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문제 정의
- Korea)를 사용하여 30,000 psi의 압력으로 5 cycle을 진행하여 나노입자 크기로 분산된 TDS 용액을 얻었다. 고압균질 공정을 통해 제조한 TDS 나노입자 용액 속에 안정하게 분산되어 있는 TDS 분말의 함유량을 확인하기 위해 안정성을 측정하여 보았다. 대조군으로는 일반 증류수를 사용하였으며, 실험군으로는 고압균질 공정을 통해 TDS 나노입자 용액의 분말 농도를 6.
- 이에 본 연구에서는 앞에서 설명한 것처럼 항균효능 (Kim et al., 2005)이 보고된 비타민 B1의 유도체 (Thiamine Dilauryl Sulfate : TDS)를 제조하여 새로운 생화학농약으로서의 개발 가능성을 검토하기 위해 TDS 분말을 고압 균질기를 통해 나노입자크기로 수용액속에 분산시킨 solution을 제조하여 고추탄저병에 대한 항균활성을 연구하였다.
- , 2009). 이와 같은 시대의 흐름과 일맥상통하여 항균효능이 보고된 비타민 B1의 유도체를 제조하여 작물병 발생 병원균에 대한 항진균 효능을 측정해 보았다.
제안 방법
- 5, 25, 50, 100 ㎎/㎖ 로 제조하였고, 공정을 처리 하지 않고 증류수에 TDS 분말을 같은 농도별로 넣은 TDS crude를 제조하여 사용하였다. 96 well plate에 각각의 sample을 200 ㎕ 씩 첨가하여 230 ㎚에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 TDS 나노입자 용액 속에 분산되어 있는 TDS 분말의 함유량을 TDS crude와 비교하였다.
- TDS 나노입자 용액이 Colletotrichum gloeosporioides 균사의 사멸을 유도하는 기작을 확인하기 위해서 균사와 TDS 나노입자 용액과 동시에 배양한 배양액을 현미경 (ZEISS AXIOSKOP MICROSCOPE, GERMANY)을 통하여 관찰하였다. TDS 나노입자 용액의 작용기작을 비교하기 위해서 TDS 나노입자 용액을 첨가하지 않은 일반적인 Colletotrichum gloeosporioides의 균사와 TDS 나노입자 용액을 첨가하여 동시에 배양한 Colletotrichum gloeosporioides 균사를 관찰하여 비교하였다.
- TDS 나노입자 용액이 Colletotrichum gloeosporioides 균사의 사멸을 유도하는 기작을 확인하기 위해서 균사와 TDS 나노입자 용액과 동시에 배양한 배양액을 현미경 (ZEISS AXIOSKOP MICROSCOPE, GERMANY)을 통하여 관찰하였다. TDS 나노입자 용액의 작용기작을 비교하기 위해서 TDS 나노입자 용액을 첨가하지 않은 일반적인 Colletotrichum gloeosporioides의 균사와 TDS 나노입자 용액을 첨가하여 동시에 배양한 Colletotrichum gloeosporioides 균사를 관찰하여 비교하였다.
- 강원도지역 및 국내에서 재배·생상량이 높은 시설작물에서 빈도수가 높게 발생하는 식물병 방제를 위한 비타민 B1 유도체의 항진균 test를 통해 생화학농약 개발 가능성을 검토하기 위하여 thiamine hydrochloride와 sodium lauryl sulfate의 반응을 통하여 비타민 B1 유도체를 제조하였다.
- 전처리 과정을 통해 이온 코팅된 시료는 진공관 안에서 전자를 주사하여 선명한 이미지를 관찰하는데 이용된다. 고압균질 공정을 통해 제조한 비타민 B1 유도체 나노입자 용액의 입자 형태를 SEM을 통해 관찰하였다.
- 그리고 제조된 TDS 용액 속 입자의 형태학적 관찰을 위해 저진공주사현미경 (Low Vacuum-Scanning Electron, × 400)으로 관찰하였다.
- 고압균질 공정을 통해 제조한 TDS 나노입자 용액 속에 안정하게 분산되어 있는 TDS 분말의 함유량을 확인하기 위해 안정성을 측정하여 보았다. 대조군으로는 일반 증류수를 사용하였으며, 실험군으로는 고압균질 공정을 통해 TDS 나노입자 용액의 분말 농도를 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎎/㎖ 로 제조하였고, 공정을 처리 하지 않고 증류수에 TDS 분말을 같은 농도별로 넣은 TDS crude를 제조하여 사용하였다. 96 well plate에 각각의 sample을 200 ㎕ 씩 첨가하여 230 ㎚에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 TDS 나노입자 용액 속에 분산되어 있는 TDS 분말의 함유량을 TDS crude와 비교하였다.
- 본 실험에 사용한 비타민 B1 유도체의 제조방법은 먼저 Thiamine hydrochloride (SIGMA, USA) 70g을 100 ㎖ 의 증류수에 넣고, 상온에서 용해시킨 후 5 ㎛ 의 filter paper (MACHEREY-NAGEL, GERMANY)로 여과시킨다. 그리고 Sodium lauryl sulfate (SIGMA, USA)의 경우 70g에 증류수 100 ㎖ 에 넣고, 70℃의 water bath에서 용해시킨 후 7 ㎛ filter paper (MACHEREY- NAGEL, GERMANY)로 여과 시킨다.
- , 2009)의 방법을 변형하여 하였으며, 실험군으로는 수용액 상태가 아닌 TDS 분말과 고압 균질기를 통해 50, 100 ㎎/ℓ 의 농도로 제조한 TDS 나노입자 용액을 사용하였으며, 각각의 sample들은 PDA 배지 제조 시 함께 첨가하여 주었다. 실험에 사용한 균주는 5일 동안 27℃, 암조건에서 배양한 Colletotrichum gloeosporioides를 직경 0.5 ㎝ 의 크기로 colony를 잘라 사용하였으며, 농도별 TDS가 함유된 각각의 배지 한가운데에 접종한 후 하루 단위로 colony의 직경을 측정하여 TDS 나노입자 용액이 colony의 성장을 억제하는지 비교하였으며 각 처리군 당 3회의 반복실험을 실시하여 관찰하였으며, 아래 공식에 의하여 균사생장 억제율을 측정하였다.
- 앞서 실행한 항진균 활성 평가로 TDS 나노입자 용액의 생장 억제 활성을 알아보았으며 이러한 Colletotrichum gloeosporioides 균사의 사멸 기작을 관찰하기 위하여 현미경을 통하여 촬영하였다. Fig.
- 여과 시킨 각각의 용액을 섞은 후 15℃의 온도에서 냉각 반응을 진행 후 1000 rpm, 15℃로 설정 된 초고속원심 분리기 (CP100MX, Hitachi, Japan)에서 원심분리를 진행한다. 원심분리가 끝난 시료를 1시간 동안 30℃에서 수분을 제거하여 파우더 상태의 TDS를 제조하였다.
- 제조된 TDS 분말 10 g을 60% (v/v)주정 100 ㎖ 에 녹인 후, 이 TDS solution 1 ㎖를 499 ㎖의 증류수에 넣어 석출되는 물질이 없는지 관찰하였다. Magnetic bar를 이용하여 800rpm의 교반속도로 1시간 교반을 진행하였다.
- 배지는 감자한천배지 (Potato Dextrose Agar, PDA)를 사용하였고 배양조건을 27,℃ 암조건에서 배양하여 실험에 사용하였다. 항진균 활성 측정은 고 등 (Ko et al., 2009)의 방법을 변형하여 하였으며, 실험군으로는 수용액 상태가 아닌 TDS 분말과 고압 균질기를 통해 50, 100 ㎎/ℓ 의 농도로 제조한 TDS 나노입자 용액을 사용하였으며, 각각의 sample들은 PDA 배지 제조 시 함께 첨가하여 주었다. 실험에 사용한 균주는 5일 동안 27℃, 암조건에서 배양한 Colletotrichum gloeosporioides를 직경 0.
대상 데이터
- 실험에 사용한 식물병원균인 고추탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides, KACC 40690, Korea)은 강원도 농업 기술원으로부터 분양받은 균주를 사용하였다. 배지는 감자한천배지 (Potato Dextrose Agar, PDA)를 사용하였고 배양조건을 27,℃ 암조건에서 배양하여 실험에 사용하였다. 항진균 활성 측정은 고 등 (Ko et al.
- 실험에 사용한 식물병원균인 고추탄저병균 (Colletotrichum gloeosporioides, KACC 40690, Korea)은 강원도 농업 기술원으로부터 분양받은 균주를 사용하였다. 배지는 감자한천배지 (Potato Dextrose Agar, PDA)를 사용하였고 배양조건을 27,℃ 암조건에서 배양하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 실험값의 통계는 SPSS package program의 paired t-test로 검정하였으며 모든 실험값은 평균 ± 표준오차 (Mean ± standard error)로 나타내었다.
성능/효과
- DLS의 원리는 입자가 센서를 통과할 때 용액 중에 들어 있는 입자들에 의해 광원 (laser)에서 조사하는 빛이 차단되어 광량 변화가 발생하고, 이러한 변화는 detector에 의해 측정되어 전기적인 신호인 펄스 (pulse)로 표시되고 측정된 펄스의 크기와 개수를 이용하여 입자의 크기와 개수를 산출하는 원리이다. DLS 측정 결과 고압균질 공정을 거친 TDS 나노입자 용액의 평균적인 입자 크기는 258.6 크기로 나타났다. 이러한 결과는 고압균질기 공정을 통해 30,000 psi의 높은 압력으로 인해 발생하는 에너지가 TDS 분말에 전달되어 나노크기로 균질화 시킨 것으로 사료된다.
- 1은 고압균질 공정을 통해 제조한 TDS 나노입자 용액을 공정을 처리하지 않고 TDS 분말을 증류수에 넣어 제조한 TDS crude와 비교하여 안정성을 측정한 그림이다. TDS 용액은 특정 파장인 230 ㎚ 에서 흡광도를 나타내었으며, 일반 TDS 용액의 흡광도는 농도별로 큰 차이 없이 거의 일정하였으며 최고 농도인 100 ppm에서 3.212로 대조군인 증류수의 흡광도인 3.195와 비교하여 차이가 거의 없었다. 따라서 공정을 처리하지 않은 TDS crude 용액 속에는 TDS 분말이 분산 되어 있지 않고 모두 가라앉아 수용액상에 함유되어 있지 않은 것으로 사료된다.
- 따라서 공정을 처리하지 않은 TDS crude 용액 속에는 TDS 분말이 분산 되어 있지 않고 모두 가라앉아 수용액상에 함유되어 있지 않은 것으로 사료된다. 고압균질 공정을 통해 제조한 TDS 나노 입자 용액은 TDS 분말의 농도가 증가할수록 흡광도가 증가하는 경향을 나타내었다. 최고 농도인 100 ppm의 흡광도는 3.
- 5는 TDS 나노입자 용액에 의해 사멸된 Colletotrichum gloeosporioides의 균사를 현미경으로 관찰한 사진으로 A는 일반적인 Colletotrichum gloeosporioides의 균사를 관찰한 사진이고, B는 배지에 TDS 나노입자 용액을 함께 첨가하여 배양한 Colletotrichum gloeosporioides의 균사를 관찰한 사진이다. 관찰 결과 그림에서 보는 것처럼 TDS 나노입자들이 Colletotrichum gloeosporioides의 균사의 세포벽에 달라붙어 생장을 저해하고 있는 것을 볼 수 있다. 이와 같은 결과는 효과가 거의 없는 TDS powder와 crude에 비해 TDS 나노입자 용액은 나노 크기의 작은 입자로 제조되었기 때문에 넓은 표면적으로 균사의 세포벽에 달라붙을 수 있으며, 균사속에서 오래 머물 수 있는 잔류성이 증가하여 세포벽 안으로 침투하는 TDS의 효율을 높여 병원균 균사의 생장 저해에 더 높은 효과를 나타내는 것으로 사료되며 이러한 작용기작은 고추냉이를 나노 입자화함으로써 항균활성을 증진시킨 연구에 보고되어있다 (Seo et al.
- 3에 나타내었다. 그림에서 보는 것과 같이 TDS 나노입자 용액의 농도를 50, 100 ppm으로 제조 하여 사용하였고, 대조군과 비교하여 모든 농도에서 균사 생장을 억제하는 효과를 나타낸 것을 볼 수 있었으며 농도가 증가함에 따라 생장 억제효과도 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 일반 TDS powder의 최고농도인 100 ㎎ 의 억제 효과는 더 낮은 농도인 50 ppm의 TDS 나노입자 용액의 억제효과 보다 낮게 나타내었다.
- , 2010). 또한 이러한 나노 입자를 이용한 병원균의 사멸 시 powder 보다 적은양의 사용으로도 효율을 증가시킬 수 있으며 powder 사용으로 인한 문제점인 손실율도 줄일 수 있을 것으로 사료되며 본 연구에서 실험한 TDS 나노입자 용액의 농도인 100 ppm의 농도는 비타민 B1의 항진균 활성을 나타낸 농도인 250 ppm의 농도보다 훨씬 적은 농도로도 뛰어난 항진균 활성을 나타낸 것을 알 수 있었다 (Lee, 2002). 본 연구를 통한 고압균질 공정을 통한 TDS의 나노입자 용액 제조는 이전에 보고되었던 아미노글리코시드계 항생제를 이용한 식물병 방제제를 제조하는 연구 (Kim, 2000)에서 Colletotrichum gloeosporioides에 대한 항진균 활성을 갖지 않는 결과와 비교하여 본 연구에서는 뛰어난 항진균 활성을 나타낸 것으로 보아 고추탄저병에 선택적으로 적용시킬 수 있을 것으로 사료된다.
- 9%의 억제율을 나타낸 100 ppm 농도의 TDS 나노입자 용액으로 측정되었다. 또한 최고 농도인 100ppm인 일반 TDS powder보다 더 낮은 농도인 50 ppm 농도의 TDS 나노입자 용액의 억제율이 17% 이상 높은 결과를 나타냈으며, 농도가 증가되었을 때 억제율이 일반 TDS powder에서는 12% 증가하였으나 TDS 나노입자 용액은 17% 증가한 것으로 보아 일반 TDS powder를 사용하는 것보다 수용액 상의 TDS 나노입자 용액을 사용할 경우 Colletotrichum gloeosporioides에 작용하는 표면적이 증가하여 더 효율적으로 작용했으며 적은 농도의 함유량으로도 Colletotrichum gloeosporioides의 생장을 효과적으로 억제한 것으로 사료된다. 이러한 나노입자 제조를 통하여 병원균의 세포벽에 침착하는 표면적을 증가시키고 세포벽에 침투하여 균을 사멸시키는 기 작이 보고되었으며 (Seo et al.
- 870로 대조군과 일반 TDS 용액과 비교하여 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 TDS crrude와 비교하여 고압균질 공정을 통해 제조된 TDS 나노입자 용액 속에는 TDS 분말의 함유량이 높은 것을 알 수 있으며, 고압균질 공정을 통하여 TDS 분말이 안정한 상태로 수용액 속에 분산되어 있는 것으로 사료된다.
- 그러나 일반 TDS powder의 최고농도인 100 ㎎ 의 억제 효과는 더 낮은 농도인 50 ppm의 TDS 나노입자 용액의 억제효과 보다 낮게 나타내었다. 이와 비교하여 TDS 나노입자 용액에서는 최고 농도인 100 ppm에서 균사 생장을 가장 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었다. 보다 자세한 생장 억제율을 알아보기 위하여 측정한 균사 생장 억제율을 Fig.
- Magnetic bar를 이용하여 800rpm의 교반속도로 1시간 교반을 진행하였다. 진행결과 용액이매우 투명하게 제조되었으며 이는 thiamine hydrochloride와 sodium lauryl sulfate가 완벽히 반응이 이루어져 잔존하는 thiamine hydrochloride나 sodium lauryl sulfate가 없어 석출이 되지 않는 것으로 사료되는 바, 상기의 자극취가 발생하지 않은 결과와 함께, thiamine hydrochloride와 sodium lauryl sulfate의 비타민 B1 유도체 반응이 성공적으로 이루어졌음을 나타내는 것으로 사료된다.
- 4에 나타내었다. 측정 결과 대조군과 비교하여 일반 TDS powder에서는 50 ppm에서 가장 낮은 억제율인 36.9%로 측정되었으며, 가장 높은 억제율은 82.9%의 억제율을 나타낸 100 ppm 농도의 TDS 나노입자 용액으로 측정되었다. 또한 최고 농도인 100ppm인 일반 TDS powder보다 더 낮은 농도인 50 ppm 농도의 TDS 나노입자 용액의 억제율이 17% 이상 높은 결과를 나타냈으며, 농도가 증가되었을 때 억제율이 일반 TDS powder에서는 12% 증가하였으나 TDS 나노입자 용액은 17% 증가한 것으로 보아 일반 TDS powder를 사용하는 것보다 수용액 상의 TDS 나노입자 용액을 사용할 경우 Colletotrichum gloeosporioides에 작용하는 표면적이 증가하여 더 효율적으로 작용했으며 적은 농도의 함유량으로도 Colletotrichum gloeosporioides의 생장을 효과적으로 억제한 것으로 사료된다.
- 제조 수율은 획득한 TDS 분말을 제조하는 데 사용된 thiamine hydrochloride 70 g, sodium lauryl sulfate 70 g의 총 무게인 140 g으로 나누고 100을 곱하여 %로 나타내었다. 획득한 TDS 분말은 110.8 g으로 79.14%의 높은 제조 수율을 나타내었다. 또한, 제조된 TDS 분말은 sodium lauryl sulfate에서 발생하는 특이 적인 자극취가 발생하지 않았다.
후속연구
- 본 연구를 통한 고압균질 공정을 통한 TDS의 나노입자 용액 제조는 이전에 보고되었던 아미노글리코시드계 항생제를 이용한 식물병 방제제를 제조하는 연구 (Kim, 2000)에서 Colletotrichum gloeosporioides에 대한 항진균 활성을 갖지 않는 결과와 비교하여 본 연구에서는 뛰어난 항진균 활성을 나타낸 것으로 보아 고추탄저병에 선택적으로 적용시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 TDS를 용액 상태로 제조하기 위하여 유기용매를 이용하여 제조한 용액 (Kim et al., 2005)보다 본 연구에서는 용매로 물을 사용하였기 때문에 생화학 농약으로서 인체에 더 안전한 것으로 향후 생화학 농약의 적용이 가능할 것으로 기대된다.
- 또한 이러한 나노 입자를 이용한 병원균의 사멸 시 powder 보다 적은양의 사용으로도 효율을 증가시킬 수 있으며 powder 사용으로 인한 문제점인 손실율도 줄일 수 있을 것으로 사료되며 본 연구에서 실험한 TDS 나노입자 용액의 농도인 100 ppm의 농도는 비타민 B1의 항진균 활성을 나타낸 농도인 250 ppm의 농도보다 훨씬 적은 농도로도 뛰어난 항진균 활성을 나타낸 것을 알 수 있었다 (Lee, 2002). 본 연구를 통한 고압균질 공정을 통한 TDS의 나노입자 용액 제조는 이전에 보고되었던 아미노글리코시드계 항생제를 이용한 식물병 방제제를 제조하는 연구 (Kim, 2000)에서 Colletotrichum gloeosporioides에 대한 항진균 활성을 갖지 않는 결과와 비교하여 본 연구에서는 뛰어난 항진균 활성을 나타낸 것으로 보아 고추탄저병에 선택적으로 적용시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 TDS를 용액 상태로 제조하기 위하여 유기용매를 이용하여 제조한 용액 (Kim et al.
- 또한 최고 농도인 100ppm인 일반 TDS powder보다 더 낮은 농도인 50 ppm 농도의 TDS 나노입자 용액의 억제율이 17% 이상 높은 결과를 나타냈으며, 농도가 증가되었을 때 억제율이 일반 TDS powder에서는 12% 증가하였으나 TDS 나노입자 용액은 17% 증가한 것으로 보아 일반 TDS powder를 사용하는 것보다 수용액 상의 TDS 나노입자 용액을 사용할 경우 Colletotrichum gloeosporioides에 작용하는 표면적이 증가하여 더 효율적으로 작용했으며 적은 농도의 함유량으로도 Colletotrichum gloeosporioides의 생장을 효과적으로 억제한 것으로 사료된다. 이러한 나노입자 제조를 통하여 병원균의 세포벽에 침착하는 표면적을 증가시키고 세포벽에 침투하여 균을 사멸시키는 기 작이 보고되었으며 (Seo et al., 2010), 본 연구에서 제조한 TDS 나노입자 용액도 위와 같은 기작으로 균사를 사멸시키는 것으로 사료되며 생화학농약으로서 활용하는데 더 효율적일 것으로 생각된다.
- 이러한 결과는 고압균질기 공정을 통해 30,000 psi의 높은 압력으로 인해 발생하는 에너지가 TDS 분말에 전달되어 나노크기로 균질화 시킨 것으로 사료된다. 이처럼 TDS 나노입자 용액속의 TDS 분말 입자가 나노크기로 제조되어 분산된 형태를 나타내면 용액속의 안정성 및 분산성이 향상되어 생화학농약으로의 활용성이 증가할 것으로 기대 된다. 이러한 기술은 살충제, 비료 및 농업용 화학제의 효율적인 전달이 가능하여 농업용 화학제의 전달 기술로 많이 활용되고 있다 (Kim et al.
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