[논문]Hydrogel의 팽윤-수축 거동에 미치는 Phenylboronic Acid의 영향

이종호; 오한준; 조동환; 한인석

doi:10.17702/jai.2011.12.2.056

문제 정의

그 외에 Shiino 등의 연구보고에서 m-methacrylamidophenylbor-onic acid 를 혼합하여 제조한 입자 형태의 gel 을 이용한 실험에서 직접적으로 glucose 를 사용한 경우가 있었으나, 그 경우에도 부피의 팽창률이 아닌 gel 과 glucose 의 친화적 반응에 의해 입자에 결합되어 있던 인슐린이 방출되는 정도를 측정한 실험이었다 [21]. 그러나 본 연구에서는 생리적인 조건에서 민감하게 부피의 변화를 보이는 hydrogel을 합성하는 데 필요한 HPMA, DMA, TEGDMA 등을 사용하고, GOx나 catalase를 혼합 분산시키지 않기 위하여, 합성PBA를 단량체로 사용함으로써, 간접적이 아닌 방법으로 사용될 GSHs를 합성하였으며, 부피변화에 미치는 glucose의 효과를 조사하였다.
따라서 GSHs 를 합성할 때 GOx 나 catalase 등을 사용한 연구 결과는 많이 보고되고 있으나, 효소를 사용하지 않고 GSHs 를 합성한 연구 결과에 대해서는 거의 보고되고 있지 않다. 따라서 본 연구실에서는 효소들을 사용하지 않고 GSHs 를 제조할 수 있는 새로운 합성 방법의 개발을 시도하였다. 본 연구를 통하여, 효소를 사용하지 않고 합성 PBA 를 이용한 필름 형태의 GSHs 를 합성한다면, 다양한 생체삽입형 센서의 핵심 소재로서의 활용 가능성은 무한할 것으로 사료된다.
본 연구를 통하여, 효소를 사용하지 않고 합성 PBA 를 이용한 필름 형태의 GSHs 를 합성한다면, 다양한 생체삽입형 센서의 핵심 소재로서의 활용 가능성은 무한할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구의 목적은 이를 위하여 glucose 를 인식할 수 있는 특이성을 지닌 PBA 계열의 단량체를 합성한 후 GSHs를 합성하고, 최적의 합성 조건 확립과 반응 조건 등에 따른 GSHs 의팽창률 등 여러 물성에 대하여 조사하는 것이다.
본 연구에서는 GOx 나 catalase 를 사용하지 않고 glucose 에 반응하는 hydrogel 을 합성하기 위하여 PBA 를사용하여 공중합체를 합성하였다. 또한 GSHs를 합성하기 위해 Wang 등의 방법으로 합성한 AAmPBA를 단량체로 사용하고, 생리적 조건에서 부피변화를 민감하게 조절하기 위하여 HPMA : AAmPBA : DMA : TEGDMA 를 70 : 7 : 30 : 2의 몰 비율로 혼합하여 사용했다.

제안 방법

GOx 를 분산시키지 않으면서 glucose 에 의한 부피의 변화를 즉정하기에 용이한 hydrogel 을 phenylboronic acid (PBA) 를 사용하여 합성하였으며, 합성된 hydrogel 의 팽윤-수축 거동에 대한 연구를 수행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
Glucose를 각각 80, 120, 240과 480 mg/dL 농도별로 PBS 완충용액(pH 7.4, 0.15 M NaCl)을 제조하여 사용하였으며, 반응용기에 glucose 용액과 합성한 시료를 넣고 시간별로 측정한 후, 팽윤비 (swelling ratio) 를 계산하여 팽창률로 표현하였다. 팽윤비는 60℃에서 10일간 보관하여 수분을 제거시킨 후 무게를 측정하여, 건조 전 _.
Hydrogel 을 합성하기 위한 반응용기는 유리판을 가로 8 cm X 세로 6 cm 크기로 잘라 사용하였고, 두께를 조절하기 위해 테프론 필름(두께 2.0 mm)을 구입하여 유리 크기에 맞게 ‘ㄷ' 자형으로 잘라 사용하였으며 문구용 클램프를 이용하여 고정시켰다. 그리고 hydrogel 제조 시, GOx 와 catalase 를 사용하여 가장 좋은 팽창률을 나타낸 농도를 기준으로 합성하였다.
15 M이 되도록 용액을 제조하여 사용하였다. 각 pH별 Tris 용액 30 mL에 합성한 hydrogel을 넣은 후, 일정한 pH를 유지하기 위하여 2 h마다 용액을 교체해 주며 부피의 변화를 관찰하였다.
0 mm)을 구입하여 유리 크기에 맞게 ‘ㄷ' 자형으로 잘라 사용하였으며 문구용 클램프를 이용하여 고정시켰다. 그리고 hydrogel 제조 시, GOx 와 catalase 를 사용하여 가장 좋은 팽창률을 나타낸 농도를 기준으로 합성하였다. 또한 반응 개 시제인 APS를 사용하기 전에 HPMA, DMA, AAmPBA 그리고 TEGDMA 를 혼합한 용액은 상온에서 진공 펌프를 사용하여 용액 내에 존재하는 산소 등 중합반응의 방해 가능성이 있는 요인을 제거시켰다.
GSHs라 일컫는 hydrogele GOx에 의해 glucose가 이 uconic acid 로 변할 때, 고분자 내의 pH가 변하게 되고, 산성도의 증가에 의한 부피가 변화되는 특성을 나타내므로, GSHs 재료 특성상 pKa 값이나 소수성 작용기들의 종류에 따라 수축과 팽창의 양상이 달라지기 된다. 따라서 GSHs 제조 시poly(alkylacrylate), poly(alkyl methacrylate) 등 여러 단량체들의 조합과 농도를 바꿔가면서 다양한 방법으로 합성한 후, 팽창률과의 상관관계를 조사하였다. GSHs 팽창에 관한 특성 실험은 많은 연구논문[2, 3, 14]에 의해 보고되고 있다.
공중합체를 합성하였다. 또한 GSHs를 합성하기 위해 Wang 등의 방법으로 합성한 AAmPBA를 단량체로 사용하고, 생리적 조건에서 부피변화를 민감하게 조절하기 위하여 HPMA : AAmPBA : DMA : TEGDMA 를 70 : 7 : 30 : 2의 몰 비율로 혼합하여 사용했다. GSHs라 일컫는 hydrogele GOx에 의해 glucose가 이 uconic acid 로 변할 때, 고분자 내의 pH가 변하게 되고, 산성도의 증가에 의한 부피가 변화되는 특성을 나타내므로, GSHs 재료 특성상 pKa 값이나 소수성 작용기들의 종류에 따라 수축과 팽창의 양상이 달라지기 된다.
그리고 hydrogel 제조 시, GOx 와 catalase 를 사용하여 가장 좋은 팽창률을 나타낸 농도를 기준으로 합성하였다. 또한 반응 개 시제인 APS를 사용하기 전에 HPMA, DMA, AAmPBA 그리고 TEGDMA 를 혼합한 용액은 상온에서 진공 펌프를 사용하여 용액 내에 존재하는 산소 등 중합반응의 방해 가능성이 있는 요인을 제거시켰다. 또한 APS 용액은 반응 직전에 제조하여 사용하였으며, APS 용액과 EG, TEMED 용액을 넣은 직후, 반응 용기에 주입하여 반응온도에 따라 20 h 동안 반응시켰다.
15 M NaCl)을 각 pH별로 제조하여 pH에 따른 부피의 변화를 측정하였다. 또한 삼투압의 발생에 의한 부피 변화를 고찰해보기 위해 합성된 hydrogel을 50 mM Tris 완충용액 (pH 10.0, 0.15 M NaCl) 에 24 h 상온에서 침지한 후, 동일 농도의 Tris 용액을 HCl 을 사용하여 pH 5.0, 6.0, 7.0, 7.4, 8.0, 9.0, 10.0으로 pH를 조절하고, 최종 NaCl 농도가 0.15 M이 되도록 용액을 제조하여 사용하였다. 각 pH별 Tris 용액 30 mL에 합성한 hydrogel을 넣은 후, 일정한 pH를 유지하기 위하여 2 h마다 용액을 교체해 주며 부피의 변화를 관찰하였다.
합성된 hydrogel을 0.15 M NaCl 용액으로 48 h 세척한 후 동일한 크기로 재단하여, 50 mM Tris 완충용액 (0.15 M NaCl)을 각 pH별로 제조하여 pH에 따른 부피의 변화를 측정하였다. 또한 삼투압의 발생에 의한 부피 변화를 고찰해보기 위해 합성된 hydrogel을 50 mM Tris 완충용액 (pH 10.
합성한 hydrogel을 50 mM Tris 완충용액(pH 7.4, 0.15 M NaCl) 으로 24 h 동안 세척한 후, 농도별로 제조된 NaCl 용액에 넣고 시간별 부피의 변화를 측정하였다. 무기 이온이 없는 Tris 완충용액에 넣은 hydrogele 급격한 부피의 팽창이 진행되어 1 h이 지난 후, 약 326%의 팽창률을 보였지만, 생리적 조건인 0.

대상 데이터

Hydroxypropyl methacrylate (HPMA, Aldrich) 와 (N, N-dimethylamino)ethyl methacrylate (DMA, Aldrich)는 중합반응 전에 진공증류 과정을 거쳐 사용하였다. Tetraethylene glycol dimethacrylata (TEGDMA, Aldrich), ethylene glycol (EG, Sigma), ammoniumpersulfate (APS, ALdrich), hydroxyethyl methacrylate (HEMA, Sigma), acrylamide (sigma), phenylboronic acid (PBA, Aldrich), aminophenylboronic acid (Aldrich), glucose oxidase (Sigma), Tris-HCl (Sigma) 와 phosphate buffer saline (Sigma)는 분석용 시약을 구입하여사용하였다.
Tetraethylene glycol dimethacrylata (TEGDMA, Aldrich), ethylene glycol (EG, Sigma), ammoniumpersulfate (APS, ALdrich), hydroxyethyl methacrylate (HEMA, Sigma), acrylamide (sigma), phenylboronic acid (PBA, Aldrich), aminophenylboronic acid (Aldrich), glucose oxidase (Sigma), Tris-HCl (Sigma) 와 phosphate buffer saline (Sigma)는 분석용 시약을 구입하여사용하였다. Acrylamidophenylboronic acid (AAmPBA) 는 Wang 등의 방법을 사용하여 합성하였다 [22].
또한 APS 용액은 반응 직전에 제조하여 사용하였으며, APS 용액과 EG, TEMED 용액을 넣은 직후, 반응 용기에 주입하여 반응온도에 따라 20 h 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 GSHs는 가로1 cm X 세로 1 cm X 두께 2.0 mm 크기의 긴 면도 날을 사용하여 재단하였다. 모든 합성 hydrogel 은잔 유물을 제거하기 위해 PBS 완충용액(pH 7.

이론/모형

Tetraethylene glycol dimethacrylata (TEGDMA, Aldrich), ethylene glycol (EG, Sigma), ammoniumpersulfate (APS, ALdrich), hydroxyethyl methacrylate (HEMA, Sigma), acrylamide (sigma), phenylboronic acid (PBA, Aldrich), aminophenylboronic acid (Aldrich), glucose oxidase (Sigma), Tris-HCl (Sigma) 와 phosphate buffer saline (Sigma)는 분석용 시약을 구입하여사용하였다. Acrylamidophenylboronic acid (AAmPBA) 는 Wang 등의 방법을 사용하여 합성하였다 [22].

성능/효과

1) HPMA : DMA : TEGDMA : AAmPBA를 70 : 30 : 2 : 7의 몰 비율로 혼합하여 공중합체 hydrogel을 합성하였으며, 합성된 hydrogele glucose에 의해 부피가 팽창하는 것으로 확인되었다.
2) 합성된 hydrogele 생리적 조건인 pH 7.4를 기준으로 급격한 부피변화의 변동성이 크게 나타남을 알 수 있었다.
3) 합성된 hydrogel 은 생리적 조건인 0.15 M NaCl 농도 전과 후에서는 부피의 변화 형태가 안정적으로 나타남을 알 수 있었다.
4에서는 각각 21와 44%까지 부피가 팽창되었다. 그러나 생리적 조건과 같은 pH 7.0과 산성 용액에서는 급격히 부피가 팽창하는 결과에 근거할 때, 생체 내에서 부피의 팽창이 진행되는 원리를 이용한 삽입형 바이오센서로서의 사용 가능성을 확인할 수 있었다.
따른 팽창률의 변화를 나타낸 것이다. 그림에서 알 수 있듯이, PBS 완충용액 (pH 7.4, 0.15 M NaCl) 에서 충분히 세척한 같은 크기의 hydrogel을 각 pH 용액에 넣고 부피의 변화를 관찰한 결과, pH 10.0 과 pH 9.0 용액에서는 3 h 이후부터 부피의 감소가 일어나 각각 최대 64와 51%까지 부피가 수축되었음을 알 수 있었으며, pH 8.0 과 pH 7.4에서는 각각 21와 44%까지 부피가 팽창되었다. 그러나 생리적 조건과 같은 pH 7.
15 M NaCl) 으로 24 h 동안 세척한 후, 농도별로 제조된 NaCl 용액에 넣고 시간별 부피의 변화를 측정하였다. 무기 이온이 없는 Tris 완충용액에 넣은 hydrogele 급격한 부피의 팽창이 진행되어 1 h이 지난 후, 약 326%의 팽창률을 보였지만, 생리적 조건인 0.15 M NaCl 용액보다 묽은 0.05 M과 0.1 M NaCl 용액에서 각각 44와 21%의 부피 팽창을 보였고, 진한 용액인 0.3과 0.5 M 조건에서는 부피가 각각 19% 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 현상이 나타나는 이유는, 존재하는 이온 농도에 따라 삼투압이 발생하게 되고, 부피의 변화는 주로 hydrogel 과 주변 용액에 존재하는 이온과의 공유영역에서의 평형이 깨지게 될 때 발생하는 삼투압에 의해 조절되기 때문으로 사료된다.
이것으로부터 glucose와의 결합이 가역적 반응을 한다는 사실도 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험 결과에서 PBA 와 공중합체는 상당히 안정한 공유결합을 형성화고 있으며 우수한 재현성이 있는 것으로 나타났다. Fang 등이 예측한 glucose와 PBA와의 가수분해 반응이 진행되어 boronic acid diester가 형성되면서 부피의 팽창을 야기시키고 있다는 결과와도 일치함을 확인할 수 있었다 [19].
다만 glucose 에 반응하는 시간이 느린 것과 낮은 glucose 농도에서는 부피 변화가 작은 결과에 대해서는 좀 더 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 하지만 궁극적으로 생체재료로서 활용 측면에서는 효소를 분산시키지 않으면서도, HPMA : DMA : TEGDMA : AAmPBA의 몰 비율이 70 : 30 : 2 : 7의 조건에서도 최대 팽창률이 약 44%로 나타난 것으로 보아, 생체 삽입 후의 사용기간을 현저하게 증가시킬 수 있다는 장점을 가진 재료로서의 가능성은 확인할 수 있었다.
합성된 hydrogel을 glucose 용액에 침지시켜, 각 시료별 부피의 팽창률을 조사해 본 결과, glucose 용액 120 mg/dL 농도에서 13.78%의 부피가 팽창되었으며, 240 mg/dL와 480 mg/dL 농도의 경우, 각각 20.89와 43.78% 부피가 팽창되는 것으로 나타났다. 또한 팽창되었던 hydrogel 을 PBS 완충용액으로 다시 세척했을 경우 원래의 크기로 환원되었다.

후속연구

Fang 등이 예측한 glucose와 PBA와의 가수분해 반응이 진행되어 boronic acid diester가 형성되면서 부피의 팽창을 야기시키고 있다는 결과와도 일치함을 확인할 수 있었다 [19].다만 glucose 에 반응하는 시간이 느린 것과 낮은 glucose 농도에서는 부피 변화가 작은 결과에 대해서는 좀 더 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 하지만 궁극적으로 생체재료로서 활용 측면에서는 효소를 분산시키지 않으면서도, HPMA : DMA : TEGDMA : AAmPBA의 몰 비율이 70 : 30 : 2 : 7의 조건에서도 최대 팽창률이 약 44%로 나타난 것으로 보아, 생체 삽입 후의 사용기간을 현저하게 증가시킬 수 있다는 장점을 가진 재료로서의 가능성은 확인할 수 있었다.
[20].본 실험에서도 PBA 가결합된 형태의 hydrogel이지만 pH 9부터 부피의 팽창이 진행되어 pH 7.4에서 부피 변화의 변이 상태가 되며, 그 이후 산성환경에서 급격한 팽창이 진행되는 사실을 확인함으로써, 생체 내에 삽입하여 pH 변화에 따른 부피의 변화를 관찰하는 바이오센 서 재료로서의 응용 가능성을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 I.
4에서 부피 변화의 변이 상태가 되며, 그 이후 산성환경에서 급격한 팽창이 진행되는 사실을 확인함으로써, 생체 내에 삽입하여 pH 변화에 따른 부피의 변화를 관찰하는 바이오센 서 재료로서의 응용 가능성을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과는 I. S. Han 등 연구[20] 에서 GOx 를 분산시킨 GSHs 의 경우와 거의 유사한 형태의 팽창률이 나타난 것으로 보아, 기본적인 구조의 형태는 유사하면서도 효소를 사용하여 glucose 의 농도에 따라 변화되는 pH 의존성 부피 변화 측정 방법 보다는, glucose의 양에 따라 팽창되는 보다 더 진보된 GSHs 로서의 응용 가능성을 제시해주고 있다.
따라서 본 연구실에서는 효소들을 사용하지 않고 GSHs 를 제조할 수 있는 새로운 합성 방법의 개발을 시도하였다. 본 연구를 통하여, 효소를 사용하지 않고 합성 PBA 를 이용한 필름 형태의 GSHs 를 합성한다면, 다양한 생체삽입형 센서의 핵심 소재로서의 활용 가능성은 무한할 것으로 사료된다. 따라서 본 연구의 목적은 이를 위하여 glucose 를 인식할 수 있는 특이성을 지닌 PBA 계열의 단량체를 합성한 후 GSHs를 합성하고, 최적의 합성 조건 확립과 반응 조건 등에 따른 GSHs 의팽창률 등 여러 물성에 대하여 조사하는 것이다.

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