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문제 정의
- 기존의 보고와 연관지어, 본 연구에서는 ERα 촉진제인 PPT를 장기간 농도별로 투여함으로써 PPT가 정소, 수출소관, 부정소에 미치는 생리학적이고 형태학적인 기초 자료를 제공 하고자 한다.
제안 방법
- 관류희생 시킨 생쥐를 해부하고 필요한 기관을 적출하였다. 기관의 무게를 측정하기 위해 붙어 있던 지방조직을 최대한 제거하고, 이어서 각각의 기관을 여과지에 올려 물기를 제거한 다음 1개의 정소, 수출소관, 부정소 무게를 측정하였다.
- 관류희생 시킨 생쥐를 해부하고 필요한 기관을 적출하였다. 기관의 무게를 측정하기 위해 붙어 있던 지방조직을 최대한 제거하고, 이어서 각각의 기관을 여과지에 올려 물기를 제거한 다음 1개의 정소, 수출소관, 부정소 무게를 측정하였다. 적출한 기관 및 부정소에 붙어 있던 지방조직을 조직 표본으로 이용 할 때까지 관류용액과 동일한 4°C의 고정액에 보관 하였다.
- 처리군은 Tocris 회사의 PPT (4,4′,4′′-(4-propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl)tris-pheol)를 농도에 따라 4군으로 나누었다. 농도별 4군의 경우, PPT를 0.01 mg, 0.1 mg, 1.0 mg 그리고 4.0 mg을 각각 castor oil 0.3 mL에 vortex로 희석한 다음 매주 1회씩 PPT 농도군 별로 등쪽 목덜미에 8주 동안 피하주사 하였다. 대조군의 경우 0.
- 3 mL에 vortex로 희석한 다음 매주 1회씩 PPT 농도군 별로 등쪽 목덜미에 8주 동안 피하주사 하였다. 대조군의 경우 0.3 mL의 castor oil만을 매주 1회씩 8주 동안 피하주사 하였다.
- 마이크로톰을 이용하여 2.5 μm 두께의 절편을 만들었다.
- 1 mL를 주입하여 마취 시켰다. 마취시킨 생쥐의 체중을 측정하였다. 그 후 0.
- 5 mg이었다. 본 실험에서는 수컷 생쥐의 농도별 PPT영향을 알아보기 위해 저농도 0.01 mg부터 고농도 4.0 mg을 피하주사 하였다. PPT투여기간은 기존의 방법과(Cho et al.
- 수출소관을 이루는 상피세포 높이 변화를 확인하기 위해 비섬모세포(nonciliated cell)의 기저막에서부터 솔가장자리(brush border)까지 높이를 역시 30회 측정하였다. 부정소의 머리 부분인 initial segment와 caput의 상피세포 높이를 한 부정소마다 30회 측정하였다. 정자의 농도변화를 확인하기 위해 부정소의 꼬리부분의 면적 2,500 μm2에 있는 정자의 두부 수를 30회 측정하였다.
- 성체 수컷 생쥐를 무작위로 대조군과 PPT 농도별 처리군으로 지정하였다. 처리군은 Tocris 회사의 PPT (4,4′,4′′-(4-propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl)tris-pheol)를 농도에 따라 4군으로 나누었다.
- 수출소관의 변화를 확인하기 위해, 내강의 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 부정소마다 30회 측정하였다. 수출소관을 이루는 상피세포 높이 변화를 확인하기 위해 비섬모세포(nonciliated cell)의 기저막에서부터 솔가장자리(brush border)까지 높이를 역시 30회 측정하였다. 부정소의 머리 부분인 initial segment와 caput의 상피세포 높이를 한 부정소마다 30회 측정하였다.
- 정소 세정관의 직경은 가운데를 중심으로 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 마리마다 30회 측정하였고, 정소를 둘러싸고 있는 백막(tunica albuginea)의 두께 역시 한 정소마다 30회 측정하였다.수출소관의 변화를 확인하기 위해, 내강의 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 부정소마다 30회 측정하였다. 수출소관을 이루는 상피세포 높이 변화를 확인하기 위해 비섬모세포(nonciliated cell)의 기저막에서부터 솔가장자리(brush border)까지 높이를 역시 30회 측정하였다.
- 실험동물은 10주령 된 평균체중 22 g의 수컷 생쥐 C57BL/6를 (주)오리엔트 바이오 회사로부터 구입하여 사용하였다. 실험기간 동안 고형사료와 물을 무제한으로 공급하였다. 사육실은 22±2°C와 상대습도 50±5%를 유지 하였으며 조명시간은 12시간을 주기로 하였다.
- 염색한 프레파라트를 현미경으로 관찰하고 현미경(Olympus BX50)에 설치된 SPOT Camera (Diagnostic Instruments 사의 Model No. 11.2 Color Mosaic)를 이용하여 조직을 저 배율에서 고배율로 촬영한 다음 Video Test Image Analysis System을 이용하여 다음과 같은 방법으로 각 기관을 측정하였다.정소 세정관의 직경은 가운데를 중심으로 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 마리마다 30회 측정하였고, 정소를 둘러싸고 있는 백막(tunica albuginea)의 두께 역시 한 정소마다 30회 측정하였다.
- 절편을 만들기 위해, 조직을 0.01M phosphate buffer (pH 7.4)로 세척하고 vaccum을 이용하여 4°C의 70% (2회), 80% (1회), 95% (2회), 100% (3회) ethanol에 1시간 간격으로 탈수 시킨 후 infiltration solution에 24시간 동안 4회의 처리 과정을 거친 다음 glycol methacrylate에 포매하였다.
- 2 Color Mosaic)를 이용하여 조직을 저 배율에서 고배율로 촬영한 다음 Video Test Image Analysis System을 이용하여 다음과 같은 방법으로 각 기관을 측정하였다.정소 세정관의 직경은 가운데를 중심으로 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 마리마다 30회 측정하였고, 정소를 둘러싸고 있는 백막(tunica albuginea)의 두께 역시 한 정소마다 30회 측정하였다.수출소관의 변화를 확인하기 위해, 내강의 가장 짧은 직경, 즉 단경을 한 부정소마다 30회 측정하였다.
- 정자의 농도변화를 확인하기 위해 부정소의 꼬리부분의 면적 2,500 μm2에 있는 정자의 두부 수를 30회 측정하였다.
- 대조군과 처리군의 생쥐는 투여 후 8주째에 생쥐를 관류시켜 희생 하였다. 즉, 8주째 대조군 4마리, PPT 0.01 mg 처리군 4마리, 0.1 mg 처리군 4마리, 1 mg 처리군 4마리, 4 mg 처리군 4마리로 도합 20 마리의 생쥐를 관류희생 하였다. 관류희생 할 때 생쥐 한 마리마다 헤파린(heparin) 0.
- 정자의 농도변화를 확인하기 위해 부정소의 꼬리부분의 면적 2,500 μm2에 있는 정자의 두부 수를 30회 측정하였다. 지방조직의 변화를 알기 위해, 부정소에 붙어 있던 지방세포 30개의 면적을 측정하였다. 실험 결과의 통계학적 분석은 ANOVA Test를 이용하여 P value 0.
- 처리군은 Tocris 회사의 PPT (4,4′,4′′-(4-propyl-[1H]-pyrazole-1,3,5-triyl)tris-pheol)를 농도에 따라 4군으로 나누었다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 PPT는 처음으로 보고된, 그리고 특이 적으로 ER에 친화성을 가진 SERM의 한 종류로 ERβ보다 주로 ERα에 작용하는 촉진제이고 ERα에 대하여 estradiol 보다 높은 친화성을 가지고 있다(Stauffer et al., 2000).
- 본 실험에서 사용한 SERM의 한 종류인 PPT (propyl pyrazole triol)는 ER 촉진제로서 ERβ보다 ERα와 410배 혹은 1,000배 높은 친화성으로 결합하는 것으로 알려져 있다 (Stauffer et al., 2000; Sun et al., 2002).
- 실험동물은 10주령 된 평균체중 22 g의 수컷 생쥐 C57BL/6를 (주)오리엔트 바이오 회사로부터 구입하여 사용하였다. 실험기간 동안 고형사료와 물을 무제한으로 공급하였다.
데이터처리
- 지방조직의 변화를 알기 위해, 부정소에 붙어 있던 지방세포 30개의 면적을 측정하였다. 실험 결과의 통계학적 분석은 ANOVA Test를 이용하여 P value 0.05 미만을 의미 있는 것으로 판별하였다.
성능/효과
- 4). Initial segment부위에 특징적으로 나타나는 상피세포의 부동모(stereocilia) 높이가 감소되었고, PPT 4 mg 투여군의 경우 부동모가 거의 위축되어 소실되었다(Fig. 4C).
- SERM의 한 종류인 ERα 촉진제 PPT를 8주 동안 투여하여 수컷 생쥐의 체중을 확인한 결과 대조군과 PPT 0.01 mg, 0.1 mg 처리군의 차이가 보이지 않았으나, 고농도 PPT 4 mg 처리군의 경우 투여기간이 길어질수록 대조군에 비해 유의하게 감소되었다.
- 결론적으로, 본 연구에서 ERα 촉진제인 PPT를 장기간 투여하여 농도 별로 수컷 생쥐 생식기관을 현미경으로 관찰한 결과, 저농도의 PPT 처리군에서는 정자형성이 일어나고 생식기능이 정상적인 반면에, 4 mg과 같은 고농도의 PPT 처리군에서는 정자를 형성하는 세포들의 퇴화와 수출소관의 재흡수 이상으로 내강이 팽창되었다.
- 3). 대조군의 경우 주변의 평활근이 얇고, 상피세포 위쪽에 미세섬모가 존재하며, 상피세포의 핵 위쪽 세포질에 있는 vesicle이 잘 관찰되었지만, PPT의 농도가 높아짐에 따라 수출소관의 내강이 증가하였고 상대적으로 상피세포의 높이는 감소되었다(Fig. 3B, C). 또한 처리군의 상피세포의 세포질 내 vesicle이 감소하거나 소실되었다.
- 결론적으로, 본 연구에서 ERα 촉진제인 PPT를 장기간 투여하여 농도 별로 수컷 생쥐 생식기관을 현미경으로 관찰한 결과, 저농도의 PPT 처리군에서는 정자형성이 일어나고 생식기능이 정상적인 반면에, 4 mg과 같은 고농도의 PPT 처리군에서는 정자를 형성하는 세포들의 퇴화와 수출소관의 재흡수 이상으로 내강이 팽창되었다. 또한 처리군의 부정소의 수축과 부정소관을 구성하는 상피세포의 높이가 유의하게 감소되었고, 부정소 꼬리 부위에서는 정자가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 볼 때 고농도의 PPT를 장기간 투여할 경우, 생식기관의 조직학적 변화로 인해 생식력이 감소되거나 혹은 불임이 유발될 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 PPT를 장기간 투여한 결과 농도가 높아질수록 처리군의 체중이 대조군에 비해 감소되는 경향을 보였으며, PPT 1 mg과 4 mg 투여군에서는 유의하게 감소되었다. 이는 기존에 보고된 것처럼 에스트로겐 물질이 체중감소를 유발하는 것으로 보고된 결과와 유사하다(Cook et al.
- , 2001). 본 실험에서도 PPT에 의해 정소와 부정소가 위축되었는데, 특히 4 mg 농도에서는 이들 생식기관의 무게가 급격하게 감소되었다. 정소의 경우, 세정관 내 생식상피가 PPT의 영향으로 위축되거나 소실되어, 세정관의 직경이 감소됨과 동시에 정소의 무게도 줄어든 것으로 사료된다.
- , 1999). 본 실험에서도 PPT의 농도가 증가할수록 부정소 꼬리 부위에 저장되는 정자의 수가 감소되었으며, 특히 4 mg 투여 시에는 정자가 전혀 관찰되지 않았다. 정소에서도 생식상피가 대부분 소실되어 정자형성이 일어나지 않았다.
- 부정소에 붙어 있던 지방조직을 관찰한 결과 PPT 농도가 증가함에 따라 지방세포의 크기(면적)가 줄어들었다. 일반적으로 에스트로겐은 지방조직을 감소시키는 것으로 알려져 있다.
- 부정소의 initial segment부위 아래에 있는 머리 부분인 caput을 조직학적으로 관찰한 결과, PPT의 농도가 높아짐에 따라 내강에 존재하는 정자두부가 관찰되지 않았으며(Fig. 5), initial segment부위와 마찬가지로 caput을 이루는 상피세포의 높이가 감소 되었다.
- 부정소의 꼬리부분을 조직학적으로 관찰한 결과, PPT 4mg 처리군에서 정자두부가 관찰되지 않았고, 부정소관의 내강이 크게 위축되었다(Fig. 6). 정자의 두부 수를 측정한 결과, 농도 의존적으로 감소되었고, PPT 4 mg 처리군의 경우, 부정소관의 내강에 정자가 축적되지 않았다(Fig.
- 실험기간 중 대조군과 PPT처리군의 부정소의 조직학적 변화를 표로 나타내었다(Table 4). 부정소의 머리 부분인 initial segment부위를 조직학적으로 관찰한 결과, PPT의 농도를 증가시킴에 따라 상피세포의 높이가 감소되었다(Fig. 4). Initial segment부위에 특징적으로 나타나는 상피세포의 부동모(stereocilia) 높이가 감소되었고, PPT 4 mg 투여군의 경우 부동모가 거의 위축되어 소실되었다(Fig.
- 6C). 생식기관 주변 지방조직을 조직학적으로 관찰한 결과(Fig. 7), 지방세포의 크기가 대조군에 비해, PPT의 농도가 고농도로 됨에 따라 점차 감소되었다(Table 5).
- 1). 생식기관을 외부 형태학적으로 관찰한 결과 대조군의 경우 생식기관은 지방조직에 둘러싸여 보호되는 반면, 고농도의 PPT처리군의 경우 지방조직이 축소되어 나타났다. 생식기관의 무게를 측정한 결과 마찬가지로 정소와 부정소의 경우 농도 의존적으로 감소되는 경향을 보였고, 반면에 수출소관의 경우 PPT 4 mg 투여군에서 무게가 유의하게 증가 되었다(Table 1).
- 생식기관을 외부 형태학적으로 관찰한 결과 대조군의 경우 생식기관은 지방조직에 둘러싸여 보호되는 반면, 고농도의 PPT처리군의 경우 지방조직이 축소되어 나타났다. 생식기관의 무게를 측정한 결과 마찬가지로 정소와 부정소의 경우 농도 의존적으로 감소되는 경향을 보였고, 반면에 수출소관의 경우 PPT 4 mg 투여군에서 무게가 유의하게 증가 되었다(Table 1).
- 또한 처리군의 부정소의 수축과 부정소관을 구성하는 상피세포의 높이가 유의하게 감소되었고, 부정소 꼬리 부위에서는 정자가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 볼 때 고농도의 PPT를 장기간 투여할 경우, 생식기관의 조직학적 변화로 인해 생식력이 감소되거나 혹은 불임이 유발될 것으로 사료된다.
- 2). 이를 조직학적으로 관찰한 결과, 세정관의 경우 PPT의 농도를 4 mg처럼 고농도로 투여함에 따라 세정관이 크게 위축되었으며 정자를 형성하는 생식상피세포들이 퇴화하고, 정자형성이 일어나지 않았다(Fig. 2C, F). 정소를 둘러싸고 있는 백막의 경우, 세정관이 위축되는 것과는 다르게 PPT의 농도를 증가시킴에 따라 두께가 증가 되었다.
- 부정소의 경우에도 부정소관을 이루는 상피세포가 위축되었는데 이로 인해 무게가 감소된 것으로 여겨진다. 이에 비해 수출소관의 무게는 변화가 뚜렷하지 않았으며 4 mg 농도에서는 오히려 대조군에 비해 PPT 투여군의 무게가 증가하였다. 이는 수출소관의 내강이 PPT에 의해 팽창되었는데 이로 인한 결과로 보여 진다.
- 6). 정자의 두부 수를 측정한 결과, 농도 의존적으로 감소되었고, PPT 4 mg 처리군의 경우, 부정소관의 내강에 정자가 축적되지 않았다(Fig. 6C). 생식기관 주변 지방조직을 조직학적으로 관찰한 결과(Fig.
- 실험기간 중 대조군과 PPT처리군의 수출소관의 조직학적 변화를 표로 나타내었다(Table 3). 투여군의 경우, 수출소관의 내강의 직경을 측정한 결과 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였고, 상피세포의 높이는 유의하게 감소되는 경향을 보였다(Fig. 3). 대조군의 경우 주변의 평활근이 얇고, 상피세포 위쪽에 미세섬모가 존재하며, 상피세포의 핵 위쪽 세포질에 있는 vesicle이 잘 관찰되었지만, PPT의 농도가 높아짐에 따라 수출소관의 내강이 증가하였고 상대적으로 상피세포의 높이는 감소되었다(Fig.
- 실험기간 중 대조군과 PPT 처리군의 정소의 조직학적 변화를 표로 나타내었다(Table 2). 투여군의 경우, 정자형성을 하는 세정관의 크기를 비교하기 위해 세정관의 단면 직경을 측정한 결과, 세정관의 직경이 PPT 농도 의존적으로 유의하게 감소되었다(Fig. 2). 이를 조직학적으로 관찰한 결과, 세정관의 경우 PPT의 농도를 4 mg처럼 고농도로 투여함에 따라 세정관이 크게 위축되었으며 정자를 형성하는 생식상피세포들이 퇴화하고, 정자형성이 일어나지 않았다(Fig.
후속연구
- 기존의 보고와 연관지어, 본 연구에서는 ERα 촉진제인 PPT를 장기간 농도별로 투여함으로써 PPT가 정소, 수출소관, 부정소에 미치는 생리학적이고 형태학적인 기초 자료를 제공 하고자 한다. 에스트로겐의 농도별 영향을 확인함으로서, 에스트로겐이 수컷 성체 내에서 어떤 다양한 역할을 하고 있는지 그 기능을 규명하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 정소를 둘러싸는 결합조직인 백막은 PPT의 영향으로 그 두께가 증가되었다. 이런 백막의 경우, 정소 내 세정관의 위축 때문에 이차적으로 두께가 증가가 된 것인지 혹은 백막 자체에 ER이 존재하여 PPT의 작용을 직접적으로 받아서 증가한 것인지는 추후 실험을 통해 확인 할 수 있을 것으로 보인다.
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