로 증가하였다. 그리고 회분이 전처리하기 전 0.
- 7%였다. 이러한 결과는 폐목재에 팝핑 처리를 함으로써 효소 당화율을 높일 수 있음을 보여주었다. 그리고 상등액 분석 결과, 팝핑 전처리하지 않은 시료에 효소를 처리한 경우 글루코스 피크와 자일로스 피크가 낮게 나왔으나, 팝핑 전처리된 시료에 효소를 처리한 경우 그 두 피크 모두 증가됨으로 보아 팝핑 전처리함으로써 당화율이 증가함을 알 수 있었다(Fig.
- 이는 전처리를 하지 않은 시료는 효소를 이용한 당화가 되지 않음을 보여주었다. 이에 비해 팝핑 전처리를 한 시료의 효소 처리 전과 후 글루코스 함량은 18.00과 10.35 mg으로 약 57.5% 감소하였고, 자일로스 함량도 5.30에서 3.40 mg으로 약 64.2% 감소하였다(Table 3). 또한 팝핑된 시료에 효소를 처리한 후 글루코스와 자일로스의 당전환율은 각각 약 45.
- 팝핑 전처리에 의한 전처리 효과를 알아보기 위해 팝핑 전과 후의 시료를 각각 효소 처리 후 환원당을 측정하였다. 팝핑 전처리를 한 시료가 전처리하지 않은 시료보다 효소 처리 후 당화효율 약 4배 증가하였으며, 팝핑 전후 시료 모두에서 셀룰레이즈 단독으로 처리한 것보다 혼합하여 처리할 경우 당화율이 증가하였다(Fig. 2).
후속연구
- 본 연구는 목질 자원 중에서도 당화하기 어려우며, 흔한 자원에 속하는 폐목재를 최소한의 공정으로 당화율을 높일 수 있는 방법을 찾기 위해 수행하였으며, 화학적 처리 없이 약 50%의 당전환율을 얻을 수 있었다. 이는 기존 화학적 전처리 방법만큼의 효율을 보여주는 결과이며, 다른 방법과 병행하여 팝핑법을 사용한다면 적은 효소 투입량으로도 당화율을 높일 수 있을 것이다. 이에 대한 경제성 분석도 앞으로 이루어져야 할 것이다.
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