액체크로마토그래피-형광검출법에 의한 호소시료의 아나톡신-a 분석 Analysis of anatoxin-a in aqueous and cyanobacterial samples from korean lakes by liquid chromatography with fluorescence detection원문보기
아나톡신-a는 Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria 등의 남조류에서 생성되는 신경독소로 강한 독성을 나타낸다. 국내에서는 영천호 등의 호소에서 최근 Anabaena에 의한 수화현상이 늘어나고 안전한 상수원수의 확보를 위하여 아나톡신-a의 미량분석이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 아나톡신-a를 고상추출한 뒤 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F)로 형광 유도체화시켜 고성능액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)로 분석하였다. 시험방법 validation 결과 직선성, 회수율, 재현성에서 모두 좋은 값을 나타내었으며, 방법검출한계(MDL)은 조체 시료의 경우 $0.034\;{\mu}g/g$, 물 시료의 경우 $0.022\;{\mu}g/L$로 비교적 좋은 감도를 얻을 수 있었다. 국내 안동호, 영천호 및 대청호에서 채취한 조체와 물 시료에서 아나톡신-a의 농도를 분석한 결과 조체 시료에서는 $0.135\sim10.979\;{\mu}g/g$의 농도로 검출되었으며, 물 시료에서는 검출되지 않았다.
아나톡신-a는 Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria 등의 남조류에서 생성되는 신경독소로 강한 독성을 나타낸다. 국내에서는 영천호 등의 호소에서 최근 Anabaena에 의한 수화현상이 늘어나고 안전한 상수원수의 확보를 위하여 아나톡신-a의 미량분석이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 아나톡신-a를 고상추출한 뒤 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F)로 형광 유도체화시켜 고성능액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)로 분석하였다. 시험방법 validation 결과 직선성, 회수율, 재현성에서 모두 좋은 값을 나타내었으며, 방법검출한계(MDL)은 조체 시료의 경우 $0.034\;{\mu}g/g$, 물 시료의 경우 $0.022\;{\mu}g/L$로 비교적 좋은 감도를 얻을 수 있었다. 국내 안동호, 영천호 및 대청호에서 채취한 조체와 물 시료에서 아나톡신-a의 농도를 분석한 결과 조체 시료에서는 $0.135\sim10.979\;{\mu}g/g$의 농도로 검출되었으며, 물 시료에서는 검출되지 않았다.
Anatoxin-a is a cyanobacterial neurotoxin with a high toxicity produced by Anabaena, Aphanizomenon and Oscillatoria. Water bloom, formed by Anabaena has been occurring frequently in Lake Yeongchun. It is need to develop a sensitive method for determination of anatoxin-a to control potential hazard i...
Anatoxin-a is a cyanobacterial neurotoxin with a high toxicity produced by Anabaena, Aphanizomenon and Oscillatoria. Water bloom, formed by Anabaena has been occurring frequently in Lake Yeongchun. It is need to develop a sensitive method for determination of anatoxin-a to control potential hazard in raw water resources. In this study, we developed a highly sensitive analytical method of anatoxin-a using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. Anatoxin-a was converted into a highly fluorescent derivative using 4-fuoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBF-F). The method was evaluated in terms of linearity of calibration curve, recovery and repeatability, and the adequate values were obtained. The method detection limit was $0.034\;{\mu}g/g$ and $0.022\;{\mu}g/L$ for algal and water samples, respectively. The concentrations of anatoxin-a were measured in algal and water samples from Lake Andong, Yeongchun and Daechung and ranged from $0.135\;{\mu}g/g$ to $10.979\;{\mu}g/g$ in algal samples and not detected in water samples.
Anatoxin-a is a cyanobacterial neurotoxin with a high toxicity produced by Anabaena, Aphanizomenon and Oscillatoria. Water bloom, formed by Anabaena has been occurring frequently in Lake Yeongchun. It is need to develop a sensitive method for determination of anatoxin-a to control potential hazard in raw water resources. In this study, we developed a highly sensitive analytical method of anatoxin-a using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. Anatoxin-a was converted into a highly fluorescent derivative using 4-fuoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBF-F). The method was evaluated in terms of linearity of calibration curve, recovery and repeatability, and the adequate values were obtained. The method detection limit was $0.034\;{\mu}g/g$ and $0.022\;{\mu}g/L$ for algal and water samples, respectively. The concentrations of anatoxin-a were measured in algal and water samples from Lake Andong, Yeongchun and Daechung and ranged from $0.135\;{\mu}g/g$ to $10.979\;{\mu}g/g$ in algal samples and not detected in water samples.
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제안 방법
1 M 염산 50 µL를 가하여 반응을 종결시킨 후 20 µL를 HPLC에 주입하여 분석하였다(Fig. 2).
10~200 ng 범위에 해당하는 아나톡신-a 표준액을 형광 유도체화시키고 HPLC에 주입하여 검정곡선을 작성하였다. 검정곡선 각 단계마다 3회씩 분석하였으며, r2 값은 0.
HPLC 시스템은 Waters 600 Controller, pump, Waters 474 형광검출기로 구성되었으며, 칼럼은 Agilent XDB-C18 (4.6 × 150 mm × 5)을 이용하였다.
낙동강 수계의 다목적댐인 안동호, 용수 전용댐인 영천호 및 금강 수계의 대청호를 대상으로 2008년 남조류가 우점한 시기를 중심으로 시료를 채취하여 아나톡신-a의 분석을 실시하였다. 세포내 독소함량을 조사하기 위하여 플랑크톤 네트로 조체 시료를 채취한 뒤 동결 건조하여 사용하였고, 물속에 녹아있는 독소 함량은 표층수를 채취하여 조사하였다.
낙동강 수계의 다목적댐인 안동호, 용수 전용댐인 영천호 및 금강수계의 대청호를 대상으로 2008년 남조류가 우점한 시기를 중심으로 시료를 채취하여 아나톡신-a의 분석을 실시하였으며, 분석 크로마토그램을 Fig. 4에 나타내었다. 물 시료에서는 anatoxin-a가 검출되지 않았으나 조체 시료에서는 0.
물 시료는 먼저 유리섬유여지(grade C, GF/C)로 여과한 뒤 WCX 6 mL 카트리지를 이용한 SPE로전처리하였다. 여과한 시료는 SPE로 전처리하기 전에 pH 7로 맞추고, WCX 카트리지는 메탄올 6 mL 와 증류수 6 mL로 컨디셔닝하였다.
방법검출한계(MDL)와 정량한계(LOQ)는 물 시료의 경우 1 µg/L의 농도가 되도록 아나톡신-a 표준액을 증류수에 첨가하고, 조체 시료의 경우 아나톡신-a가포함되어 있지 않은 동결 건조된 조체 시료에 0.1 µg/g의 농도가 되도록 아나톡신-a 표준액을 첨가하여 각 시료를 실험절차와 동일하게 분석하였다.
본 연구에서는 아나톡신-a를 고상추출한 뒤 NBD-F 로 형광 유도체화시켜 HPLC-FLD로 분석하였으며, 낙동강 수계의 안동호, 영천호 및 금강수계의 대청호를 대상으로 2008 년 남조류가 우점한 시기를 중심으로 조체 시료 및 물 시료에서 아나톡신-a의 농도를 조사하였다.
낙동강 수계의 다목적댐인 안동호, 용수 전용댐인 영천호 및 금강 수계의 대청호를 대상으로 2008년 남조류가 우점한 시기를 중심으로 시료를 채취하여 아나톡신-a의 분석을 실시하였다. 세포내 독소함량을 조사하기 위하여 플랑크톤 네트로 조체 시료를 채취한 뒤 동결 건조하여 사용하였고, 물속에 녹아있는 독소 함량은 표층수를 채취하여 조사하였다.
이 과정을 2 회 더 반복하여 추출액을 합하고, 40°C에서 TurboVap LV 질소농축기로 용매를 완전히 날린 뒤 물 2 mL에 다시 녹여 이후는 물 시료와 동일하게 전처리하였다. 실제 호소에서 채취한 조체 시료도 위와 같은 과정으로 동결 건조하여 전처리하였다(Fig. 2).
아나톡신-a를 WCX 카트리지로 고상추출한 뒤 NBD-F로 형광 유도체화시켜 HPLC-FLD로 분석하였다. 직선성, 회수율, 재현성을 구한 결과 모두 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 방법검출한계(MDL)은 물 시료의 경우 0.
증류수 및 아나톡신-a가 포함되어 있지 않은 동결 건조된 조체 시료에 농도가 각각 10 µg/L, 1 µg/g가되도록 아나톡신-a의 표준액을 가한 뒤 전처리 과정을 모두 거쳐 분석한 결과와 전처리 과정을 거치지 않고 바로 형광유도체화 반응을 시킨 동일한 농도의 표준 액의 분석결과를 비교하여 회수율을 측정하였다.
대상 데이터
BG11 배지를 사용하여 25°C에서 광배양한 뒤 동결 건조하여 분석에 이용하였다.
Louis, MO, USA)의 고순도 시약을 사용하였다. 고상 추출법 (SPE)에 사용한 WCX (500 mg, 6 mL) 카트리지와 vacuum manifold는 Supelco사 (Bellefonte, PA, USA)의제품을 이용하였다. 시료의 농축을 위해 Zymark사의 TurboVap LV 질소농축기를 사용하였다.
Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 메탄올과 아세토니트릴은 Merck사 (Darmstadt, Germany)의 잔류농약 분석용 시약 및 J. T. Baker (NJ, USA)사의 HPLC 등급 시약을 이용하였으며, 그 외 시약은 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)의 고순도 시약을 사용하였다. 고상 추출법 (SPE)에 사용한 WCX (500 mg, 6 mL) 카트리지와 vacuum manifold는 Supelco사 (Bellefonte, PA, USA)의제품을 이용하였다.
고상 추출법 (SPE)에 사용한 WCX (500 mg, 6 mL) 카트리지와 vacuum manifold는 Supelco사 (Bellefonte, PA, USA)의제품을 이용하였다. 시료의 농축을 위해 Zymark사의 TurboVap LV 질소농축기를 사용하였다. 증류수는 Milli-Q system을 통과한 3 차 증류수를 이용하였으며, 실험에 사용하는 모든 유리기구는 사용하기 전에 3 차 증류수로 세척한 후 건조시켜 사용하였다.
아나톡신-a 표준물질은 Tocris사 (Bristol, UK)의 (±)anatoxin-a fumarate 시약을 구입하여 사용하였으며, 형광유도체화 시약인 NBD-F는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
6 × 150 mm × 5)을 이용하였다. 이동상으로 아세토니트릴-물(40:60, v/v)을, 0.8 mL/min의 유속으로 사용하였다. 형광검출기는 excitation 470 nm, emission 530 nm의 파장에서 사용하였다.
조체 표준시료로 Anabaena flos-aquae, Anabaena variabillis 2 종의 남조류 균주를 구매하여 실험실에서 배양하였다. BG11 배지를 사용하여 25°C에서 광배양한 뒤 동결 건조하여 분석에 이용하였다.
증류수는 Milli-Q system을 통과한 3 차 증류수를 이용하였으며, 실험에 사용하는 모든 유리기구는 사용하기 전에 3 차 증류수로 세척한 후 건조시켜 사용하였다. 조체 표준시료로는 Anabaena flos-aquae(영국 CCAP), Anabaena variabillis(영남대학교 해양연구센터) 2 종의 남조류 균주를 구매하여 실험실에서 배양하여 사용하였다.
8 mL/min의 유속으로 사용하였다. 형광검출기는 excitation 470 nm, emission 530 nm의 파장에서 사용하였다.
성능/효과
MDL은 각 7 회 측정한 값의 표준편차에 3.14를 곱한 값으로 구하고, LOQ는 10을 곱한 값으로 구한 결과, MDL은물 시료의 경우 0.022 µg/L, 조체 시료의 경우 0.034 µg/g으로 비교적 좋은 감도를 얻을 수 있었다.
물 시료에서는 anatoxin-a가 검출되지 않았으나 조체 시료에서는 0.135~10.979 µg/g의 농도로 검출되었으며, 8~9월의 영천호 시료에서 비교적 높은 농도로 검출되었다(Table 3).
아나톡신-a를 분석하는 여러 가지 방법들 중에서 4-fuoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F)로 형광 유도체화시켜 HPLC-FLD로 분석하는 방법은 TLC나 HPLC-UV 분석방법에 비해 감도가 좋고, MS검출기를 사용한 분석방법들에 비해 기기장치가 비교적 간단하며, 비용이 적게 들고, 시료 속에 존재하는 다른 물질들에 의한 방해효과가 적어 미량까지 분석이 가능하다. NBD-F는 아미노산이나 아민류 등을 분석하 는데 있어 형광 검출을 위한 유도체 시약으로 주로 이용되는데, 아나톡신-a와 반응하여 형광을 띄는 NBD-아나톡신-a를 생성하여 HPLC-FLD로 미량분석이 가능하다(Fig.
직선성, 회수율, 재현성을 구한 결과 모두 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 방법검출한계(MDL)은 물 시료의 경우 0.022 µg/L, 조체 시료의 경우 0.034 µg/g 으로 비교적 좋은 감도를 얻을 수 있었다.
각시료마다 5 회 반복하여 측정하였으며, 측정한 회수율과 상대표준편차(RSD)를 Table 2에 나타내었다. 평균회수율은 물 시료의 경우 90.1%, 조체 시료의 경우 88.7%로 비교적 좋은 회수율을 얻을 수 있었으며, 재현성을 나타내는 RSD 값은 물 시료의 경우 4.0, 조체 시료의 경우 4.1%로, 양호한 결과를 얻을 수 있었다.
후속연구
979 µg/g의 농도로 검출되었다. 형광검출기를 이용한 고성능액체크로마토그래피법은 비교적 기기장치가 간단하면서 또한 감도가 좋아 저비용으로 미량까지 분석이 가능하여 상수원의 안전성을 확보하기 위한 남조류 독소의 관리 등에 기여할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
아나톡신-a의 미량분석이 필요한 이유는 무엇인가?
아나톡신-a는 Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria 등의 남조류에서 생성되는 신경독소로 강한 독성을 나타낸다. 국내에서는 영천호 등의 호소에서 최근 Anabaena에 의한 수화현상이 늘어나고 안전한 상수원수의 확보를 위하여 아나톡신-a의 미량분석이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 아나톡신-a를 고상추출한 뒤 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-F)로 형광 유도체화시켜 고성능액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)로 분석하였다.
아나톡신-a란 무엇인가?
아나톡신-a는 Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria 등의 남조류에서 생성되는 신경독소로 강한 독성을 나타낸다. 국내에서는 영천호 등의 호소에서 최근 Anabaena에 의한 수화현상이 늘어나고 안전한 상수원수의 확보를 위하여 아나톡신-a의 미량분석이 필요한 실정이다.
아나톡신-a를 WCX 카트리지로 고상추출한 뒤 NBD-F로 형광 유도체화시켜 HPLC-FLD로 분석하여 얻은 결과는 무엇인가?
아나톡신-a를 WCX 카트리지로 고상추출한 뒤 NBD-F로 형광 유도체화시켜 HPLC-FLD로 분석하였다. 직선성, 회수율, 재현성을 구한 결과 모두 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 방법검출한계(MDL)은 물 시료의 경우 0.022 µg/L, 조체 시료의 경우 0.034 µg/g 으로 비교적 좋은 감도를 얻을 수 있었다. 국내 3개호소를 대상으로 2008년 남조류가 우점한 시기를 중심으로 시료를 채취하여 아나톡신-a를 분석한 결과 물시료에서는 전부 검출되지 않았고, 동결건조한 남조류 시료에서는 0.135~10.979 µg/g의 농도로 검출되었다. 형광검출기를 이용한 고성능액체크로마토그래피법은 비교적 기기장치가 간단하면서 또한 감도가 좋아 저비용으로 미량까지 분석이 가능하여 상수원의 안전성을 확보하기 위한 남조류 독소의 관리 등에 기여할 것으로 기대된다.
참고문헌 (12)
J. Osswald, S. Rellan, A. Gago and V. Vasconcelos, Environ. Int., 33, 1070-1089 (2007).
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