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문제 정의
- 따라서 본 연구는 선행연구를 바탕으로 65% per coll을 통해 세균이 제거되고 높은 운동성을 갖는 미니돼지 정자를 조성이 서로 다른 동결보존액 Triladyl과 LEY를 사용하여 동결하여 융해 후 정자 생존율을 비교 분석하였고, 이를 체외수정에 이용하여 수정율, 분화율 및 배반포로의 발달율을 확인하여 percoll 분리된 정자의 동결-보존체계를 확립하기 위하여 수행하였다.
- 따라서 이전실험에서 수행되었던 65% percoll에 의해 분리된 미니돼지 정자가 동결-융해 후 생존율, 기형율, 원형질막 보존 및 첨체반응에 좋은 효과를 나타내어, 본 연구에서는 이 동결정액을 이용하여 체외수정 능력을 검토하였다. 실험 1을 바탕으로 percoll 분리된 정자의 동결보존능력에 대해 알아보기 위하여 돼지에서 잘 사용되고 있지 않는 Triladyl 동결보존액과 보편적으로 쓰이는 LEY 동결보존액을 실험에 이용하였다.
제안 방법
- 65% percoll로 분리된 미니돼지 정액을 두 종류의 동결보존액 LEY와 Triladyl을 이용하여 동결 보존한 정액의 수정율, 분할율 및 배반포 발달율을 수정 후 48, 96 및 144시간 후에 변화를 관찰하였다. 수정 후 48시간 후의수정율을 Table 2에 나타냈다.
- 실험 1을 바탕으로 percoll 분리된 정자의 동결보존능력에 대해 알아보기 위하여 돼지에서 잘 사용되고 있지 않는 Triladyl 동결보존액과 보편적으로 쓰이는 LEY 동결보존액을 실험에 이용하였다. LEY 동결보존액이 돼지 정액의 동결보존에 있어 효율적(Shim 등, 2005) 이라는보고가 있었고, percoll 분리된 정자는 액상보관시 높은 생존율(Yoo 등, 2009)을 갖는다고 알려져 있기 때문에 percoll 분리된 정자의 동결보존에 있어 동결보존액과 생존율에 초점을 맞추어 실험을 실행하였다. 그 결과, 돼지 정액의 동결에 잘 이용되지 않는 Triladyl 동결보존액과 비교해 보았을 때 LEY 동결보존액이 높은 생존율을 보였으며, percoll 분리된 동결보존된 정자는 융해 후 높은 생존율을 나타내었다.
- Percoll 분리 후 동결보존액 LEY와 Triladyl# 이용한 동결-융해 후의 미니돼지 정자의 생존율 비교 평가 : 65% percoll로 분리된 미니돼지 정액과 분리하지 않은 정액을 LEY와 Triladyl 두 종류의 동결보존액을 이용하여 동결- 융해한 후 SYBR-14와 PI 형광염색약을 이용한 double stain 방법을 이용하여 Flow cytometry로 형광의 발현 차를 분석하였다.
- Percoll 분리된 미니돼지 정자를 동결보존액 LEY와 Tri- ladyl를 이용하여 동결-융해된 정자의 체외수정율, 분할율및 배반포 발달율 비교 평가 : 실험 1에서 동결보존된 4 종류의 동결 정액을 융해한 후 체외수정에 이용하였다. 체외수정율과 분할율 및 배반포 발달율은 수정 후 48, 96 및 144시간에 관찰하여 기록하였다.
- 그러나 percoll 독성과 관련된 문제점들이 보고된 바가 있어 인공수정이나 체외수정을 위해서는 적합한 방법이 아니라고 밝히고 있는 연구 결과(Strehler 등, 1998)와 per- coll로 분리한 돼지정자의 체외 수정 능력의 향상(Grant 등, 1994)에 대한 연구결과를 바탕으로 이를 확인하고자 체외수정실험을 실시하였다. 실험 2의 결과, 65% percoll 분리 후 동결한 미니돼지 정액을 사용하여 체외수정을 하였을 때 수정 48시간 후 수정율은 유의적인 차이가 없었지만, 96시간 후에는 65% percoll로 분리된 동결 정자를 사용하였을 때 분리하지 않은 동결정자에 비하여 유의적으로 높은 분할율을 보였으며, 특히 LEY 동결보존액을 사용하였을 때 Triladyl 동결보존액보다 더 높은 분할율을 나타내었다.
- 난자를 선별하여 실험에 이용하였다. 난자의 체외성숙은 기본 배양액 TCM199 에 pFF (10%), LH (5 ug/ml), FSH (0.5 pg/ml), hCG (10 IU/ml)z EGF (0.01 ug/ml)를첨가한 IVM-1 용액에서 5% CO》38.5℃에서 21시간 성숙 배양 후 TCM199에 pFF (10%)와 EGF (0.01 ug/ml)만을 첨가한 IVM-2 용액에서 5% COz, 38.5℃에서 21시간 동안 성숙배양시켰다.
- Louis, MO, USA)에 20%의 egg-yolk 를 첨가하였고, Triladyl 1차 동결보존액은 Triladyl에 20% egg-yolk를 첨가하여 각각 원심분리(4, 000 rpm, 90 min, 4℃)하여 상층액만을 사용하였다. 동결시 Glycerol과 Orvus Es Paste(OEP ; Nova Chem., USA) 의 최종 농도를 각각 0.5%와 3%로 맞추기 위하여 2차 동결보존액은 1 차 동결보존액에 9% Glycerol(Sigg)과 1.5% OEP를 첨가하여 4℃ 냉장에 보관하였다.
- 5℃ 에서 배양하였다. 배양 6시간 후 수정된 난자 주위에 붙어있는 난구세포와 정자를 제거한 후 PZM-3 (NaCI 108 mM, KCI 10.00 mM, KH2PO4 0.35 mM, MgSO4 - 7H2O 0.40 mMz NaHCCh 25.07 mMz Glutamine 1 mM, Ca- (lactate)2 - 5H2O 2 rrM Hypotaurine 5 mM, Gentamicin sulfate 0.05 mg/ml, Basal Medium Eagle Amino Acid (BME)Z MEM)에 0.03% BSA를 첨가한 체외배양액에서 5% CO2 38.5C에서 배양하며 관찰하였다.
- 분리된 미니돼지 정자를 서로 다른 두 개의 동결보존액을 이용하여 동결에 이용되었다. 일반적으로 돼지 정액동결에 이용되는 동결보존액 LEY와 소 정액 동결에 이용되는 Triladyl(KRUUSE, Cat.
- 생존율 확인을 위한 Live/Dead kit는 SYBR-14와 PI로 구성되어 있어 세포막투과의 차이로 생존율을 분석하였다. 살아 있는 세포에서는 SYBR-14가 세포막을 투과하게 되어 핵이 녹색으로 형광 염색되고, 막 손상을 입은 세포나 막 투과성이 없는 세포는 PI가 핵에 염색되어 붉은색을 띠게 되는 방법을 사용하였다. 두 가지 색으로 염색된 정자는 유속세포 분석기인 Flow cytometry를 이용하여 형광의 발현차를 분석하여 생존율을 평가하였다.
- 형광 염색하여 분석하였다. 생존율 확인을 위한 Live/Dead kit는 SYBR-14와 PI로 구성되어 있어 세포막투과의 차이로 생존율을 분석하였다. 살아 있는 세포에서는 SYBR-14가 세포막을 투과하게 되어 핵이 녹색으로 형광 염색되고, 막 손상을 입은 세포나 막 투과성이 없는 세포는 PI가 핵에 염색되어 붉은색을 띠게 되는 방법을 사용하였다.
- 있는 PWG miniature pig를 이용하였다. 의빈대를 이용한 음경 수압법으로 정액을 채취하여 가온된 병에 1차적으로 거즈를 통해 정액을 거른 후, 정액을 37℃로 가 온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하여 사용하였다. 실험에 사용된 정액은 70% 이상의 정상 움직임과 80% 이상의 생존율을 나타내는 정액을 사용하였다.
- 그 후 동결정액을 37℃에서 45초 동안 융해한 후 BTS로 희석한 후 원심분리(1,500 rpm, 5 min)하여 상층액을 제거한 후 실험에 사용하였다. 정자의 첨체반응을 유도하기 위해 mTBM에 0.04% BSA (Sigma A-4503)와 caffeine이 첨가된 배양액에 정자의 최종 농도를 小10%111로 희석하여 난자가 들어있는 drop에 체외수정을 한 후 5% COz, 38.5℃ 에서 배양하였다. 배양 6시간 후 수정된 난자 주위에 붙어있는 난구세포와 정자를 제거한 후 PZM-3 (NaCI 108 mM, KCI 10.
- 이용하였다. 체외수정율과 분할율 및 배반포 발달율은 수정 후 48, 96 및 144시간에 관찰하여 기록하였다.
대상 데이터
- Flow cytometry를 통한 SYBR-14/PI로 double stain 된 정자를 처리구당 30, 000개를 분석하였다. Percoll로 분리한 정액과 그렇지 않은 정액을 서로 다른 동결보존액으로 동결-융해하여 생존율을 나타낸 것을 Table 1에 나타냈다.
- 본 연구에 이용된 돼지는 강원대학교 목장에서 사육되고 있는 PWG miniature pig를 이용하였다. 의빈대를 이용한 음경 수압법으로 정액을 채취하여 가온된 병에 1차적으로 거즈를 통해 정액을 거른 후, 정액을 37℃로 가 온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하여 사용하였다.
- 실험 1을 바탕으로 percoll 분리된 정자의 동결보존능력에 대해 알아보기 위하여 돼지에서 잘 사용되고 있지 않는 Triladyl 동결보존액과 보편적으로 쓰이는 LEY 동결보존액을 실험에 이용하였다. LEY 동결보존액이 돼지 정액의 동결보존에 있어 효율적(Shim 등, 2005) 이라는보고가 있었고, percoll 분리된 정자는 액상보관시 높은 생존율(Yoo 등, 2009)을 갖는다고 알려져 있기 때문에 percoll 분리된 정자의 동결보존에 있어 동결보존액과 생존율에 초점을 맞추어 실험을 실행하였다.
- 의빈대를 이용한 음경 수압법으로 정액을 채취하여 가온된 병에 1차적으로 거즈를 통해 정액을 거른 후, 정액을 37℃로 가 온된 병에 옮겨 2시간 이내로 실험실로 운반하여 사용하였다. 실험에 사용된 정액은 70% 이상의 정상 움직임과 80% 이상의 생존율을 나타내는 정액을 사용하였다.
- 실험에 사용한 난자는 도축장에서 도살된 암퇘지로부터 난소를 채취한 후 직경 2~6 mm의 난포에서 18G의 주사침을 이용하여 난포액을 모아 침전 후 상층액을 걸러낸 뒤에 실체현미경 하에서 난세포와 난구세포가 균일한 난자를 선별하여 실험에 이용하였다. 난자의 체외성숙은 기본 배양액 TCM199 에 pFF (10%), LH (5 ug/ml), FSH (0.
- 이용하여 동결에 이용되었다. 일반적으로 돼지 정액동결에 이용되는 동결보존액 LEY와 소 정액 동결에 이용되는 Triladyl(KRUUSE, Cat. no. 340244)의 2가지 동결보존액을 이용하였다. LEY 1차 동결보존액은 11% a-lactose 용액(Sigma, St.
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체외수정 및 체외배양
체외수정에 이용된 기본배양액은 mTBM (NaCI 113.1 mM, KCI 3 uiM, CaCh - 2H2O 7.5 mM, Glucose 11 mM, Pyruvic acid 5 mM, L-cysteine 0.57 mM, Tris 20 mM, Penicillin G 20 mM, Streptomycin sulfate 3.4 mM) 을 사용하였다. 성숙된 난자는 0.
데이터처리
- 살아 있는 세포에서는 SYBR-14가 세포막을 투과하게 되어 핵이 녹색으로 형광 염색되고, 막 손상을 입은 세포나 막 투과성이 없는 세포는 PI가 핵에 염색되어 붉은색을 띠게 되는 방법을 사용하였다. 두 가지 색으로 염색된 정자는 유속세포 분석기인 Flow cytometry를 이용하여 형광의 발현차를 분석하여 생존율을 평가하였다.
- 실험에서 얻어진 결과는 SAS 9.1 을 이용하여 최소 유의차 검정 (Least Significant Different test; LSD test) 과 General linear model(GLM)을 적용하여 Duncan의 multiple range test에 의하여 유의 차(μ<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
- 생존율은 Live/Dead kit(Maxwell 과 Johnson, 1997) 로정자를 형광 염색하여 분석하였다. 생존율 확인을 위한 Live/Dead kit는 SYBR-14와 PI로 구성되어 있어 세포막투과의 차이로 생존율을 분석하였다.
성능/효과
- 동결정액을 이용한 체외수정 144시간 이후의 수정란의 배반포 발달율을 Table 4에 나타냈다. Percoll로 분리된 동결정액의 배반포 발달율이 분리하지 않은 처리구보다 유의적 (p<0.05)으로 높게 나타났다. 또한, percoll 분리 후 동결한 정액을 사용한 수정란의 경우 배반포 발달율은 LEY 동결 보존액(20.
- Table 3에 나타냈다. Percoll로 분리하여 동결한 모든 처리구에서의 분할율이 분리하지 않고 동결한 처리 구보다 유의적(μ<0.05)으로 높게 나타났다. 특히, 분할율에있어 percoll을 이용하여 분리한 처리구에서 LEY 동결보존액을 사용하여 동결한 정액의 분할유83.
- LEY 동결보존액이 돼지 정액의 동결보존에 있어 효율적(Shim 등, 2005) 이라는보고가 있었고, percoll 분리된 정자는 액상보관시 높은 생존율(Yoo 등, 2009)을 갖는다고 알려져 있기 때문에 percoll 분리된 정자의 동결보존에 있어 동결보존액과 생존율에 초점을 맞추어 실험을 실행하였다. 그 결과, 돼지 정액의 동결에 잘 이용되지 않는 Triladyl 동결보존액과 비교해 보았을 때 LEY 동결보존액이 높은 생존율을 보였으며, percoll 분리된 동결보존된 정자는 융해 후 높은 생존율을 나타내었다. 이러한 결과로부터 percoll 분리된 정자를 LEY 동결보존액에 동결보존시 높은 생존능력이 있다고 판단된다.
- 05)으로 높게 나타났다. 그리고 동결보존액은 Triladyl보다는 돼지 동결정액에 많이 이용되는 LEY를 사용하는 것이 좋은 효과를 얻는다는 것을 입증하였다. 또한, 체외수정에 있어 percoll로 분리된 후 동결 보존된 정액이 그렇지 않은 정액에 비하여 유의적S<0.
- 05)으로 높게 나타났다. 또한, percoll 분리 후 동결한 정액을 사용한 수정란의 경우 배반포 발달율은 LEY 동결 보존액(20.9±1.3%)보다 Triladyl 동결보존액(21.5±1.4 %)을 사용하였을 때 유의적 (p<0.05)으로 높았다.
- 이는 정자가 percoll에 의한 분리 과정중 percoll 내에 존재한다는 독소 물질로부터 해로운 영향을 받지 않는 점과 미니돼지 정액 동결에 있어 LEY가 Tri- ladyl보다 동결보존에 높은 효율을 보인다고 판단되어 진다. 또한, 수정 후 144시간 이후에는 배반포 발달율이 percoll로 분리 후 동결한 처리구에서 더 높은 결과가 나타났다. 이는 65% percoll로 분리된 미니돼지 정자가 액상 보존시 높은 생존능력과 첨체반응율(Yoo 등, 2009)을보이며, 동결-융해 후 낮은 기형율, 높은 정자강도 및 낮은 첨체반응율(Lee 등, 2010)의 결과와 비교해 볼 때 이번 실험을 통하여 동결-융해 후에도 생존율, 수정율, 분할율및 배반포 발달율에 있어서 좋은 영향을 미친다는 점에서 중요한 결과라고 판단할 수 있다.
- 그리고 동결보존액은 Triladyl보다는 돼지 동결정액에 많이 이용되는 LEY를 사용하는 것이 좋은 효과를 얻는다는 것을 입증하였다. 또한, 체외수정에 있어 percoll로 분리된 후 동결 보존된 정액이 그렇지 않은 정액에 비하여 유의적S<0.05)으로 높은 분할율과 배반포 발달율을 나타났다. 따라서 per coll에 의해 분리된 정액의 동결이 체외수정에 있어 좋은 영향을 미친다고 판단되어진다.
- 본 연구의 결과로 보아 65% percoll에 의해 분리된 정자의 생존율과 체외수정 능력은 percoll로 분리 후 동결 보존한 정액은 분리하지 않은 정액에 비하여 생존율 이유 의적(μ<0.05)으로 높게 나타났다. 그리고 동결보존액은 Triladyl보다는 돼지 동결정액에 많이 이용되는 LEY를 사용하는 것이 좋은 효과를 얻는다는 것을 입증하였다.
- 실시하였다. 실험 2의 결과, 65% percoll 분리 후 동결한 미니돼지 정액을 사용하여 체외수정을 하였을 때 수정 48시간 후 수정율은 유의적인 차이가 없었지만, 96시간 후에는 65% percoll로 분리된 동결 정자를 사용하였을 때 분리하지 않은 동결정자에 비하여 유의적으로 높은 분할율을 보였으며, 특히 LEY 동결보존액을 사용하였을 때 Triladyl 동결보존액보다 더 높은 분할율을 나타내었다. 이는 정자가 percoll에 의한 분리 과정중 percoll 내에 존재한다는 독소 물질로부터 해로운 영향을 받지 않는 점과 미니돼지 정액 동결에 있어 LEY가 Tri- ladyl보다 동결보존에 높은 효율을 보인다고 판단되어 진다.
- Percoll로 분리한 정액과 그렇지 않은 정액을 서로 다른 동결보존액으로 동결-융해하여 생존율을 나타낸 것을 Table 1에 나타냈다. 연구의 결과 동결정자의 생존율은 percoll 분리된 정자와 분리하지 않은 정자를 비교하였을 때 높게 나타났고, percoll 분리된 정자에서는 LEY(63.1±6.1%)와 Tri- lady(55.1±1.8%)의 동결보존액을 사용하여 동결하였을 때 LEY에서 유의적(p<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다.
- 그 결과, 돼지 정액의 동결에 잘 이용되지 않는 Triladyl 동결보존액과 비교해 보았을 때 LEY 동결보존액이 높은 생존율을 보였으며, percoll 분리된 동결보존된 정자는 융해 후 높은 생존율을 나타내었다. 이러한 결과로부터 percoll 분리된 정자를 LEY 동결보존액에 동결보존시 높은 생존능력이 있다고 판단된다.
- 수정 후 48시간 후의수정율을 Table 2에 나타냈다. 체외수정 후 48시간 후에는 percoll로 분리된 정자와 분리되지 않은 정자를 동결보존액 Triladyl과 LEY를 사용하여 동결보존한 처리 구에서 수정율은 유의적(μ<0.05) 인 차이가 나타나지 않았다.
- 05)으로 높게 나타났다. 특히, 분할율에있어 percoll을 이용하여 분리한 처리구에서 LEY 동결보존액을 사용하여 동결한 정액의 분할유83.2±1.9%)이 Triladyl 동결보존액을 사용하여 동결한 정액의 분할율(79.1 ±1.6%)보다 유의적 (p<0.05)로 높은 결과를 나타냈다. 동결정액을 이용한 체외수정 144시간 이후의 수정란의 배반포 발달율을 Table 4에 나타냈다.
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