[논문]BMP4 처리에 의한 인간 배아줄기세포 유래 KDR 양성 중배엽성 세포군의 분화 양상 조사

김정모; 손온주; 조윤정; 이재호; 정형민

BMP4 처리에 의한 인간 배아줄기세포 유래 KDR 양성 중배엽성 세포군의 분화 양상 조사
Identification and Characterization of a KDR-positive Mesoderm Population Derived from Human Embryonic Stem Cells Post BMP4 Treatment 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.35 no.1, 2011년, pp.9 - 15

김정모 (차의과학대학 의생명과학대학원 줄기세포 연구실) , 손온주 (차의과학대학 의생명과학대학원 줄기세포 연구실) , 조윤정 (차의과학대학 의생명과학대학원 줄기세포 연구실) , 이재호 (차바이오앤디오스텍) , 정형민 (차의과학대학 의생명과학대학원 줄기세포 연구실)

Abstract ▼ AI-Helper

The functional cardiovascular system is comprised of distinct mesoderm-derived lineages including endothelial cells, vascular smooth muscle cells and other mesenchymal cells. Recent studies in the human embryonic stem cell differentiation model have provided evidence indicating that these cell lineages are developed from the common progenitors such as hemangioblasts and cardiovascular progenitor cells. Also, the studies have suggested that these progenitors have a common primordial progenitor, which expresses KDR (human Flk-1, also known as VEGFR2, CD309). We demonstrate here that sustained activation of BMP4 (bone morphogenetic protein 4) in hESC line, CHA15 hESC results in $KDR^+$ mesoderm specific differentiation. To determine whether the $KDR^+$ population derived from hESCs enhances potential to differentiate along multipotential mesodermal lineages than undifferentiated hESCs, we analyzed the development of the mesodermal cell types in human embryonic stem cell differentiation cultures. In embryoid body (EB) differentiation culture conditions, we identified an increased expression of $KDR^+$ population from BMP4-stimulated hESC-derived EBs. After induction with additional growth factors, the $KDR^+$ population sorted from hESCs-derived EBs displays mesenchymal, endothelial and vascular smooth muscle potential in matrix-coated monolayer culture systems. The populations plated in monolayer cultures expressed increased levels of related markers and exhibit a stable/homologous phenotype in culture terms. In conclusion, we demonstrate that the $KDR^+$ population is stably isolated from CHA15 hESC-derived EBs using BMP4 and growth factors, and sorted $KDR^+$ population can be utilized to generate multipotential mesodermal progenitors in vitro, which can be further differentiated into cardiovascular specific cells.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한' BMP4 성장인자에 의해 증가된 KDR 양성 세포 군집이 심혈관계 세포로의 분화에 있어 공통 전구세포로의 가능성을 타진하기 위해 유세포분리기를 이용하여 KDR 양성 세포군집을 분리하고, 성장인자 및 기질을 포함하는 추가적인 분화 조건을 적용하여 심혈관 구성 세포로의 분화를 유도하고, 세포 특이 표지인자들의 면역염색법으로 분석하여, 유도된 세포들의 특성을 확인하고, BMP4 성장인자에 의해 증가된 KDR 표지인자가 인간 배아줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화에 있어 관문이 됨을 확인하고자 한다.
이에 본 연구에서는, 미분화 인간 배아줄기세포(Fig. 2) 유래 배상체에 잠재적인 중배엽 유도물질로 알려진 BMP4 성장인자를 처리하여 KDR의 발현 양상을 조사하였다. 배아줄기세포에서 중배엽으로의 초기 분화에 있어 KDRe 두 단계의 발현 정점을 가진다(Goldman 등, 2009).

제안 방법

6일간 배양한 인간 배아줄기세포의 미분화 상태를 확인하기 위해 40x 위상차 현미경 하에서 콜로니를 형성하며 자라는 세포의 형태를 관찰하였으며(Fig. 2A), CHA15 인간 배아줄기세포에서 미분화 마커인 알칼라인 포스파테이즈(AP)의 발현을 40x 위상차 현미경 하에서 확인하였다(Fig. 2B). 또한, 유세포분석기를 이용하여 미분화 세포의 대표적인 마커인 TRA-1-60/SSEA-4의 이 중 양성 발현(99% 이상)을 확인하였고(Fig.
BMP4 성장인자 처리를 통한 중배엽성 세포로의 분화유도 후 KDR의 발현이 가장 높은 것으로 나타나는 6일째의 배상체를 유세포분리기를 이용하여 KDR/CD133 이중 양성세포(61.24%±3.43중 Fig. 4A의 우상단 작은 상자 내 ~40%)만을 분리하였으며, 이후 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하였다. 유세포분리기를 이용하여 분리한 KDR/ CD133 이 중 양성세포를 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하여 그 특성을 규명하였다(Fig.
BMP4 성장인자에 의한 KDR 발현 양상 변화를 확인하고자, 6일간 배양한 인간 배아줄기세포에서 얻어진 배상 체에 BMP4 성장인자를 10 ng/ml의 농도로 처리하여 유세포 분석을 실시하였고(Fig. 3A와 B). 그 결과 BMP4 성장인자를 처리하지 않은 실험군의 경우 KDR 발현 증감은 보여졌으나, 경향성은 보여주지 못했다.
BMP4 성장인자에 의해 분화 유도된 유사 중간엽 줄기세포에서 발현되는 중간엽 줄기세포 특이적 항체와 유사 평활근 세포에서 발현되는 평활근 세포 특이적 항체를 관찰하기 위해 세포를 4% 파라포름알데히드로 15분간 상온에서 고정시킨 후, 0.03% Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) 이 포함된 PBS(Invitrogen)로 세 번 세척하였다. 이어서, 5% BSA(Bovine Serum Albumin)을 첨가하여 한 시간 동안 블로킹한 후, 일차 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였으며, PBS로 세 번 세척한 후, 이차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS로 세 번 세적 하였다.
Calpordn (BD Bioscience) 또는 Smooth mu- sde-myosin heavy chain (SM-MHC, BD Bioscience), al- pha-Smooth muscle actin( a -SMA, BD Bioscience) 으로 평활근 세포를 염색하였으며, DAPI를 처리하여 핵을 염색시킨 후, LSM 510 META 공초점 현미경 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
KDR/PDGFR a 이 중 양성세 포(57.43%±2.17중 Fig. 5A의 우상단 작은 상자내 ~35%)만을 분리하여, 이후 유사 중간엽 줄기세포와 유사 평활근 세포로 분화를 유도하였다. KDR/PDGFRa 이 중 양성세포를 분리하여 유사 중간엽줄기세포로 분화 유도하였다(Fig.
5A의 우상단 작은 상자내 ~35%)만을 분리하여, 이후 유사 중간엽 줄기세포와 유사 평활근 세포로 분화를 유도하였다. KDR/PDGFRa 이 중 양성세포를 분리하여 유사 중간엽줄기세포로 분화 유도하였다(Fig. 5B, C와 D). 이는 위상차 현미경 하에서 중간엽 줄기세포 형태와 유사하게 관찰되었으며 (Fig.
간략히 기술하면, 4일 동안 유지배양된 인간 배아줄기세포를 시트릿트 솔루션과 아세톤, 37% 포르말데하이드를 이용하여 2분 동안 고정을 시키고, dPBS로 세척을 해준 뒤 소디움 니트레이트와 FRL-알칼라인 솔루션을 1:1 로 섞어 2분 동안 반응을 시키고, 일차증류수에 넣어 반응을 멈주게 한 다음 napthol AS-B1 솔루션을 넣은 뒤이 용액을 준비한 세포와 15분 동안 반응시킨다. 그 후 dPBS로 세척을 해준 뒤 위상차 현미경으로 관찰하였다.
, Walkerville, MD, USA) 배양액으로 이틀에 한번 교체해 주었으며, 14일 동안 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하였다. 그리고 KDR/PDGFRa 이 중 양성세포 blO, 개를 collagen (Stem Cell Technology, USA)으로 코팅된 배양접시에 놓은 후 50 ng/ml PDGF-BB(Peprotech) 성장인자가 첨가된 EGM-2MV 배양액으로 이틀에 한번 교체하여 10일 동안 유사 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하였으며, KDR/PDGFRa 이 중 양성세포를 동일한 양으로 gelatin으로 코팅된 배양접시에 5% FBS (Terracell)가 함유된 DMEM 고농도글루코오스 배양액 (Invitrogen)으로이틀에 한번 교체해 주면서 10일 동안 유사 평활근 세포로 분화를 유도하였다.
모세혈관 구조를 관찰하였다. 그리고 혈관 내피세포를 vWF (BD Bioscience), PECAM (BD Bioscience) 으로, 핵을 DAPI (Vector Laboratories, Inc.)로 면역 형광염색을 실시한 후 LSM 510 META 공초점 현미경 (Carl Zeiss Inc.; Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
따라서, 본 연구에서는 배상체 형성을 통한 인간 배아줄기세포의 분화 과정 동안에 중배엽성 세포 분화를 촉진시키고자 BMP4 성장인자를 처리한 후, 배상체에서의 KDR 발현 양상에 대한 분석을 유세포분석을 통해 진행하였다. 또한' BMP4 성장인자에 의해 증가된 KDR 양성 세포 군집이 심혈관계 세포로의 분화에 있어 공통 전구세포로의 가능성을 타진하기 위해 유세포분리기를 이용하여 KDR 양성 세포군집을 분리하고, 성장인자 및 기질을 포함하는 추가적인 분화 조건을 적용하여 심혈관 구성 세포로의 분화를 유도하고, 세포 특이 표지인자들의 면역염색법으로 분석하여, 유도된 세포들의 특성을 확인하고, BMP4 성장인자에 의해 증가된 KDR 표지인자가 인간 배아줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화에 있어 관문이 됨을 확인하고자 한다.
, Aubum, CA, USA) 가 이용되었다. 또한, 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해 6일 배양된 배상 체를 KDR, CD133 그리고 PDGFRa 마커를 이용하여 유세포 분리기 (FACS Vantage flow cytometer, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 분리하였다.
. 배 상체가 중간 엽 줄기세포로 분화되었는지 유세포분석기로 분석하기 위해 PBS(Invitrogen IX)로 세척하고' Tryp-LE(Invitro- gen)를 이용하여 단일 세포군으로 만들었으며, 2% FBS (Terracell, Webtec Inc., Qiarlotte, NC, USA)가 함유된 PBS로 부유시킨 후 분석을 실시하였으며, 중간엽 줄기세포 양성 마커인 KDR(PE, R&D systems, Minneapolis, MN, USA), PDGFR a (PE, R&D systems) 과 CD133(APC, Miltenyi Biotec Inc., Aubum, CA, USA) 가 이용되었다. 또한, 중간엽 줄기세포를 분리하기 위해 6일 배양된 배상 체를 KDR, CD133 그리고 PDGFRa 마커를 이용하여 유세포 분리기 (FACS Vantage flow cytometer, BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 분리하였다.
상기된 방법으로 만든 배상체를 중간엽 세포로 분화시키기 위해, 배상체를 형성시킨 첫째 날 DMEM/F12, 1 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산' 0.1 mM 베타머켑토에탄올에 10%(v/v) 단백 혈청대체물을 첨가한 배양액에 10 ng/ml BMP4 성장인자(Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ, USA)를 처리하였으며, 다음날부터 이틀에 한번 BMP- 4 성장인자를 처리한 배양액을 교체해 주었디..
이어서, 5% BSA(Bovine Serum Albumin)을 첨가하여 한 시간 동안 블로킹한 후, 일차 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였으며, PBS로 세 번 세척한 후, 이차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS로 세 번 세적 하였다. 세적이 끝난 세포는 4, 6-diamidmo-2-phenylin- dole(DAPI)가 함유된 glycerol-based mounting solution 으로 마운팅한 뒤, LSM 510 META 공초점 현미경 (Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
1의 모식도로 나타내었다. 약 5일에서 7일 동안 배양된 배아줄기세포로부터 배상체를 형성한 후, 10 ng/ ml의 BMP4 성장인자를 처리하여 6일 동안 배양한 세포를 유세포분석기를 이용하여 KDR/CD133 또는 KDR/ PDGFR a 이 중 마커 양성세포만을 분리하였다. 그리고 새로운 배양접시로 옮겨 단층배양한 결과, 중배엽성 계통의 세포로 분화를 유도할 수 있었다.
실시하였다. 유세포 분석을 위해 PBS(Invitrogen IX) 로 세척하고, TrypLE(Invitrogen)를 이용하여 단일 세포군으로 만든 후 2% FBS(Terracell)가 함유된 PBS를 이용하여 분석을 실시하였으며, 중간엽 줄기세포의 대표적인 양성 마커인 CD105(APC, R&D systems), CD90(PE, R& D systems), CD44(PE, R&D systems)을 유세포분석기 (BD FACSCaliber, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 로 확인하였다.
중간엽 계통 세포로의 분화 유도

유세포분리기로 분리한 KDR/CD133 이 중 양성세포를 collagen (Stem Cell Technology, USA)으로 코팅된 배양접시에 1x10⁵개 놓은 후 50 ng/ml VEGF 성장인자 (Peprotech), 10 pm TGFP 억제제 SB431542(Tocris Cookson Inc., Missouri, USA) 가 첨가된 EGM-2MV(Lonza Inc., Walkerville, MD, USA) 배양액으로 이틀에 한번 교체해 주었으며, 14일 동안 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하였다. 그리고 KDR/PDGFRa 이 중 양성세포 blO, 개를 collagen (Stem Cell Technology, USA)으로 코팅된 배양접시에 놓은 후 50 ng/ml PDGF-BB(Peprotech) 성장인자가 첨가된 EGM-2MV 배양액으로 이틀에 한번 교체하여 10일 동안 유사 중간엽 줄기세포로 분화를 유도하였으며, KDR/PDGFRa 이 중 양성세포를 동일한 양으로 gelatin으로 코팅된 배양접시에 5% FBS (Terracell)가 함유된 DMEM 고농도글루코오스 배양액 (Invitrogen)으로이틀에 한번 교체해 주면서 10일 동안 유사 평활근 세포로 분화를 유도하였다.
4A의 우상단 작은 상자 내 ~40%)만을 분리하였으며, 이후 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하였다. 유세포분리기를 이용하여 분리한 KDR/ CD133 이 중 양성세포를 유사 혈관 내피세포로 분화를 유도하여 그 특성을 규명하였다(Fig. 4B, C와 D). 위상차현미경으로 관찰하였을 때 유사 혈관 내피세포는 조약돌 모양을 가지며(Fig.
2% 젤라틴이 코팅된 배양접시에서 세포 성장억제물질인 마이토마이신 C를 처리한 MEF와 함께 공배 양하였다. 이때 배양액은 DMEM/F12(50:50, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 20%(v/v) 단백혈청대체물(Invitro- gen), 1 mM L-글루타민(Invitrogen), 1% 비필수 아미노산 (Invitrogen), 1% 페니실린스트렙토마이신(Invitrogerw), 0.1 mM 베타더켑토에탄올(Invitrogen), 4 ng/ml bFGF 성장인자 (Sigma, St. Louis, MO)의 조성으로, 매일 교체해 주며 6일 간격으로 새로운 지지세포로 계대배양을 하였다. 배상체는 6일간 배양된 인간 배아줄기세포를 디스페이즈 (Invitrogen) 효소로 지지세포와 분리시킨 후 페트리 배양접시로 옮겨 DMEM/F12, 1 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미 노산, 0.
분화 가능성을 확인하였다. 이를 위해 배상체에서 BMP4 성장인자에 의해 유도된 KDR 양성 세포군을 유세포 분리기를 이용하여 분리하고(Fig. 4A와 5A), VEGF, PDGF와 같은 성장인자와 collagen(Kim J 등, 2008, Se- fcik 등, 2008), gelatin(Li 등, 2005; Xie 등, 2007)과 같은 기질을 이용하여 분화시켰다(Fig. 4와 5). 분리된 KDR 양성 세포군을 다양한 조건으로 분화 유도하였을 때, 중배엽성 세포인 유사 혈관 내피세포(endothelial cell-like cells, Fig.
03% Triton X-100 (Sigma, St Louis, MO, USA) 이 포함된 PBS(Invitrogen)로 세 번 세척하였다. 이어서, 5% BSA(Bovine Serum Albumin)을 첨가하여 한 시간 동안 블로킹한 후, 일차 항체를 4℃에서 12시간 동안 처리하였으며, PBS로 세 번 세척한 후, 이차 항체를 상온에서 1시간 반응시키고 다시 PBS로 세 번 세적 하였다. 세적이 끝난 세포는 4, 6-diamidmo-2-phenylin- dole(DAPI)가 함유된 glycerol-based mounting solution 으로 마운팅한 뒤, LSM 510 META 공초점 현미경 (Carl Zeiss Inc.
중간엽 줄기세포의 특성을 확인하기 위해 유세포 분석을 실시하였다. 유세포 분석을 위해 PBS(Invitrogen IX) 로 세척하고, TrypLE(Invitrogen)를 이용하여 단일 세포군으로 만든 후 2% FBS(Terracell)가 함유된 PBS를 이용하여 분석을 실시하였으며, 중간엽 줄기세포의 대표적인 양성 마커인 CD105(APC, R&D systems), CD90(PE, R& D systems), CD44(PE, R&D systems)을 유세포분석기 (BD FACSCaliber, BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 로 확인하였다.
평활근 세포의 특성을 확인하기 위해 면역 형광염색을 실시하였다. Calpordn (BD Bioscience) 또는 Smooth mu- sde-myosin heavy chain (SM-MHC, BD Bioscience), al- pha-Smooth muscle actin( a -SMA, BD Bioscience) 으로 평활근 세포를 염색하였으며, DAPI를 처리하여 핵을 염색시킨 후, LSM 510 META 공초점 현미경 (Carl Zeiss Inc.
혈관 내피세포의 특성을 확인하기 위해 분화된 유사 혈관 내피세포를 Matrigel (BD Biosdence)이 코팅된 배양접시에 올려서 배양하였으며, 24시간 후 40x 위상차 현미혀으로 모세혈관 구조를 관찰하였다. 그리고 혈관 내피세포를 vWF (BD Bioscience), PECAM (BD Bioscience) 으로, 핵을 DAPI (Vector Laboratories, Inc.

대상 데이터

Louis, MO)의 조성으로, 매일 교체해 주며 6일 간격으로 새로운 지지세포로 계대배양을 하였다. 배상체는 6일간 배양된 인간 배아줄기세포를 디스페이즈 (Invitrogen) 효소로 지지세포와 분리시킨 후 페트리 배양접시로 옮겨 DMEM/F12, 1 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미 노산, 0.1 mM 베 타머 켑토에 탄올에 10%(v/v) 단백 혈청 대체물을 첨가한 배양액으로 부유배양하였으며, 매일배양액을 교체해 주었다.

성능/효과

Alkaline Phosphatase(86R-lkt, SIGMA, USA) 킷을 이용하여 실험에 이용된 세포가 미분화 세포임을 확인하였다. 간략히 기술하면, 4일 동안 유지배양된 인간 배아줄기세포를 시트릿트 솔루션과 아세톤, 37% 포르말데하이드를 이용하여 2분 동안 고정을 시키고, dPBS로 세척을 해준 뒤 소디움 니트레이트와 FRL-알칼라인 솔루션을 1:1 로 섞어 2분 동안 반응을 시키고, 일차증류수에 넣어 반응을 멈주게 한 다음 napthol AS-B1 솔루션을 넣은 뒤이 용액을 준비한 세포와 15분 동안 반응시킨다.
3A와 B). 그 결과 BMP4 성장인자를 처리하지 않은 실험군의 경우 KDR 발현 증감은 보여졌으나, 경향성은 보여주지 못했다. 반면, BMP4 성장 인자를 처리한 실험군의 경우, KDR 발현은 점진적으로 증가하여 분화개시 6일째 최고점(60.
5C와 D). 그리고 KDR/PDGFRa 이 중 양성 세포를 유사 평활근 세포로 분화를 유도하여 그 특성을 규명한 결과(Fig. 5E, F와 G), 위상차 현미경 하에서 가늘고 긴 평활근 세포와 흡사한 형태를 관찰할 수 있었으며(Fig. 5E), 면역형광염색을 실시한 결과, 평활근 세포 특이 마커 인 calponin, a-Smooth musde actin ( aSMA) (Fig. 5F), smooth muscle-myosin heavy chain(SM-MHC) (Fig. 5G)의 발현을 확인할 수 있었다.
약 5일에서 7일 동안 배양된 배아줄기세포로부터 배상체를 형성한 후, 10 ng/ ml의 BMP4 성장인자를 처리하여 6일 동안 배양한 세포를 유세포분석기를 이용하여 KDR/CD133 또는 KDR/ PDGFR a 이 중 마커 양성세포만을 분리하였다. 그리고 새로운 배양접시로 옮겨 단층배양한 결과, 중배엽성 계통의 세포로 분화를 유도할 수 있었다.
이는 미분화 배아줄기세포 및 배상체 분화에 있어 KDR의 내제 발현 (endogeneous expression) (Boyd 등, 2007)과 관련 있다고 보고 있다. 그에 반해 BMP4 성장인자가 포함된 배 상체배양조건에서의 KDR 발현 양상은 본 연구 조건에 있어 분화 시점부터 점진적으로 증가하여 분화개시 6일째 KDR 발현의 최고점을 보였으며, 그 후 발현 감소함을 볼 수 있었다(Fig. 3). 이는 배아줄기세포의 중배엽으로의 초기분화에 있어 KDR의 첫 번째 발현 정점과 의미를 같이한다고 볼 수 있다(Zhang 등, 2008).
이는 인간 배아줄기세포의 중배엽으로의 분화에 BMP4 성장인자가 절대적인 요인이 아님을 보여준다(Boyd 등, 2007). 또한, KDR의 분화양상에 있어 어떤 경향성도 보여주지는 못했으며, 배 상체 배양 시마다 다른 발현 경향을 보였다. 이는 미분화 배아줄기세포 및 배상체 분화에 있어 KDR의 내제 발현 (endogeneous expression) (Boyd 등, 2007)과 관련 있다고 보고 있다.
4B), Matrigel 위에서 혈관 유사 형태의 연결망을 형성하였다(Fig 4C). 또한, 면역 형광염색을 실시한 결과, vWF, PECAM과 DAPI가 염색되어 공초점현미경 하에서 관찰되었다(Fig. 4D).
2B). 또한, 유세포분석기를 이용하여 미분화 세포의 대표적인 마커인 TRA-1-60/SSEA-4의 이 중 양성 발현(99% 이상)을 확인하였고(Fig. 2C), 90% 이상의 CD133 을 발현하고 있는 것에 반해 KDR의 발현은 확인할 수 없었다(Fig. 2D).
65)을 볼 수 있었다. 또한, 이러한 KDR의 발현이 BMP4 성장인자의 영향에 의한 것인지 확인하기 위해 10 ng/ml 농도의 BMP4 성장인자와 함께, BMP4 성장인자의 억제제로 알려진 Noggin을 50 ng/ml의 농도로 처리한 결괴-, BMP4 성장인자 처리에 의해 높게 발현되는 KDR(42.71%±1.85)에 비해, 발현이 현저히 억제된 KDR(11.67%±3.11)을 확인하였다(Fig. 3C와 D).
그 결과 BMP4 성장인자를 처리하지 않은 실험군의 경우 KDR 발현 증감은 보여졌으나, 경향성은 보여주지 못했다. 반면, BMP4 성장 인자를 처리한 실험군의 경우, KDR 발현은 점진적으로 증가하여 분화개시 6일째 최고점(60.99%±3.18)을 보였으며, 그 후 감소함(33.81%±3.65)을 볼 수 있었다. 또한, 이러한 KDR의 발현이 BMP4 성장인자의 영향에 의한 것인지 확인하기 위해 10 ng/ml 농도의 BMP4 성장인자와 함께, BMP4 성장인자의 억제제로 알려진 Noggin을 50 ng/ml의 농도로 처리한 결괴-, BMP4 성장인자 처리에 의해 높게 발현되는 KDR(42.
첫 번째 KDR 발현 정점은 일시적이며, 이후 두 번째 KDR 발현 정점은 계속적으로 유지되는 것으로 알려져 있다. 보고된 마우스 배아줄기세포의 Flk-1 발현 양상과는 달리, BMP4 성장인자가 없는 배상체 배양조건에서도 KDR의 발현은 증감을 보였다. 이는 인간 배아줄기세포의 중배엽으로의 분화에 BMP4 성장인자가 절대적인 요인이 아님을 보여준다(Boyd 등, 2007).
기대된다. 본 연구결과를 통해, BMP4 성장인자는 인간 배아줄기세포의 분화 과정에서 KDR 발현에 일정한 경향성을 부여함으로써 중배엽성 전구세포로의 분화가 가능할 것으로 보인다. 더욱이 KDR을 표지 마커로 이용하여 분리된 세포는 중배엽성 전구세포의 특성을 가지며, 다양한 분화 조건에 의해 심혈관 관련세포들로 분화될 수 있을 것으로 기대된다.
5B, C와 D). 이는 위상차 현미경 하에서 중간엽 줄기세포 형태와 유사하게 관찰되었으며 (Fig. 5B), 유세포분석기를 이용하여 중간엽 줄기세포의 마커인 CD44, CD105, CD90의 발현을 확인할 수 있었다(Fig. 5C와 D). 그리고 KDR/PDGFRa 이 중 양성 세포를 유사 평활근 세포로 분화를 유도하여 그 특성을 규명한 결과(Fig.
이어서 배상체에서 BMP4 성장인자에 의해 증가된 KDR 양성 세포가 중배엽성 전구세포로서 심혈관 세포로의 분화 가능성을 확인하였다. 이를 위해 배상체에서 BMP4 성장인자에 의해 유도된 KDR 양성 세포군을 유세포 분리기를 이용하여 분리하고(Fig.

후속연구

본 연구결과를 통해, BMP4 성장인자는 인간 배아줄기세포의 분화 과정에서 KDR 발현에 일정한 경향성을 부여함으로써 중배엽성 전구세포로의 분화가 가능할 것으로 보인다. 더욱이 KDR을 표지 마커로 이용하여 분리된 세포는 중배엽성 전구세포의 특성을 가지며, 다양한 분화 조건에 의해 심혈관 관련세포들로 분화될 수 있을 것으로 기대된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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