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문제 정의
- 본 연구는 유리화법에 기반을 둔 동결보존에 있어서 생존율에 영향하는 주요 요인인 신초의 전배양조건, 로딩용액 및 유리화용액의 조성, PVS3 용액에서의 탈수시간 등을 최적화하고자 수행하였다.
- 본 연구는 작은방울-유리화법에 기초하여 국화 신초 정아의 초저온동결보존 프로토콜을 개발하고자 실시하였다. 작은방울-유리화법은 작은방울-동결법과 유리화법을 혼합한 형태의 기술로서 최근 각광받고 있다.
제안 방법
- 국화 기내 유식물 정아의 시료채취를 위한 최적 계대배양 주기를 구명하고자 마디배양기간에 따른 동결보존 전(-LN)⋅후(+LN)의 생존율(surv)과 재생율(rege)을 조사하였다(Fig. 1).
- 국화 기내 유식물 정아의 전배양(pre-culture) 조건에 따른 동결보존 전(-LN) 후(+LN)의 생존율(surv)과 재생율(rege)을 조사하였다. 0.
- 3), 동결보존 후의 생존율은 31시간, 55시간, 7시간, 79시간의 순으로 높은 생존율을 보인 반면, 재생율에서는 79시간, 55시간, 31시간 간에는 유의성이 인정되지 않았고, 7시간 처리구에서는 가장 낮은 재생율을 나타냈다. 그러나 79시간, 55시간 처리구에서는 다신초의 형성빈도가 높고 다소 얼음 든 것처럼 자란 신초가 많은 반면, 31시간 처리에서는 무처리구와 비슷하게 정상 생장을 하였기 때문에 0.3 M sucrose 31시간을 최적조건으로 선정하였다.
- 동결보존 2주 배양 후 녹색을 띤 신초가 3 mm 이상 나온 개체를 생존한 것으로 조사하였고, 재생율은 재생배양 6주 후 유식물체(10 mm 이상)를 형성한 개체의 비율을 조사하였다. 생존율 및 재생율 조사는 처리당 10-15개 신초씩 4반복 실험한 평균±표준편차로 표시하였다.
- peak) 기내유식물의 정아를 이용하였다. 마디를 적출하여 0.15 mg/L indole acetic acid(IAA) + 0.02 mg/L zeatin이 첨가된 MS 배지에서 25℃, 16시간 일장으로 7주 배양한 후 정아(길이 2 mm, 폭 1-1.5 mm)를 적출하였다. 정아를 0.
- 작은방울-유리화법은 작은방울-동결법과 유리화법을 혼합한 형태의 기술로서 최근 각광받고 있다. 본 연구에서 최적의 동결보존 조건은 다음과 같이 정아 적출 후 점진적으로 sucrose 용액의 농도를 올리는 전배양, 로딩 및 탈수를 거친 후 알루미늄 호일에 얹어서 액체질소에 직접 급속동결하여 보존했다가 열을 가한 언로딩 용액에 직접 침지하여 해동하는 방법이었다. 정아의 적정 적출시기는 계대배양 4주 후였고, 정아의 최적 전배양 조건은 0.
- 8 M sucrose)에 직접 침지한 다음 추가로 차가운 언로딩 용액을 부어 40분간 유지하였다. 신초를 꺼내서 멸균한 여과지 위에서 물기를 제거한 다음 재생배양배지(MS 배지 + 0.1 mg/L IAA + 0.3 mg/L zeatin + 0.05 mg/L GA3 + 15 mg/L putrescine + 30 g/L sucrose + 2.0 g/L Phytagel (pH 5.8))에서 25℃에 초기 5-7일간은 암상태에서 이 후에는 16시간 일장으로 배양하였다.
- 전배양 한 국화 신초를 로딩용액(MS 배지 + 2 M glycerol + 0.6 M sucrose)에 실온에서 40분간 배양한 다음 유리화 용액인 PVS2(30% w/v glycerol + 15% w/v ethylene glycol + 15% w/v DMSO + 13.7% w/v sucrose)에 25분 또는 PVS3(50% w/v glycerol + 50% w/v sucrose)에 90분간 탈수처리하였다. 알루미늄호일 절편 위에 탈수처리한 신초를 얹어서 액체질소에 직접 침지하였고 적어도 24시간 이상 저장하였다.
대상 데이터
- 국화(Dendranthema grandiflora Tzelev cv. peak) 기내유식물의 정아를 이용하였다. 마디를 적출하여 0.
데이터처리
- 생존율 및 재생율 조사는 처리당 10-15개 신초씩 4반복 실험한 평균±표준편차로 표시하였다.
- 생존율 및 재생율 조사는 처리당 10-15개 신초씩 4반복 실험한 평균±표준편차로 표시하였다. 통계처리는 SAS 9.1 프로그램을 이용한 t-검정 결과를 95% 유의수준(P＜0.05)에서 분석하였다.
성능/효과
- 0.3 M sucrose와 0.7 M sucrose의 2단계 전배양 체계에서 0.3 M sucrose에서의 배양시간을 31시간으로 고정하고 0.7 M sucrose에서의 배양시간을 비교한 결과(Fig. 2), 동결보존 전(-LN)⋅후(+LN) 모두 17시간 처리구에서 가장 높은 63%, 41.6%의 재생율을 보였고 7시간 또는 31시간 처리구는 재생율이 낮아졌고 무처리 구에서는 10%의 가장 낮은 재생율을 나타냈다.
- 1). PVS3 유리화용액에서 90분간 탈수시킨 탈수-LN 무처리(-LN)에서는 계대배양 4주 처리구에서 100%의 생존율과 86.3%의 재생율로써 가장 양호하였고, 배양기간이 길어질수록 감소하였다. 동결보존 후에는 4주와 5.
- 이와 같은 경향은 감자에서도 보고된 바 있다(Yoon 등, 2006). 국화의 정아는 삼투스트레스에 민감하여 0.3-0.5-0.7 M sucrose의 3단계 전배양조건에서 가장 양호한 재생율을 보였으며, PVS2 유리화용액의 화학적 독성에도 매우 민감하여 PVS3 유리화용액에서 가장 높은 재생율을 보였다.
- 3%의 재생율로써 가장 양호하였고, 배양기간이 길어질수록 감소하였다. 동결보존 후에는 4주와 5.5주의 생존율(87.7%, 85.4%)과 재생율(66.7%, 64.6%)이 가장 높았고, 7주, 8.5주로 길어질수록 재생율이 감소하였다.
- 8). 동결보존 후의 생존율과 재생율은 탈수시간이 길어질수록 증가하여 90분 처리구에서 각각 89.4%와 45.6%로 가장 높았다가 120-150분 처리구에서는 다시 감소하였다. 탈수시간 60분까지는 주로 결빙형성에 의한 동결장해 때문에 생존율과 재생율이 감소하였고, 90분 이상의 탈수처리에서는 동결보호제의 독성이 생존율과 재생율 저하의 주요 원인인 것으로 여겨진다.
- 05). 동결보존 후의 재생율에서는 2 M glycerol + 0.5-0.6 M sucrose 용액이 가장 높았으며, PVS3 유리화용액의 희석액 중에서는 35-40% 희석액이 가장 높은 재생율을 보였다(그림 5).
- 앞의 실험 결과 선발된 PVS3 유리화용액에서의 탈수시간에 따른 생존율과 재생율을 비교한 결과, 탈수시간이 길어질수록 탈수처리한 국화 신초의 재생율이 감소하여 90분 이후에는 재생율이 급감하였다(Fig. 8). 동결보존 후의 생존율과 재생율은 탈수시간이 길어질수록 증가하여 90분 처리구에서 각각 89.
- 한편, 10℃에서의 저온처리(P3-cold)는 동결보존 전⋅후의 생존율 및 재생율 향상에 효과가 인정되지 않았다. 앞의 실험결과 가장 효과적이었던 PVS3 용액의 glycerol과 sucrose 조성을 달리하여 비교한 결과, 50% glycerol + 50% sucrose이 95%의 생존율과 55.6%의 재생율로써 가장 양호하였다(Fig. 7). 전체적으로 동결보존 전(-LN)과 후(+LN) 모두 전체 농도 100% > 90% > 80% 순으로 높은 재생율을 보였고, 동일한 농도에서는 glycerol과 sucrose의 농도가 1:1로 균형을 맞춘 용액들이 높은 재생율을 보였다.
- 위 실험의 결과에 따라 0.7 M sucrose에서의 배양시간을 17시간으로 고정시키고 0.3 M sucrose에서의 배양시간을 비교한 결과(Fig. 3), 동결보존 후의 생존율은 31시간, 55시간, 7시간, 79시간의 순으로 높은 생존율을 보인 반면, 재생율에서는 79시간, 55시간, 31시간 간에는 유의성이 인정되지 않았고, 7시간 처리구에서는 가장 낮은 재생율을 나타냈다. 그러나 79시간, 55시간 처리구에서는 다신초의 형성빈도가 높고 다소 얼음 든 것처럼 자란 신초가 많은 반면, 31시간 처리에서는 무처리구와 비슷하게 정상 생장을 하였기 때문에 0.
- 6%의 재생율을 보였고 7시간 또는 31시간 처리구는 재생율이 낮아졌고 무처리 구에서는 10%의 가장 낮은 재생율을 나타냈다. 이 결과는 동결보존 후의 재생을 위해 0.7 M sucrose 용액에서의 배양이 필수적이라는 점과 이 용액에서의 삼투스트레스가 심해서 배양시간이 1일 이상으로 길어질수록 오히려 재생율이 감소한다는 것을 보여준다.
- 특히, 현재 식물 동결보존에 가장 널리 사용되고 있는 PVS2 용액(30% glycerol + 15% DMSO + 15% ethylene glycol + 14% sucrose)은 동결보존 전과 후 모두 가장 낮은 생존율을 보였고, 동결보존 후의 재생율도 현저히 낮았다. 이 결과로 보아 PVS2 용액이 동결보호제의 화학적인 독성이 심해서 국화 신초에 적합하지 않음을 알 수 있다.
- 저독성, 고효율의 유리화용액을 선발하기 위해 PVS2 및 변형용액에 25분 또는 PVS3 및 변형용액에 90분 탈수처리한 결과, 탈수-LN 무처리에서는 두 용액 그룹간의 재생율에 유의한 차이가 인정되지 않았으나, 동결보존 후에는 PVS3(50% glycerol + 50% sucrose)와 변형용액(90% PVS3)이 각각 41.6%와 36.4%의 재생율을 보여 각각 12.0%와 26.8%를 보인 PVS2 및 PVS2 변형용액(35% glycerol +15% DMSO + 15% ethylene glycol + 25% sucrose) 보다 높은 재생율을 보였고 신초형성도 다소 빨랐다(Fig. 6). 특히, 현재 식물 동결보존에 가장 널리 사용되고 있는 PVS2 용액(30% glycerol + 15% DMSO + 15% ethylene glycol + 14% sucrose)은 동결보존 전과 후 모두 가장 낮은 생존율을 보였고, 동결보존 후의 재생율도 현저히 낮았다.
- 전배양에 의한 삼투스트레스를 줄이기 위해 0.5 M sucrose를 추가한 0.3 M - 0.5 M - 0.7 M sucrose 용액에서의 3단계 전배양 체계에서는 탈수 후 동결보존 전(-LN)과 후(+LN)에 모두 32-12-6시간 및 32-0-18시간 처리구에서 가장 높은 재생율을 보였으며, 특히 32-12-6 시간 처리구에서는 다신초 형성이 줄어들고 무처리와 유사한 정상 개체로 생장하였다(Fig. 4). 0.
- 전체적으로 동결보존 전(-LN)과 후(+LN) 모두 전체 농도 100% > 90% > 80% 순으로 높은 재생율을 보였고, 동일한 농도에서는 glycerol과 sucrose의 농도가 1:1로 균형을 맞춘 용액들이 높은 재생율을 보였다.
- 전체적으로 동결보존 전(-LN)과 후(+LN) 모두 전체 농도 100% > 90% > 80% 순으로 높은 재생율을 보였고, 동일한 농도에서는 glycerol과 sucrose의 농도가 1:1로 균형을 맞춘 용액들이 높은 재생율을 보였다. 특히, glycerol과 sucrose의 농도가 균형을 잃은 용액들의 경우 탈수처리까지만 한 탈수-LN 무처리구(-LN)에서도 낮은 재생율을 보인 것으로 보아 유리화용액의 독성이 재생율 저하의 주요 원인이며 glycerol과 sucrose의 균형이 중요함을 알 수 있었다.
- 6). 특히, 현재 식물 동결보존에 가장 널리 사용되고 있는 PVS2 용액(30% glycerol + 15% DMSO + 15% ethylene glycol + 14% sucrose)은 동결보존 전과 후 모두 가장 낮은 생존율을 보였고, 동결보존 후의 재생율도 현저히 낮았다. 이 결과로 보아 PVS2 용액이 동결보호제의 화학적인 독성이 심해서 국화 신초에 적합하지 않음을 알 수 있다.
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