초기 임신우의 공란우 활용이 초음파 유도 난자 채취 및 수정란 생산에 미치는 영향 Effect of Early Pregnant Heifer as Donor on the Ovum Pick-Up Derived Oocyte Aspiration and Embryo Production원문보기
본 연구에서는 유전적 가치가 높은 가축을 OPU 기술을 이용하여 단기간에 반복적이고 연속적으로 생체 내 난포란을 채란하여 수정란을 생산할 수 있는 가능성을 연구한 것으로써, 수정란의 안정적인 생산 및 이식으로 가축 개량의 세대 간격을 단축하기 위해 우수한 유전력을 가진 염선된 개체의 임신 초기 3개월 동안에 반복적인 수정란 생산 가능 여부를 조사하였다. 1. 비임신우 및 임신 초기우에 2회/주 채란으로 비인신우에서는 68회 채란으로 생성된 난포수는 721개($10.6{\pm}3.9$)의 난포를 흡입하여 364개($5.4{\pm}3.4$)의 난자를 회수하여 50.5%의 회수율을 보였으나, 임신 초기우에서는 34회 채란으로 441개($13.0{\pm}4.3$) 생성된 난포를 흡입하여 그중 261개($7.7{\pm}3.6$)의 난자가 회수되어 회수율이 59.2%로 유의적으로 높게 나타났다. 2. 초기임신우와 비임신우간의 회수된 난자의 등급은 비임신우 및 임신우에서 평균 $5.4{\pm}3.4$개 및 $7.7{\pm}3.6$개 회수된 난자에서 Grade II(평균 $2.1{\pm}2.1$개 및 $2.4{\pm}2.2$개)와 Grade IV(평균 $0.8{\pm}1.3$ 및 $1.2{\pm}1.5$개)는 유의적인 차이가 없었으나, Grade I(평균 $1.6{\pm}1.2$ 및 $2.4{\pm}1.3$개)과 Grade III(평균 $0.9{\pm}1.4$ 및 $1.6{\pm}1.9$개)은 유의차가 있었으며, Grade I, II 등급 출현율는 각각 $3.7{\pm}2.7$개 및 $4.9{\pm}2.6$개로 채취한 임선우에서 유의적으로 높게 나타났다. 3. 임신 초기우 및 비임신우로부터 채취한 난포란을 각 개체별 체외성숙 및 체외수정 후 배반포의 발생률은 수정 및 분할률에서 평균 $3.3{\pm}2.4$개, 임신우에서는 평균 $4.8{\pm}2.3$개로 유의적으로 높게 나타났으나, 이식가능한 배반포 발달은 93개 및 58개, 발달률은 25.5% 및 22.2%로 임신우에서 낮았으며, 또한 채란회수당 평균 배반포 발달에서는 $1.4{\pm}1.1$개 및 $1.7{\pm}0.9$개로 임신우의 평균 수가 많았으나 유의차는 없었다. 이상의 본 연구의 결과에서 가축의 임신 초기 개체에서도 1주일에 2회 반복적으로 OPU를 실시한 후 체외성숙 및 체외 배양을 통해 반복적으로 이식 가능한 수정란을 생산하였다. 이러한 방법은 가축의 초기 임신우로부터 채란이 가능하므로 개체의 임신에 대한 불안삼을 해소할 수 있으며, 유전적으로 아주 우수한 고능력우를 임신 기간 중에도 공란우로 이용하여 반복적으로 수정란의 생산이 가능하므로 그 이용의 활용도가 높을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 유전적 가치가 높은 가축을 OPU 기술을 이용하여 단기간에 반복적이고 연속적으로 생체 내 난포란을 채란하여 수정란을 생산할 수 있는 가능성을 연구한 것으로써, 수정란의 안정적인 생산 및 이식으로 가축 개량의 세대 간격을 단축하기 위해 우수한 유전력을 가진 염선된 개체의 임신 초기 3개월 동안에 반복적인 수정란 생산 가능 여부를 조사하였다. 1. 비임신우 및 임신 초기우에 2회/주 채란으로 비인신우에서는 68회 채란으로 생성된 난포수는 721개($10.6{\pm}3.9$)의 난포를 흡입하여 364개($5.4{\pm}3.4$)의 난자를 회수하여 50.5%의 회수율을 보였으나, 임신 초기우에서는 34회 채란으로 441개($13.0{\pm}4.3$) 생성된 난포를 흡입하여 그중 261개($7.7{\pm}3.6$)의 난자가 회수되어 회수율이 59.2%로 유의적으로 높게 나타났다. 2. 초기임신우와 비임신우간의 회수된 난자의 등급은 비임신우 및 임신우에서 평균 $5.4{\pm}3.4$개 및 $7.7{\pm}3.6$개 회수된 난자에서 Grade II(평균 $2.1{\pm}2.1$개 및 $2.4{\pm}2.2$개)와 Grade IV(평균 $0.8{\pm}1.3$ 및 $1.2{\pm}1.5$개)는 유의적인 차이가 없었으나, Grade I(평균 $1.6{\pm}1.2$ 및 $2.4{\pm}1.3$개)과 Grade III(평균 $0.9{\pm}1.4$ 및 $1.6{\pm}1.9$개)은 유의차가 있었으며, Grade I, II 등급 출현율는 각각 $3.7{\pm}2.7$개 및 $4.9{\pm}2.6$개로 채취한 임선우에서 유의적으로 높게 나타났다. 3. 임신 초기우 및 비임신우로부터 채취한 난포란을 각 개체별 체외성숙 및 체외수정 후 배반포의 발생률은 수정 및 분할률에서 평균 $3.3{\pm}2.4$개, 임신우에서는 평균 $4.8{\pm}2.3$개로 유의적으로 높게 나타났으나, 이식가능한 배반포 발달은 93개 및 58개, 발달률은 25.5% 및 22.2%로 임신우에서 낮았으며, 또한 채란회수당 평균 배반포 발달에서는 $1.4{\pm}1.1$개 및 $1.7{\pm}0.9$개로 임신우의 평균 수가 많았으나 유의차는 없었다. 이상의 본 연구의 결과에서 가축의 임신 초기 개체에서도 1주일에 2회 반복적으로 OPU를 실시한 후 체외성숙 및 체외 배양을 통해 반복적으로 이식 가능한 수정란을 생산하였다. 이러한 방법은 가축의 초기 임신우로부터 채란이 가능하므로 개체의 임신에 대한 불안삼을 해소할 수 있으며, 유전적으로 아주 우수한 고능력우를 임신 기간 중에도 공란우로 이용하여 반복적으로 수정란의 생산이 가능하므로 그 이용의 활용도가 높을 것으로 사료된다.
This study was carried out to evaluate the effect of early pregnant cow as donor for Ovum Pick-Up (OPU) derived oocyte aspiration and embryo production in Holstein heifers. Four non-pregnant and 2 pregnant Holstein heifers were used as donor and then carried out total 17 OPU session for 10 weeks (2 ...
This study was carried out to evaluate the effect of early pregnant cow as donor for Ovum Pick-Up (OPU) derived oocyte aspiration and embryo production in Holstein heifers. Four non-pregnant and 2 pregnant Holstein heifers were used as donor and then carried out total 17 OPU session for 10 weeks (2 times per week). Recovered cumulus-oocyte-complexes (COCs) were classified into 4 grade by oocyte cytoplasm and cumulus cells and matured in vitro in TCM-199 supplemented with 10% FBS, 10 mg/ml FSH and 1 mg/ml estradiol in 5% $CO_2$ and over 99% humidity for 24 h. After 24 h co-incubation with post-thaw sperm, the presumed zygotes were cultured in CR1aa medium with 4 mg/ml BSA for 3 days and then changed CR1aa medium with 10% of FBS for another 3~4 days. The Mean number of aspirated follicles and collected oocytes in the early stage pregnant and non-pregnant heifers were $13.0{\pm}4.3$ and $10.6{\pm}3.9$, $5.4{\pm}3.4$ and $7.7{\pm}3.6$ per session, respectively. Rate of collected oocyte from aspirated follicles were 59.2% and 50.5%, respectively. The average number of good quality oocytes (Grade I and II) in the early stage pregnant and non-pregnant heifers was $3.7{\pm}2.7$ and $4.9{\pm}2.6$ (Mean${\pm}$SD). Cleavage and blastocyst developmental rates in Grade I and II were 22.2% and 25.5%, and then $1.7{\pm}0.9$ and $1.4{\pm}1.1$ blastocyst per session, respectively. In conclusion, OPU technology can be used in early stage pregnant and non-pregnant heifers without any problem and so applied OPU derived embryo production to maximize the ability of genetically valuable females.
This study was carried out to evaluate the effect of early pregnant cow as donor for Ovum Pick-Up (OPU) derived oocyte aspiration and embryo production in Holstein heifers. Four non-pregnant and 2 pregnant Holstein heifers were used as donor and then carried out total 17 OPU session for 10 weeks (2 times per week). Recovered cumulus-oocyte-complexes (COCs) were classified into 4 grade by oocyte cytoplasm and cumulus cells and matured in vitro in TCM-199 supplemented with 10% FBS, 10 mg/ml FSH and 1 mg/ml estradiol in 5% $CO_2$ and over 99% humidity for 24 h. After 24 h co-incubation with post-thaw sperm, the presumed zygotes were cultured in CR1aa medium with 4 mg/ml BSA for 3 days and then changed CR1aa medium with 10% of FBS for another 3~4 days. The Mean number of aspirated follicles and collected oocytes in the early stage pregnant and non-pregnant heifers were $13.0{\pm}4.3$ and $10.6{\pm}3.9$, $5.4{\pm}3.4$ and $7.7{\pm}3.6$ per session, respectively. Rate of collected oocyte from aspirated follicles were 59.2% and 50.5%, respectively. The average number of good quality oocytes (Grade I and II) in the early stage pregnant and non-pregnant heifers was $3.7{\pm}2.7$ and $4.9{\pm}2.6$ (Mean${\pm}$SD). Cleavage and blastocyst developmental rates in Grade I and II were 22.2% and 25.5%, and then $1.7{\pm}0.9$ and $1.4{\pm}1.1$ blastocyst per session, respectively. In conclusion, OPU technology can be used in early stage pregnant and non-pregnant heifers without any problem and so applied OPU derived embryo production to maximize the ability of genetically valuable females.
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문제 정의
따라서 본 연구의 목적은 공란우로서 고능력의 임신우를 상정하여 볼 때 생식생리학적으로 임신 중에는 수정란의 채취가 불가능하나, OPU 기법을 이용하여 임신 초기 개체에서 일정 기간 미성숙 난자의 반복 채취, 회수율, 등급을 분석하고, 이를 체외성숙 및 체외수정으로 임신된 공란우의 임신 초기에서 반복적이면서 효율적인 수정란 생산 방안에 대하여 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 유전적 가치가 높은 가축을 OPU 기술을 이용하여 단기간에 반복적이고 연속적으로 생체 내 난포란을 채란하여 수정란을 생산할 수 있는 가능성을 연구한 것으로써, 수정란의 안정적인 생산 및 이식으로 가축 개량의 세대 간격을 단축하기 위해 우수한 유전력을 가진 임신된 개체의 임신 초기 3개월 동안에 반복적인 수정란 생산 가능 여부를 조사하였다.
제안 방법
Emcon Embryo filter(Agtec, USA)를 이용하여 혈액 등을 여과시켜 실체 현미경으로 난자를 회수하였고, 난포란의 등급 분류는 세포질의 색깔과 난구세포 부착 정도에 따라 평가 기준Gradel ~IV까지 설정하여 분류하였다(Merton 등, 2003; Petyim 등, 2003; Jeong 등, 2009). 회수된 모든 난자를 체외성숙에 제공하였다.
젖소 동결 정액 straw를 38℃ 온수에서 30초간 융해 후, 10 ml tube의 정자 세척액(D-PBS, Gibco)에 넣은 다음 1800 rpm에서 5분간 원심분리하였다. Tube 하단 부분의펠렛화된 정자를 회수하여 20 ug/ml heparin으로 CO2 배양기에서 약 15분간 수정능을 획득하였으며, 정자의 최종 농도가IxlO6 sperms/ml가 되도록 하였고, 99% 이상의 습도, 39℃, 5% CO2 배양기에서 성숙이 완료된 난포란과 같이 24시간 동안 체외수정을 유도하였다.
6 MHz convex scanner를 사용하였고, 미성숙 난자 흡인에는 일회용 주사침(18 G)을 사용하였으며, 난자 흡인용 10 IU/mlHeparin이 첨가된 기본배양액(HEPES+10 IU Heparin)으로 주사침 및 흡인관 내를충전하였다. 공란우는 본 연구소에서 개조한 보정틀에 고정시켜 움직임을 최소화하였으며 직장 내의 분변 제거 및 꼬리를 고정하고, 흐르는 물을 이용하여 회음부와 외음부의 오물을 세척한 다음 2%로 희석된 povidone iodine 및 70% alcoho로 외음부를 소독하였다. 복부 및 질벽의 긴장을 완화시키기 위해서 lidocaine HC1(2% 염산리도카인, 광명제약, 화성) 마취제를 약 3~7 ml를 미근부의 제 1, 2 미추 간에 주사하여 부분 마취를 유도하였다.
또한 임신 공란 우 2두는 인공수정 후 30일에 직장 검사 및 초음파 검사를 통하여 자궁에 태수 및 태아의 존재를 확인한 후 선발하였다. 공시된 임신 및 미임신 개체의 OPU는 실험 초기 대난포를 제거한 다음 3일 또는 4일 간격으로 10주 동안 주 2회 실시하였고, 임신 유지 및 난소의 상태는 채란 시 직장 및 초음파 기기를 이용하여 임신 유지 여부 검사를 실시하였으며, 또한 최종 임신상태의 검사는 임신 120일에 실시하였다.
난소는 다른 손으로 직장벽을 통해서 상태, 위치를 확인 및 견인하여 질 내에 있는 탐촉자 선단부에 위치하여 초음파의 모니터 상으로 난포의 상태가 뚜렷한 흑점이 나타나도록 조정 및 고정 후 난포의 개수를 확인하였으며, 채란 가능한난포를 monitor 상의 biopsy line0] 난포를 횡절단할 수 있도록 위치시켜 난포외벽선이 뚜렷하도록 난소를 조작하여 채란 준비를 하였다. 난소의 천자는 일회용 long 주사침(18 G)으로 질벽을 관통하여 복강 내로 들어가고 monitor image의 난소에서 확인된 2~6 mm 크기의 난포 내 및 시술자 감각에 주사침이 난소 및 난포강으로 진입되는 것이 감각적으로 전달됨과 동시에 regulated vacuum pump의 foot switch를 작동시켜 즉 needle의 끝이 난포강으로 진입하는 것을 감각과 monitor image상으로 확인할 수 있었으며, 검게 나타난 난포강의 부위가 monitor 상에서 완전히 사라지고 주사침의 끝이 난포벽에 닿아 음압이 차단될 때까지 계속하여 실시하였다.
체외성숙은 TCM-199 배양액에 회수된 모든 난포란을 난자 세포질의 상태, 난구 세포의 충실도에 따라 Grade I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ.로 구분하여 배양기에서 24시간 동안 배양을 실시하였고, 난구 세포의 팽창과 세포질의 충실도 등으로 체외성숙을 판정하여 체외수정에 공시 여부를 판단하였다.
공란우는 본 연구소에서 개조한 보정틀에 고정시켜 움직임을 최소화하였으며 직장 내의 분변 제거 및 꼬리를 고정하고, 흐르는 물을 이용하여 회음부와 외음부의 오물을 세척한 다음 2%로 희석된 povidone iodine 및 70% alcoho로 외음부를 소독하였다. 복부 및 질벽의 긴장을 완화시키기 위해서 lidocaine HC1(2% 염산리도카인, 광명제약, 화성) 마취제를 약 3~7 ml를 미근부의 제 1, 2 미추 간에 주사하여 부분 마취를 유도하였다.
회수된 모든 난자를 체외성숙에 제공하였다. 본 실험에 공시된 임신 초기 공란우의 임신황체가 존재 하는 난소의 OPU는 황체 조직 외 에 존재하는 난포를 punc- ture하여 난포란을 흡입하였다.
보고하였다. 본 연구에서는 공란우에 인공수정을 실시 후 30일에 직장 검사 및 초음파 진단기를 이용하여 임신 여부를 확인한 다음 초기 2회 우점난포 제거와 함께 매주 2회 총 19회 반복 채란을 실시하였으며, 최종 인공수정 후 120일에 임신 여부를 확인하였다.
생체 내 미성숙난자 채란을 위한 난포란의 초음파 관찰은 MyLab™ 30 VET GOLD(Esaote, Genova IYALY) 및 탐촉자 (EC 123; Micro-Convex 9-3 MHz)는 6.6 MHz convex scanner를 사용하였고, 미성숙 난자 흡인에는 일회용 주사침(18 G)을 사용하였으며, 난자 흡인용 10 IU/mlHeparin이 첨가된 기본배양액(HEPES+10 IU Heparin)으로 주사침 및 흡인관 내를충전하였다. 공란우는 본 연구소에서 개조한 보정틀에 고정시켜 움직임을 최소화하였으며 직장 내의 분변 제거 및 꼬리를 고정하고, 흐르는 물을 이용하여 회음부와 외음부의 오물을 세척한 다음 2%로 희석된 povidone iodine 및 70% alcoho로 외음부를 소독하였다.
채란은 가능한 정확하고 신속하게 작업을 완료하도록 하였다. 이와 같은 방법으로 연속하여 난포란을 흡입하여 모니터상에서 난포가 완전히 흡입되는 것을 확인하고 needle을 다음 난소로 이동 시켜 반복적인 방법으로 채란하였다. 난포 천자 후 잔류된 난포액 회수를 위해 주사침과 연결 튜브를 흡인용 10 IU/ml Heparin이 첨가된 기본 배양액(HEPES+10 IU Heparin)으로 세척하였다.
체외배 양은 CRlaa 배양액에 3 mg/ml BSA, 10% FBS를 첨가하여 이용하였다. 체외수정 18~22 시간 후 3 mg/ml BSA 첨가된 CRlaa 배양액으로 2~3회 세척하여 3일간 체외배양을 실시하였으며 분할이 일어난 수정란 만을 선발하여 10% FBS 가 첨가된 CRlaa 배양액으로 3일간 2차 체외배양을 실시하여 이식 단계의 배반포가 되도록 유도하였다.
이용하였다. 체외수정 18~22 시간 후 3 mg/ml BSA 첨가된 CRlaa 배양액으로 2~3회 세척하여 3일간 체외배양을 실시하였으며 분할이 일어난 수정란 만을 선발하여 10% FBS 가 첨가된 CRlaa 배양액으로 3일간 2차 체외배양을 실시하여 이식 단계의 배반포가 되도록 유도하였다.
체외수정 배양액에 6 mg/ml BSA를 첨가하고 항생제(100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin)# 첨가한 배양액을 5 ml 분주하여 배 양기 에서 18시간 전배양을 실시하여 평형을 유도하였다. 젖소 동결 정액 straw를 38℃ 온수에서 30초간 융해 후, 10 ml tube의 정자 세척액(D-PBS, Gibco)에 넣은 다음 1800 rpm에서 5분간 원심분리하였다.
초음파 탐촉자는 condom을 이용하여 보호하여 질을 통해 삽입하였으며, 자궁경부의 좌측 또는 우측에 밀착 위치하도록 하였다. 난소는 다른 손으로 직장벽을 통해서 상태, 위치를 확인 및 견인하여 질 내에 있는 탐촉자 선단부에 위치하여 초음파의 모니터 상으로 난포의 상태가 뚜렷한 흑점이 나타나도록 조정 및 고정 후 난포의 개수를 확인하였으며, 채란 가능한난포를 monitor 상의 biopsy line0] 난포를 횡절단할 수 있도록 위치시켜 난포외벽선이 뚜렷하도록 난소를 조작하여 채란 준비를 하였다.
회수된 난자의 성숙용 배양액은 TCM-199에 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco), Hormone(FSH 10 mg/ml, Estradiol 1 mg/ml)과 항생제 (100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycin)를 첨가하여 39℃, 5% CO와 99% 이상의 습도가 유지된 CO2 배양기에서 18시간 이상 전배양으로 평형을 유도하였다. 체외성숙은 TCM-199 배양액에 회수된 모든 난포란을 난자 세포질의 상태, 난구 세포의 충실도에 따라 Grade I, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ.
2003; Jeong 등, 2009). 회수된 모든 난자를 체외성숙에 제공하였다. 본 실험에 공시된 임신 초기 공란우의 임신황체가 존재 하는 난소의 OPU는 황체 조직 외 에 존재하는 난포를 punc- ture하여 난포란을 흡입하였다.
대상 데이터
공란우 선발은 부산 경남 지역의 우유협동조합에서 제공된 6두의 Holstein 고등 등록된 자우로써 모체의 년간 비유량 유지량, 유단백량의 검정 성적 자료를 이용한 능력을 분석하여분만 경험이 없는 미경산우를 선발, 종축개량협회 선형심사 및 직장 검사에 의한 난소와 자궁 등의 번식 기능의 상태, 질병 감염 등의 기록을 검토하여 최종 선발 이용하였다. 또한 임신 공란 우 2두는 인공수정 후 30일에 직장 검사 및 초음파 검사를 통하여 자궁에 태수 및 태아의 존재를 확인한 후 선발하였다.
등의 기록을 검토하여 최종 선발 이용하였다. 또한 임신 공란 우 2두는 인공수정 후 30일에 직장 검사 및 초음파 검사를 통하여 자궁에 태수 및 태아의 존재를 확인한 후 선발하였다. 공시된 임신 및 미임신 개체의 OPU는 실험 초기 대난포를 제거한 다음 3일 또는 4일 간격으로 10주 동안 주 2회 실시하였고, 임신 유지 및 난소의 상태는 채란 시 직장 및 초음파 기기를 이용하여 임신 유지 여부 검사를 실시하였으며, 또한 최종 임신상태의 검사는 임신 120일에 실시하였다.
2.정액의 선정
선발된 공란우를 기준으로 근친도를 고려하고, 체형 및 유량, 유지방 개량 목적에 부합된 농협중앙회 개량사업소에서 제공되는 종모우 정액을 선정하였다. 선정된 종모우 중 체외수정율 및 배 발달률에 있어서도 각기 다르기 때문에 효율적인 수정란 생산을 위해서 6종류의 정액을 선정 후 최종 3종류의 정액을 선택하여 활용하였다.
종모우 정액을 선정하였다. 선정된 종모우 중 체외수정율 및 배 발달률에 있어서도 각기 다르기 때문에 효율적인 수정란 생산을 위해서 6종류의 정액을 선정 후 최종 3종류의 정액을 선택하여 활용하였다.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 결과들의 값은 mean±SD으로 표시하였으며, 두 그룹 간의 통계학적 분석은 SPSS package(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다(p<0.05).
성능/효과
1. 비임신우 및 임신 초기우에 2회/주 채란으로 비임신우에 서는 68회 채란으로 생성된 난포수는 721개(10.6±3.9)의 난포 를 흡입하여 364개(5.4±3.4)의 난자를 회수하여 50.5%의 회수 율을 보였으나, 임신 초기우에서는 34회 채란으로 441개(13.0±4.3) 생성된 난포를 흡입하여 그 중 261개(7.7±3.6)의 난자가 회수되어 회수율이 59.2%로 유의적으로 높게 나타났다.
2. 초기임신우와 비임신우간의 회수된 난자의 등급은 비임 신우 및 임신우에서 평균 5.4±3.4개 및 7.7±3.6개 희수된 난자 에서 Grade II (평균 2.1±2.1개 및 2.4±2.2개)와 Grade IV(평균 0.8±1.3 및 1.2±1.5개)는 유의적인 차이가 없었으나, Grade I (평균 1.6±1.2 및 2.4±1.3개)과 Grade Ⅲ(평균 0.9±1.4 및 1.6±1.9개)은 유의 차가 있었으며, Grade I, II 등급 출현율는 각각 3.7±2.7개 및 4.9±2.6개로 채취한 임신우에서 유의적으로 높게 나타났다.
3. 임신 초기우 및 비임신우로부터 채취한 난포란을 각 개 체별 체외성숙 및 체외수정 후 배반포의 발생률은 수정 및 분할 률에서 평균 3.3±2.4개, 임신우에서는 평균 4.8±2.3개로 유의적 으로 높게 나타났으나, 이식가능한 배반포 발달은 93개 및 58개, 발달률은 25.5% 및 22.2%로 임신우에서 낮았으며 또한 채란 회수당 평균 배반포 발달에서는 1.4±1.1개 및 1.7±0.9개로 임 신우의 평균 수가 많았으나 유의차는 없었다.
난소는 다른 손으로 직장벽을 통해서 상태, 위치를 확인 및 견인하여 질 내에 있는 탐촉자 선단부에 위치하여 초음파의 모니터 상으로 난포의 상태가 뚜렷한 흑점이 나타나도록 조정 및 고정 후 난포의 개수를 확인하였으며, 채란 가능한난포를 monitor 상의 biopsy line0] 난포를 횡절단할 수 있도록 위치시켜 난포외벽선이 뚜렷하도록 난소를 조작하여 채란 준비를 하였다. 난소의 천자는 일회용 long 주사침(18 G)으로 질벽을 관통하여 복강 내로 들어가고 monitor image의 난소에서 확인된 2~6 mm 크기의 난포 내 및 시술자 감각에 주사침이 난소 및 난포강으로 진입되는 것이 감각적으로 전달됨과 동시에 regulated vacuum pump의 foot switch를 작동시켜 즉 needle의 끝이 난포강으로 진입하는 것을 감각과 monitor image상으로 확인할 수 있었으며, 검게 나타난 난포강의 부위가 monitor 상에서 완전히 사라지고 주사침의 끝이 난포벽에 닿아 음압이 차단될 때까지 계속하여 실시하였다. 흡입 시 주사침을 회전 및 압을 유지하여 잔존 난포액 및 난포란이 모두 흡입되도록 하였다.
2와 같다. 난자 등급은 비임신우 및 임신우에서 평균 5.4± 3.4개 및 7.7±3.6개, 회수된 난자의 Grade U(평균 2.1±2.1개 및 2.4±2.2개)와 Grade IV(평균 0.8±1.3 및 L2±1.5개) 에서는 유의적인 차이가 없었으나, Grade 1(평균 1.6±1.2 및 2.4±1.3 개)과 Grade Ⅲ(평균 0.9±1.4 및 1.6±1.9개)으로 회수된 난자의 등급은 유의차가 있었으며, Grade I, D 등급의 출현율은 각각 평균 3.7±2.7개 및 평균 4.9±2.6개로 임신우에서 유의적으로 높게 나타났다. Garcia 등(1998)이 Holstein 육성우를 이용하여 주 1회 및 2회 반복적 채 란의 효과에서 주당 2회 채란이 효과적이며, 또한 회수된 1, 2 등급 난자의 평균 수 및 품질이 3, 4등급보다 높은 결과는 본 연구의 주당 2회 채란으로 회수된 난자의 등급 비율과 유사하였다.
결과와 같다. 비 임신우의 수정 및 분할률에서 221개(3.3±2.4), 임신우는 158개(4.8±2.3)로 유의적으로 높게 나타났으나, 이식 가능한 배 반포 발달이 93개 및 58개, 발달률은 25.5% 및 22.2%로 임신 초기 개체에서 낮은 비율을 보였으나 유의차는 없었으며, 평균 배반포 발달은 평균 1.4±1.1개 및 1.7±0.9개로 채란 회수당 비 임신우보다 임신우의 평균 수가 높았으나 유의차는 없었다. 임신 초기우에서 Guyader 등(1997), Reinders 등(1996) 및 이 등(1998)에 의한 임신 초기우에서 난포란 채란과 Chaubal 등(2006)이 호르몬 무처리군에서 주 1회 및 2회 채란으로 이식가능한 수정란이 0.
이상의 본 연구의 결과에서 가축의 임신 초기 개체에서도 1주일에 2회 반복적으로 OPU를 실시한 후 체외성숙 및 체외 배양을 통해 반복적으로 이식 가능한 수정란을 생산하였다. 이러한 방법은 가축의 초기 임신우로부터 채란이 가능하므로 개 체의 임신에 대한 불안감을 해소할 수 있으며, 유전적으로 아주 우수한 고능력우를 임신 기간 중에도 공란우로 이용하여 반복적으로 수정란의 생산이 가능하므로 그 이용의 활용도가 높을 것으로 사료된다.
초음파 유도 Holstein 미경산우 생체 내에서 주기적으로 4 두로부터 채 란한 결과는 주 2회 총 68회 반복 채란으로 monitor image에 관찰된 가시난포 721개(회당 10.6±3.9)를 흡입하여 364개(회당 5.4±3.4)의 난자가 회수되어 50.5%의 채 란율을보였으나, 임신된 미경산 임신 초기우 2두에서 34회 채란으로441 개(회당 13.0±4.3)의 가시난포 흡입으로 261 개(회당 7.7±3.6) 의 난자가 회수되어 59.2%의 채란 효율로 임신우가 유의적으로 높게 나타나는 것은 임신된 개체의 초기에 가시난포가 발생하고, 채란 가능하다는 결과가 나타나므로 이로써 임신 초기에 주 2회 연속적 반복적으로 임신 초기 고능력우로부터 생체 내 난포란의 채란이 가능하며, 그 활용의 가치가 높을 것으로 사료된다.
후속연구
9개의 본 연구와 다른 결과를 보였다. 그러나 이러한 결과들은 채란 회수, 방법 및 배양 기법 등이 개선된다면 유전적 능력이 우수한 개체에서보다 많은 이식 가능한 수정 란 생산의 활용도가 높은 것으로 사료된다.
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