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문제 정의
- 본 실험에서 HT-29 세포에 대하여 세포독성을 나타내었던 知母에탄올추출물이 세포사멸에 중요한 인자인 Bcl-2 family 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 western blot을 실시하였다. 실험 결과 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 줄어든 것을 확인 할 수 있었으며 Bid의 단편화 현상도 관찰할 수 있었다.
- 본 실험에서 知母에탄올추출물이 caspase 발현과 cytochrome c 유리 그리고 PARP 분절화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 westernblot를 실시하였다. 실험 결과 pro-caspase-3, -9의 발현양이 줄어든 것과 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c를 확인할 수 있었으며 PARP의 분절화를 관찰할 수 있었다.
- 본 연구에서는 HT-29 세포를 대상으로 知母에탄올추출물에 의한 세포사멸 기전을 조사 하였다. 먼저 HT-29 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시한 결과 농도 의존적으로 세포 생존율이 현저히 감소하였으며 LD50 값은 200 ㎍/mL로 측정되었다.
- 이에 저자는 知母에탄올추출물이 인간 대장암 세포주에서 apoptosis 유도효과와 그 작용기전을 조사하기 위하여 세포생존율, 세포의 형태학적 변화, apoptosis 관련 단백질을 조사하였다.
제안 방법
- 5. 知母에탄올추출물에 의해 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c를 확인하였다.
- HT-29 세포에 知母에탄올추출물을 각각 100 ㎍/mL, 150 ㎍/mL를 처리하고 24시간 배양한 후 염색하였다. 대조군에서는 apoptosis의 특징적인 형태가 관찰되지 않았으나(Fig.
- PBS로 세포단층을 씻어낸 후 4% formaldehyde로 실온에서 30분 동안 세포를 고정하고 PBS로 3회 세척하였다. Hoechst 33258의 최종 농도가 2 ㎍/mL이 되도록 PBS에 희석하여 세포에 첨가하고 30분 동안 어두운 곳에서 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
- 5 ㎎/mL이 되도록 처리하고 3시간 배양하였다. MTT 용액을 처리한 배지를 제거하고 실온에서 건조시킨 후 DMSO로 용해시켜 ELISA reader(Bio-TEK, Winooski, USA)를 이용하여 540 nm파장의 흡광도를 측정하였다.
- 전기영동이 끝난 후 polyvinylidene difluoride membrane(Millipore, Bedford, MA, USA)에 전이시켰다. Membrane은 5% skim milk-TBST(20 mMTris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking하고, Bcl-2, Bax, Bid, pro-caspase-3, pro-caspase-9, cytochromec, PARP 등의 측정하고자 하는 1차 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 실온에서 2시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 이차항체 antigoat, anti-rabbit, anti-mouse IgG conjugatedhorse-radish peroxidase와 1시간 반응시켰다.
- TBST로 3회 세척한 후 이차항체 antigoat, anti-rabbit, anti-mouse IgG conjugatedhorse-radish peroxidase와 1시간 반응시켰다.TBST로 3회 세척 후 WEST-ZOLⓇ(plus) Western blot detection system(iNtRON, Korea)을 사용하여 ChemiDoc으로 촬영하였다.
- 1% Tween 20)에서 1시간 동안 blocking하고, Bcl-2, Bax, Bid, pro-caspase-3, pro-caspase-9, cytochromec, PARP 등의 측정하고자 하는 1차 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 실온에서 2시간 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 이차항체 antigoat, anti-rabbit, anti-mouse IgG conjugatedhorse-radish peroxidase와 1시간 반응시켰다.TBST로 3회 세척 후 WEST-ZOLⓇ(plus) Western blot detection system(iNtRON, Korea)을 사용하여 ChemiDoc으로 촬영하였다.
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후 western blot을 시행 하였다. 실험 결과 농도 의존적으로 cytochrome c의 방출이 증가된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후 western blot을 이용하여 확인 하였다. 실험 결과 知母에탄올추출물에 의한 pro-caspase-3, -9은 농도 의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 처리한 후 48시간동안 배양하고 western blot을 이용하여 확인 하였다. 실험 결과 Bax의 발현에는 변화가 없었지만 Bcl-2 단백질의 발현양이 농도 의존적으로 감소하였고, Bid의 단편화 현상도 확인할 수 있었다(Fig.
- Apoptosis의 특징으로는 세포의 수축, 세포막 박리, 포스파티딜 세린의 외부로의 노출, 핵의 응축과 분절 등이 있다. 知母에탄올추출물을 처리 하였을 때 핵의 응축과 분절이 일어났는지 확인하기 위하여 Hoechst 33258 염색을 실시하였다.
- 知母에탄올추출물이 HT-29세포의 생존률에 미치는 영향을 조사하기 위하여 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하고 24, 48시간 배양 하였다. 배양 후 MTT를 3시간 처리하였으며 세포내에 형성된 formazan은 DMSO로 용해하여 측정하였다.
- 서구화 되는 식생활과 과도한 스트레스, 불규칙적인 생활습관으로 인하여 발생율이 점차 증가하고 있는 대장암에 대하여 효과적인 항암물질을 개발하고자 사람의 대장암 세포주인 HT-29 세포를 이용하여 천연물질인 知母에탄올추출물의 세포생존율과 형태학적인 변화, 그리고 apoptosis 관련 단백질 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 그리고 Hoechst 332858 염색을 통하여 세포의 형태학적인 모습을 관찰한 결과 apoptosis의 형태학적 특징인 세포 수축, 핵의 응축 및 분절을 유도하여 apoptoticbody 형성을 일으키는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 知母에탄올추출물에 의한 HT-29 세포독성은 apoptosis를 통한 세포사멸인지 예상할 수 있었으며 따라서 western blot 통해 apoptosis 관련 단백질을 조사 하였다.
대상 데이터
- RPMI 1640, fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic, trypsin-EDTA은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서, bovine serum albumin(BSA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), dimethylsulfoxide(DMSO), phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), leupeptin, aprotinin, N,N,N',N'-tetrametylethylenediamine(TEMED)는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- The proportion of survival cells was measured by MTT assay. The experiments were performed in triplicate. Data presented as means ± S.
- (San Francisco, CA, USA)에서 구입하였다. 단백질 정량 시약은 Bio-Rad(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 知母는 경북 영천시 화산면에서 생산된 제품을 삼홍 건재약업사(서울)에서 구입한 것을 사용하였다.
- 분양받은 HT-29 세포는 10% FBS, 100 units/mL penicillin, 100 ㎍/mL streptomycin, 0.25 ㎍/mL amphotericin B를 첨가한 RPMI 1640을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 그리고 48시간 주기로 배양액을 교체하여 주었으며 0.
- 知母 200g에 에탄올 2L를 가하여 실온에서 sonication 시킨 후 3일간 추출한 것을 일차로 거즈 여과 한 다음 filter paper로 vacuum pump를 이용하여 여과하였다. 여과된 知母 추출물을rotary evaporator로 감압 농축하여 4.49 g(수득율: 2.25%)의 건조된 추출물을 얻어 시료로 사용하였다. 지모 에탄올추출물 시료는 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO는 최종 0.
- 원심분리기(centrifuge HA-12, micro 17TR centrifuge), clean bench, CO2 incubator는 한일 기기(Inchun, 한국)사 제품을, ELISA reader는 Bio-TEK(Winooski, USA)사 제품을, electrophoresis power supply는 Amersham(Buckinghanshire, England)사 제품을, ChemiDoc image analysis는 Bio-Rad(CA, USA)사 제품을 사용하였다.
- 인간 대장암 유래 세포인 HT-29 세포주는 한국 세포주 은행(서울)에서 구입하여 사용하였다.
- 25%)의 건조된 추출물을 얻어 시료로 사용하였다. 지모 에탄올추출물 시료는 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO는 최종 0.01% 이하의 농도 범위에서 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복하였으며, 분석 수치는 mean ± S.D로 나타내었고, 통계분석은 ANOVA Test에 의해 분석되었다.
이론/모형
- 개씩 부착시키고 知母에탄올추출물을 처리하여 48시간 배양하였다. 배양된 세포를 모두 수거하여 lysisbuffer(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EGTA, 2 mM PMSF, 10 ㎍/mL leupeptin, 10 ㎍/mL aprotinin)로 4℃에서 60분간 용해시킨 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 세포 용해액은 Bradford 방법을 이용하여 단백질정량을 하였다. 동량의 세포 용해액(단백질 100 ㎍)은 2×sample buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 끓인 후 12% SDS-polyacrylamide gel에 전기영동 하여 단백질을 분리하였다.
성능/효과
- 1. 知母에탄올추출물은 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였다.
- 2. 知母에탄올추출물은 apoptosis의 특징 중 하나인 핵의 응축이 관찰되었다.
- 3. 知母에탄올추출물에 의해 pro-caspase-3, -9의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다.
- 4. 知母에탄올추출물은 anti-apoptotic 신호기전인 Bcl-2의 발현을 감소 시켰고 homology domain(BH) 3-only protein인 Bid의 단편화 현상을 유도하였다.
- 먼저 HT-29 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시한 결과 농도 의존적으로 세포 생존율이 현저히 감소하였으며 LD50 값은 200 ㎍/mL로 측정되었다. 그리고 Hoechst 332858 염색을 통하여 세포의 형태학적인 모습을 관찰한 결과 apoptosis의 형태학적 특징인 세포 수축, 핵의 응축 및 분절을 유도하여 apoptoticbody 형성을 일으키는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 知母에탄올추출물에 의한 HT-29 세포독성은 apoptosis를 통한 세포사멸인지 예상할 수 있었으며 따라서 western blot 통해 apoptosis 관련 단백질을 조사 하였다.
- 본 연구에서는 HT-29 세포를 대상으로 知母에탄올추출물에 의한 세포사멸 기전을 조사 하였다. 먼저 HT-29 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시한 결과 농도 의존적으로 세포 생존율이 현저히 감소하였으며 LD50 값은 200 ㎍/mL로 측정되었다. 그리고 Hoechst 332858 염색을 통하여 세포의 형태학적인 모습을 관찰한 결과 apoptosis의 형태학적 특징인 세포 수축, 핵의 응축 및 분절을 유도하여 apoptoticbody 형성을 일으키는 것을 확인 할 수 있었다.
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후 western blot을 시행 하였다. 실험 결과 116 kDa의 PARP 단백질이 89 kDa으로 분절된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 처리한 후 48시간동안 배양하고 western blot을 이용하여 확인 하였다. 실험 결과 Bax의 발현에는 변화가 없었지만 Bcl-2 단백질의 발현양이 농도 의존적으로 감소하였고, Bid의 단편화 현상도 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 본 실험에서 HT-29 세포에 대하여 세포독성을 나타내었던 知母에탄올추출물이 세포사멸에 중요한 인자인 Bcl-2 family 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 western blot을 실시하였다. 실험 결과 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현이 줄어든 것을 확인 할 수 있었으며 Bid의 단편화 현상도 관찰할 수 있었다. 하지만 proapoptotic 단백질인 Bax의 발현에는 아무런 변화가 관찰되지 않았다.
- 본 실험에서 知母에탄올추출물이 caspase 발현과 cytochrome c 유리 그리고 PARP 분절화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 westernblot를 실시하였다. 실험 결과 pro-caspase-3, -9의 발현양이 줄어든 것과 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c를 확인할 수 있었으며 PARP의 분절화를 관찰할 수 있었다. 이는 내인성 경로인 미토콘드리아를 경유하여 세포사멸을 일으키는 것으로 예상된다.
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후 western blot을 이용하여 확인 하였다. 실험 결과 知母에탄올추출물에 의한 pro-caspase-3, -9은 농도 의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 배양 후 MTT를 3시간 처리하였으며 세포내에 형성된 formazan은 DMSO로 용해하여 측정하였다. 실험 결과 知母에탄올추출물에 의한 세포증식은 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도에서 24시간 후 87%, 84%, 80%, 73%, 64% 48시간 후 87%, 77%, 66%, 48%, 41%로 나타났다(Fig. 1).
- 知母에탄올추출물을 100, 150, 200 ㎍/mL 농도로 처리하고 48시간 배양한 후 western blot을 시행 하였다. 실험 결과 농도 의존적으로 cytochrome c의 방출이 증가된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 이상의 결과 知母에탄올추출물은 사람의 대장암세포주인 HT-29 세포에서 농도 의존적인apoptosis를 유발하였으며 이는 미토콘드리아/caspase 경로에 의한 것임을 알 수 있었다
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