루틴은 항발암, 소염제, 항바이러스성 기능을 갖는 물질이다. 미생물이 만들어낸 폴리에스테르인 PHBV와 루틴을 전기방사하여 나노섬유부직포를 얻었다. 나노섬유 부직포의 항균성은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 사용하여 평가하였고, KB 셀을 이용하여 세포독성을 평가하였다. 그 결과 루틴을 3 wt% 함유할 때 지지체는 우수한 항균성을 보였으며, KB 셀을 이용한 실험결과로부터 루틴을 함유하는 PHBV 지지체는 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
루틴은 항발암, 소염제, 항바이러스성 기능을 갖는 물질이다. 미생물이 만들어낸 폴리에스테르인 PHBV와 루틴을 전기방사하여 나노섬유 부직포를 얻었다. 나노섬유 부직포의 항균성은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)을 사용하여 평가하였고, KB 셀을 이용하여 세포독성을 평가하였다. 그 결과 루틴을 3 wt% 함유할 때 지지체는 우수한 항균성을 보였으며, KB 셀을 이용한 실험결과로부터 루틴을 함유하는 PHBV 지지체는 세포독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
Rutin (R) exhibits a wide range of biological activities including anticarcinogenic, antiinflammatory and antiviral actions. The purpose of this study is to investigate the effect of rutin concentrations (1 and 3 wt%) on the antibacterial activity of poly(3-hydroxybutylate-co-hydroxyvalerate) (PHBV)...
Rutin (R) exhibits a wide range of biological activities including anticarcinogenic, antiinflammatory and antiviral actions. The purpose of this study is to investigate the effect of rutin concentrations (1 and 3 wt%) on the antibacterial activity of poly(3-hydroxybutylate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) scaffolds. Antibacterial activity was evaluated by using Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the qualitative ongrowth of human KB endothelial cells was done to study in vitro cytotoxicity of the scaffolds. As the results, PHBV scaffolds containing 3 wt% rutin completely inhibited the proliferation of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. In addition, the PHBV/R scaffolds used in this study did not show any cytotoxicity when evaluated them with KB endothelial cells.
Rutin (R) exhibits a wide range of biological activities including anticarcinogenic, antiinflammatory and antiviral actions. The purpose of this study is to investigate the effect of rutin concentrations (1 and 3 wt%) on the antibacterial activity of poly(3-hydroxybutylate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) scaffolds. Antibacterial activity was evaluated by using Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. Furthermore, the qualitative ongrowth of human KB endothelial cells was done to study in vitro cytotoxicity of the scaffolds. As the results, PHBV scaffolds containing 3 wt% rutin completely inhibited the proliferation of Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae. In addition, the PHBV/R scaffolds used in this study did not show any cytotoxicity when evaluated them with KB endothelial cells.
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문제 정의
HT4 나노섬유는 높은 비표면적과 기공도를 가지고 있어 의료재료 인공혈관, 나노 복합 재료 등으로 다양한 응용이 가능하다.15, 16 또한 나노섬유로 만들어진 부직포는 세포의 점착과 성장을 촉진시키며 큰 비표면적으로 인해 상 처부위와의 접촉면이 넓어져 상처치유 속도가 빠르며 상처에서 배출되는 체액의 흡수능려 산소투과성의 우수함으로 인해 창상피복제나 혈관 이식 및 조직공학용 지지체 등의 응용에 많은 연구가 이뤄지고 있다「JR 본 연구에서는 인공장기의 이식시 생길 수 있는 감염을 막기 위해 천 연 항균물질인 루틴과 생체적합성이 뛰어난 PHBV를 이용하여 전기방 사하므로써 항균성과 생체적합성을 동시에 만족시키는 나노섬유 부직 포를 개발하고자 하였다.
2223 세포점착. 본 연구에서는 KB 셀을 이용하여 루틴을 함유하는 PHBV 나노섬유 지지체의 세포독성에 미치는 영향을 조사하였다. 앞선 연구에서 루틴은 그램양성균과 그램음성균에 대한 항균성을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다.
조직공학에서의 지지체의 이용은 생체내 결합조 직의 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 을 모방한 것이다. 본 연구에서는 전기방사된 나노섬유가 ECM에 존재하는 콜라겐의 섬유상 구 조와 유사한 구조를 취하게 되므로 이상적인 매트릭스가 될 가능성을 가지며, 이들 나■노섬유 지지체는 세포의 점착과 성장에도 영향을 준다. 본 연구에서는 항균성을 갖는 루틴을 PHBV-TFE 용액에 각 1, 3 wt% 섞은 후 전기방사를 이용하여 나노섬유를 제조하였다.
본 연구에서는 전기방사법으로 루틴 및 PHBV를 이용하여 3차원의 항균성 나노섬유 지지체를 개발하고자 한다. 전기방사법을 이용한 나 노섬유의 제조법에 대해서는 많은 연구가 이뤄졌다.
앞선 연구에서 루틴은 그램양성균과 그램음성균에 대한 항균성을 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. 항균특성이 세포의 성장과 활성에 영향을 주게 되면 PHBV/R을 조직공학용 지지체로 사용할 수 없게 되므로 실험을 통해 루 틴이 세포의 활성에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
이때 vial 하나는 시료 가 들어있지 않은 상태로 균액만 접종하여 control로 사용하였다. 18 시간 동안 배양시킨 후, 각각의 vial에 중화용액 20 mL를 넣고 강하 게 흔들어 시료에 붙은 균을 떼어내고 이 액을 1 mL씩 채취하여 생리 식염수로 10배 희석 계열을 만들어 한천 배지에 1 mL씩 접종하였다. 37 ℃에서 24시간 배양한 후 생육한 colony수를 측정하고 희석배율 을 곱하여 생균수를 산출하였다.
18 시간 동안 배양시킨 후, 각각의 vial에 중화용액 20 mL를 넣고 강하 게 흔들어 시료에 붙은 균을 떼어내고 이 액을 1 mL씩 채취하여 생리 식염수로 10배 희석 계열을 만들어 한천 배지에 1 mL씩 접종하였다. 37 ℃에서 24시간 배양한 후 생육한 colony수를 측정하고 희석배율 을 곱하여 생균수를 산출하였다. 감균율의 산출식은 다음과 같다
와 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin G-streptomycin (Gibco, Japan) 의 혼합용액에 세포를 담궈 놓았다. 5% CO2> 37 ℃에서 배양시켜 정 해진 시간에 나노섬유 위에 세포를 고정화시켜 SEM을 이용하여 세포 의 점착과성장의 정도를 확인하였다.
세포의 증식과 살아있는 세포를 정확하게 측정할 수 있는 기법으로 MTT assay를 이용하였다 대사과정이 온전한 세 포는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색 수용성 MTT tetrazolium이 자주색을 띠는 비수용성의 MTT formaxan으로 환원 된다. MTT formaxan의 흡광도는 570 nm 파장에서 최대가 되며, 이 흡광도를 측정하여 분석함으로써 세포의 농도와 활성을 측정하였다. 24-well cell culture plate에서 세포를 seedin昭한 나노섬유 지지체에 MTT solution 1 mL를 넣고 4시간 배양한 후 0.
나노섬유의 형태 및 미세구조 관찰. PHBV 및 PHBV/R 나노섬유 의 모폴로지는 전계형 주사전자현미경 (FE-SEM S-4300 HITACHI) 을 이용하여 관찰하였다. 나노섬유에 함유된 루틴을 확인하기 위해 fluorescent microscope (ECLIPSE E600 POL, Nikon) 을 이용하였다.
전기방사. 나노 섬유를 제조하기 위해 전기방사 시스템을。~40 kV 의 전압공급이 가능한 고전압 공급장치 (high voltage DC power supply unit, 청파 EMT), 집전판(collector), 주사기 펌프(syringe pump, KDS100), 주사기 (gastight and needle lock type 10 mL, Hamilton), 금속주사기바늘(20 G) 등으로 구성하였다 나노섬유 제 조조건은 유체주입속도 2.0 mL/h, 방사거리 12 cm, 전압 7 kV, PHBV 농도 6 wt%로 고정시키고 루틴의 농도를 변화시켜 나노섬유 를 제조하였다.
PHBV 및 PHBV/R 나노섬유 의 모폴로지는 전계형 주사전자현미경 (FE-SEM S-4300 HITACHI) 을 이용하여 관찰하였다. 나노섬유에 함유된 루틴을 확인하기 위해 fluorescent microscope (ECLIPSE E600 POL, Nikon) 을 이용하였다.
세포점착 실험. 루틴을 함유하는 나노섬유에 KB 셀을 이용하여 시간에 따른 세포의 점착과 성장을 확인하였다. 와 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin G-streptomycin (Gibco, Japan) 의 혼합용액에 세포를 담궈 놓았다.
루틴의 방출 분석. 루틴이 369 nm 파장의 빛을 흡수한다는 특징을 이용하여 루틴을 함유하는 PHBV 나노섬유 부직포를 a-MEM내에서 방출되는 정도를 확인하였다. 위의 결과를 이용하여 PHBV/R(3 wt%) 나노섬유 부직포를 a-MEM에 담궈두고 4, 12 h, 1, 3, 5, 7 day의 시간이 지난 후에 a-MEM를 제거하였다.
방사용액 제조 PHBV를 trifluoroethanol (TFE) 에 용해하여 6 wt%의 방사용액을 제조하였다. 방사용액에 루틴의 농도에 따른 항 균성을 알아보고자 루틴 (R) 을 1, 3 wt%로 녹여 혼합하였다.
본 연구에서는 전기방사된 나노섬유가 ECM에 존재하는 콜라겐의 섬유상 구 조와 유사한 구조를 취하게 되므로 이상적인 매트릭스가 될 가능성을 가지며, 이들 나■노섬유 지지체는 세포의 점착과 성장에도 영향을 준다. 본 연구에서는 항균성을 갖는 루틴을 PHBV-TFE 용액에 각 1, 3 wt% 섞은 후 전기방사를 이용하여 나노섬유를 제조하였다.
에서 24시간 길러진 배양액을 고체 배지 위에 도말하고, 균이 배양된 고체 배지 위에 준비된 시료를 지름이 1 cm 정도 되는 원형으로 잘라 얹어 두었다. 시료를 얹어둔 고체 배지를 incubator에서 24시간 동안 배양한 후 incubator에서 꺼내 고체배지 의 inhibition zone을 확인하였다.'&
루틴이 369 nm 파장의 빛을 흡수한다는 특징을 이용하여 루틴을 함유하는 PHBV 나노섬유 부직포를 a-MEM내에서 방출되는 정도를 확인하였다. 위의 결과를 이용하여 PHBV/R(3 wt%) 나노섬유 부직포를 a-MEM에 담궈두고 4, 12 h, 1, 3, 5, 7 day의 시간이 지난 후에 a-MEM를 제거하였다. 제거된 a-MEMe UV-visible(JACSO V-650) 을 사용하여 루틴에 대한 UV 흡수도 를 측정하였다.
위의 결과를 이용하여 PHBV/R(3 wt%) 나노섬유 부직포를 a-MEM에 담궈두고 4, 12 h, 1, 3, 5, 7 day의 시간이 지난 후에 a-MEM를 제거하였다. 제거된 a-MEMe UV-visible(JACSO V-650) 을 사용하여 루틴에 대한 UV 흡수도 를 측정하였다.
이때 얻어진 나노섬유의 직경은 600-900 nm 범위 이었다 PHBV 나 노섬유에 함유된 루틴은 형광현미경을 통해 그 존재를 확인할 수 있었다. 직물의 항균성을 평가하기 위해 황색포도상구균(aureus) 과 磷枣宜(Klebsiella pneumoniae) 에 대한 감균율을 즉정 하고 inhibition zone test를 실시하였다. 감균률의 즉정결과 루틴 3 wt% 에서 99% 이상의 우수한 항균성을 보였다.
Growth Inhibition Test: 항균성 평가는 직물의 항균도 시험 방법 인 KS K 0693 : 20이에 의거하여 나노섬유의 항균도를 평가하였다. 항균성의 평가를 위하여 전기방사법으로 제조한 PHBV, PHBV/R 나 노섬유 부직포를 이용하였다 제조된 부직포들은 autoclave에서 120 ℃ 로 30분간 멸균하였고 고압 증기 멸균 후 UV light 하에서 건조시킨 후 시료들을 두께 0.08 mm의 원형 크기로 잘라 항균실험에 이용하였다. 시험균주는 Staphylococcus aures와 Klebsiella pneumoniae을 사용■ 하였고, 보존 균주를 한천 배지에 이식하고 incubator에서 하루 동안 배양하였다.
대상 데이터
방사용액 제조 PHBV를 trifluoroethanol (TFE) 에 용해하여 6 wt%의 방사용액을 제조하였다. 방사용액에 루틴의 농도에 따른 항 균성을 알아보고자 루틴 (R) 을 1, 3 wt%로 녹여 혼합하였다.
어떠한 재료가 조직공학에 이용되기 위해서는 항균성을 확보하는 것이 매우 중요하다. 본 연구게서는 천연물에서 나오는 대표적인 항균물질 로 알려져 있는 루틴을 포함하는 PHBV 나노섬유 지지체를 제조하였다. 이때 얻어진 나노섬유의 직경은 600-900 nm 범위 이었다 PHBV 나 노섬유에 함유된 루틴은 형광현미경을 통해 그 존재를 확인할 수 있었다.
08 mm의 원형 크기로 잘라 항균실험에 이용하였다. 시험균주는 Staphylococcus aures와 Klebsiella pneumoniae을 사용■ 하였고, 보존 균주를 한천 배지에 이식하고 incubator에서 하루 동안 배양하였다. 배양된 균을 1백금이 취하여 액체 배지 20 mL에 이식한 후 shaking incubator에서 24시간 배양하였다.
Poly (3 - hydroxybutylate - co~ 3 - hydroxy - valerate) (PHBV), 루틴은 Sigma-Aldrich Co. 제품을 구입하여 사용 하였다 항균성 평가를 위해 사용된 미생물인 황색포도상구균(答询必以- ococcus aureus), 磷렴간균 (Klebsiella pneumoniae) 및 KB 셀은 Human primary umbilical vein endothelial cells로 ATCC에서 구 입하여 사용하였^, 배지의 제조에 사용한 Nutrient broth는 Sigma사의 제품을 사용하였다.
이론/모형
Growth Inhibition Test: 항균성 평가는 직물의 항균도 시험 방법 인 KS K 0693 : 20이에 의거하여 나노섬유의 항균도를 평가하였다. 항균성의 평가를 위하여 전기방사법으로 제조한 PHBV, PHBV/R 나 노섬유 부직포를 이용하였다 제조된 부직포들은 autoclave에서 120 ℃ 로 30분간 멸균하였고 고압 증기 멸균 후 UV light 하에서 건조시킨 후 시료들을 두께 0.
성능/효과
감균률의 즉정결과 루틴 3 wt% 에서 99% 이상의 우수한 항균성을 보였다. Inhibition zone test에서는 루틴 1 wt% 보다 3 wt%일 때 더욱 진한 존이 형성됨을 알 수 있 었다 또한, KB 셀 배양 결과 루틴이 세포 생존에 미치는 영항이 거의 없 음을 알 수 있었다. 따라서 항균성과 세포적합성을 동시에 가지는 폴리 에 스테르 나노유 부직포를 얻을 수 있었다 아상의 결과로부터 PHBV/R 나 노섬유 scaffolds는 조직공학용 지지체로 이용될 수 있는 가능성을 지니 고 있는 것으로 사료된다.
직물의 항균성을 평가하기 위해 황색포도상구균(aureus) 과 磷枣宜(Klebsiella pneumoniae) 에 대한 감균율을 즉정 하고 inhibition zone test를 실시하였다. 감균률의 즉정결과 루틴 3 wt% 에서 99% 이상의 우수한 항균성을 보였다. Inhibition zone test에서는 루틴 1 wt% 보다 3 wt%일 때 더욱 진한 존이 형성됨을 알 수 있 었다 또한, KB 셀 배양 결과 루틴이 세포 생존에 미치는 영항이 거의 없 음을 알 수 있었다.
루틴 3 wt%를 함유하는 PHBV 나노섬유 부직포의 경우 두 균주에 대하여 100%에 가까운 감균율을 나타내었다. 두 균을 비교해보면 폐렴간균에 대한 항균성은 황색포도상구균에 대한 항균성보다 악칸: 높았다. Figure 5는 PHBV/R 나노섬유 부직포의 inhibition zone을 나타낸 결과이다.
Inhibition zone test에서는 루틴 1 wt% 보다 3 wt%일 때 더욱 진한 존이 형성됨을 알 수 있 었다 또한, KB 셀 배양 결과 루틴이 세포 생존에 미치는 영항이 거의 없 음을 알 수 있었다. 따라서 항균성과 세포적합성을 동시에 가지는 폴리 에 스테르 나노유 부직포를 얻을 수 있었다 아상의 결과로부터 PHBV/R 나 노섬유 scaffolds는 조직공학용 지지체로 이용될 수 있는 가능성을 지니 고 있는 것으로 사료된다.
생체 적합성 고분자로 알려진 PHBV는 세포의 성장에 별다른 문제점을 보이지 않았다. 한편, 항균성을 가지는 루틴이 함유된 PH册V의 경우에도 세포의 성장에 별다른 영항이 없는 것을 확인할 수 있었다 이러한 결과는 루틴이 세포의 성장에 영향을 끼치지 않으 면서 세균에 대해서는 항균성질을 나타낸다는 것을 의미한다.
참고문헌 (25)
M. F. Abu Bakar, M. Mohamed, A. Rahmat, and J. Fry, Food Chem., 113, 479 (2009).
I. Kreft, N. Fabjan, and M. Germ, Fagopyrum, 20, 7 (2003).
C. Wagner, R. Fachinetto, C. L. Corte, V. B. Brito, D. Severo. G. D. O. C. Dias, A. F. Morel, C. W. Nogueira, and, J. B. T. Rocha, Brain Res., 1107, 192 (2006).
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