Substantia gelatinosa (SG) neurons receive synaptic inputs from primary afferent $A{\delta}$- and C-fibers, where nociceptive information is integrated and modulated by numerous neurotransmitters or neuromodulators. A number of studies were dedicated to the molecular mechanism underlying ...
Substantia gelatinosa (SG) neurons receive synaptic inputs from primary afferent $A{\delta}$- and C-fibers, where nociceptive information is integrated and modulated by numerous neurotransmitters or neuromodulators. A number of studies were dedicated to the molecular mechanism underlying the modulation of excitability or synaptic plasticity in SG neurons and revealed that second messengers, such as cAMP and cGMP, play an important role. Recently, cAMP and cGMP were shown to downregulate each other in heart muscle cells. However, involvement of the crosstalk between cAMP and cGMP in neurons is yet to be addressed. Therefore, we investigated whether interaction between cAMP and cGMP modulates synaptic plasticity in SG neurons using slice patchclamp recording from rats. Synaptic activity was measured by excitatory post-synaptic currents (EPSCs) elicited by stimulation onto dorsal root entry zone. Application of 1 mM of 8-bromoadenosine 3,5-cyclic monophosphate (8-Br-cAMP) or 8-bromoguanosine 3,5-cyclic monophosphate (8-Br-cGMP) for 15 minutes increased EPSCs, which were maintained for 30 minutes. However, simultaneous application of 8-BrcAMP and 8-Br-cGMP failed to increase EPSCs, which suggested antagonistic cross-talk between two second messengers. Application of 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) that prevents degradation of cAMP and cGMP by blocking phosphodiesterase (PDE) increased EPSCs. Co-application of cAMP/cGMP along with IBMX induced additional increase in EPSCs. These results suggest that second messengers, cAMP and cGMP, might contribute to development of chronic pain through the mutual regulation of the signal transduction.
Substantia gelatinosa (SG) neurons receive synaptic inputs from primary afferent $A{\delta}$- and C-fibers, where nociceptive information is integrated and modulated by numerous neurotransmitters or neuromodulators. A number of studies were dedicated to the molecular mechanism underlying the modulation of excitability or synaptic plasticity in SG neurons and revealed that second messengers, such as cAMP and cGMP, play an important role. Recently, cAMP and cGMP were shown to downregulate each other in heart muscle cells. However, involvement of the crosstalk between cAMP and cGMP in neurons is yet to be addressed. Therefore, we investigated whether interaction between cAMP and cGMP modulates synaptic plasticity in SG neurons using slice patchclamp recording from rats. Synaptic activity was measured by excitatory post-synaptic currents (EPSCs) elicited by stimulation onto dorsal root entry zone. Application of 1 mM of 8-bromoadenosine 3,5-cyclic monophosphate (8-Br-cAMP) or 8-bromoguanosine 3,5-cyclic monophosphate (8-Br-cGMP) for 15 minutes increased EPSCs, which were maintained for 30 minutes. However, simultaneous application of 8-BrcAMP and 8-Br-cGMP failed to increase EPSCs, which suggested antagonistic cross-talk between two second messengers. Application of 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) that prevents degradation of cAMP and cGMP by blocking phosphodiesterase (PDE) increased EPSCs. Co-application of cAMP/cGMP along with IBMX induced additional increase in EPSCs. These results suggest that second messengers, cAMP and cGMP, might contribute to development of chronic pain through the mutual regulation of the signal transduction.
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문제 정의
따라서 이번 연구에서는 척수 통증신경 시냅스 수준에서 대표적인 2차 전령계인 cAMP와 cGMP가 척수 시냅스 가소성에 어떠한 영향을 주는지, 시냅스 가소성에 영향을 준다면 두 2차 전령계가 서로 관련되어 어떠한 영향을 주는지를 척수절편을 이용한 전기 생리학적 방법을 이용하여 알아보았다. 척수 통증시냅스 가소성에서 세포내 신호전달계(cAMP, cGMP)간의 crosstalk 기전을 규명하여 향후 척수 감각계의 시냅스 가소성 관련 신호전달계 규명에 기초적인 자료를 제공하고자 하였다.
이와 같은 신호전달계 상호작용 기전이 신경 시냅스 가소성에 적용될 가능성이 있다. 이를 위해 다음 실험에서 관련된 신호전달 경로를 알아보고자 하였다.
이번 연구의 목적은 척수 통증시냅스 가소성에서 세포내 신호전달계(cAMP, cGMP)의 상호연관성이 어떠한 영향을 주는지와 이와 관련된 crosstalk 기전을 규명하여 다양한 형태로 관찰되는 만성통증의 발생기전에 대한 새로운 재해석을 하고자 하는 것이다. 이 연구를 통해서 얻은 결과를 정리하면, 1) cAMP 또는 cGMP는 각각 척수 통증 시냅스 효율을 강화시키는 작용을 통해 과감작 통증을 유발할 수 있고, 2) cAMP와 cGMP의 동시 투여는 척수 통증 시냅스 효율 조절에 있어서 서로의 효과를 길항하는 작용을 가지고 있으며, 3) 이러한 cAMP와 cGMP의 상호길항작용에 PDE가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
따라서 이번 연구에서는 척수 통증신경 시냅스 수준에서 대표적인 2차 전령계인 cAMP와 cGMP가 척수 시냅스 가소성에 어떠한 영향을 주는지, 시냅스 가소성에 영향을 준다면 두 2차 전령계가 서로 관련되어 어떠한 영향을 주는지를 척수절편을 이용한 전기 생리학적 방법을 이용하여 알아보았다. 척수 통증시냅스 가소성에서 세포내 신호전달계(cAMP, cGMP)간의 crosstalk 기전을 규명하여 향후 척수 감각계의 시냅스 가소성 관련 신호전달계 규명에 기초적인 자료를 제공하고자 하였다.
가설 설정
cAMP와 cGMP의 세포내 신호전달 경로에서 각 물질들을 분해하는 효소 phosphodiesterase (PDE)를 차단한 후 cAMP와 cGMP를 처치하면 각 약물들의 반응을 차단하는 효소가 차단되어 있으므로 시냅스후전류의 증가를 관찰할 수 있으리라 가정할 수 있다. 따라서 이를 확인하기 위하여 PDE 차단제인 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 20µM을 5분간 전처치하면 일시적인 EPSC의 증가를 관찰할 수 있었으며(약 140%), 이 조건에서 8-Br-cGMP/8-Br-cAMP (1:1)를 15분간 처치하면 EPSC의 크기는 더욱 증가되었고(약 170%) 이러한 시냅스 가소성은 시간 경과에 따라 지속적으로 증가하여 50분 이상 유지되는 양상을 보였다(Fig.
제안 방법
Pulse & Pulsefit (HEKA, Germany)을 이용하여 일련의 실험수행 명령을 발생시키고 얻어진 전기신호의 저장, 분석 및 제도를 하였다.
, 1999), Willis 등은 만성통증의 병인이라 생각되어지는 중추성 감작현상이 시냅스 가소성과의 관련성이 있음을 시사하였다(Willis, 1997). 또한 Sandkuhler, Svendsen 등을 포함한 여러 연구자들에 의해 척수에서의 LTP 또는 LTD 현상이 중추감작(central sensitization) 및 급, 만성 통증을 유발하는 기전으로 해석하였다 (Sandkuhler et al., 2000; Rygh et al. 2002). 그러나 척수에서 시냅스 가소성은 동일한 강축자극에 의해서 다양한 형태의 시냅스 가소성(LTP, LTD, No plasticity)이 보고되었으나 이에 대한 해석은 이뤄지지 않았으며, 현재까지 알려진 척수 통증정보처리 기전에서 일어나는 LTP현상은 glutamate에 의한 시냅스 후 세포에 존재하는 NMDA, nonNMDA 그리고 metabotropic glutamate 수용체의 활성화, 전압의존성 Ca2+ 이온통로를 통한 Ca2+의 유입, 다양한 세포내 신호전달기전 - PKC, CaMKII, PKA, PKG, NO - 등에 의해 이뤄지며 이러한 현상이 중추성 감작이라고 보고 하였다(Svendsen et al.
막전압 고정 및 전류기록은 EPC-9 막전압고정 신호증폭기(HEKA, Lambrecht, Germany)를 사용하여 수행하였다. Pulse & Pulsefit (HEKA, Germany)을 이용하여 일련의 실험수행 명령을 발생시키고 얻어진 전기신호의 저장, 분석 및 제도를 하였다.
2 mm)를 제공하며 세포와 전극을 관찰하면서 전극을 세포에 접근시킬 수 있었다. 실제 세포에 전극을 접근시키는 과정은 보다 분명한 영상을 관찰하기 위하여 흑백 CCD 카메라(NC300A, Takenaka system, Japan)를 이용한 videomicroscopy 하에서 시행하였다.
척수 절편의 척수 후근 유입부를 전기자극하여 발생하는 시냅스후전류(EPSC)를 기록 하였으며 이때 발생하는 시냅스후전류의 정점의 크기를 측정하여 비교 분석하였다. 일정한 시냅스후전류의 크기가 관찰되면 control value를 위하여 10분간 그 크기를 기록하였으며, 1 mM 8-Br-cAMP를 15분간 처치하였다. 그 결과 EPSC의 크기는 증가하였으며 또한 washout 이후에도 EPSC의 크기가 지속적으로 증가하여 약 150%의 증가된 상태로 유지되었다.
자극기(WPI, USA)를 통하여 자극 전류를 가하였으며 이 전류에 의해 유발되는 SG neuron의 자극 유발 흥분성 시냅스후 전류(evoked EPSCs)를 기록하였고, 발생된 전류의 양상을 분석하여 단일 시냅스를 가진 SG neuron만을 선택하였다. 자극 방법으로는 eEPSC를 발생시키기 위한 시험자극으로 1분 간격으로 역치전류의 1.5배 크기의 전류를 척수후근 유입부에 가하였다.
이 전극을 현미경 하에서 자극부위에 접근시킨 후 음압을 걸어 일정하여 유지되도록 하였다. 자극기(WPI, USA)를 통하여 자극 전류를 가하였으며 이 전류에 의해 유발되는 SG neuron의 자극 유발 흥분성 시냅스후 전류(evoked EPSCs)를 기록하였고, 발생된 전류의 양상을 분석하여 단일 시냅스를 가진 SG neuron만을 선택하였다. 자극 방법으로는 eEPSC를 발생시키기 위한 시험자극으로 1분 간격으로 역치전류의 1.
전극은 borosilicate 유리 capillary (Kimax 51, Kimble, USA)를 Narishige puller (PP-83; Narishige, Tokyo, Japan) 으로 제작하며, 전극의 저항을 3-4 MΩ 되도록 하였다. 전극 내는 K-gluconate 123 mM; KCl 14 mM; sodium gluconate 2 mM; EGTA 1 mM; HEPES 10 mM; pH 7.
5 cm정도 길이의 절편을 얻었다. 조직 절편기(Vibratome, Campen, 752M, UK)의 stage에 옮겨 순간접착제를 이용하여 분리한 절편을 고정하고 agar block으로 뒤를 받쳐 칼날에 척수가 밀리지 않도록 하였다. 이때 얼린 aCSF를 띄워 절편의 온도를 가능한 낮추도록 노력하였다(< 4˚C).
척수 절편의 척수 후근 유입부를 전기자극하여 발생하는 시냅스후전류(EPSC)를 기록 하였으며 이때 발생하는 시냅스후전류의 정점의 크기를 측정하여 비교 분석하였다. 일정한 시냅스후전류의 크기가 관찰되면 control value를 위하여 10분간 그 크기를 기록하였으며, 1 mM 8-Br-cAMP를 15분간 처치하였다.
대상 데이터
실험에 쓰인 모든 약물은 Sigma Aldrich (Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, stock solution 으로 만들어 −20℃에 보관 후 실험 당일날 최종 농도로 희석하여 사용하였다.
데이터처리
대조군과 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 존재하는지 여부는 paired 혹은 non-paired t-test를 시행하여 확인하였으며 이때 95% 유의 수준으로 그 유의도를 판정하였다. 통계 자료의 평균값은 평균값 ± 표준오차(S.
통계 자료의 평균값은 평균값 ± 표준오차(S.E.M) 로 표시하였다.
이론/모형
Normaski DIC법을 이용하여 수침용 정립현미경(Olympus, BX50WI, Japan)하에서 SG neuron을 확인하였다(Edwards et al.,1989). 또한 대물렌즈는 물에 잠길 수 있는 수침 렌즈로서 세포와 렌즈사이에 관류액이 흐르면서 전극을 위치시킬 수 있는 충분한 초점거리(3.
세포 밖 용액은 여러 관을 하나로 모아 그 끝을 세포에서 500 µm 위치에 놓은 후 필요한 관만을 열어 교환하여 주는 Y-tube 법을 사용하였다.
모든 기록은 상온(22℃)에서 수행하였다. 척수후근 유입 부분(dorsal root entry zone)을 자극하기 위하여, theta-유리 전극(Clark Electromedical Instruments, England)을 이용하여 bipolar 전극을 제작하였다. 이 전극을 현미경 하에서 자극부위에 접근시킨 후 음압을 걸어 일정하여 유지되도록 하였다.
성능/효과
이번 연구의 목적은 척수 통증시냅스 가소성에서 세포내 신호전달계(cAMP, cGMP)의 상호연관성이 어떠한 영향을 주는지와 이와 관련된 crosstalk 기전을 규명하여 다양한 형태로 관찰되는 만성통증의 발생기전에 대한 새로운 재해석을 하고자 하는 것이다. 이 연구를 통해서 얻은 결과를 정리하면, 1) cAMP 또는 cGMP는 각각 척수 통증 시냅스 효율을 강화시키는 작용을 통해 과감작 통증을 유발할 수 있고, 2) cAMP와 cGMP의 동시 투여는 척수 통증 시냅스 효율 조절에 있어서 서로의 효과를 길항하는 작용을 가지고 있으며, 3) 이러한 cAMP와 cGMP의 상호길항작용에 PDE가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 과감작 통증이 유발되는 상황에서 2차 전령계의 상호 작용을 통해 통증의 효율이 조절됨을 유추할 수 있으며, 이러한 상호관련 작용기전은 신호전달계 내의 효율을 조절하는 내재적 요소를 지니고 있는 것으로 사료된다.
cAMP와 cGMP의 막투과성 analogue 인 8-Bromoadenosine 3,5-cyclic monophosphate (8-BrcAMP)와 8-Bromoguanosine 3,5-cyclic monophosphate (8-Br-cGMP)의 최종 농도는 1 mM이었고, phosphodiesterase inhibitor인 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 최종 농도는 20 µM이었다.
일정한 시냅스후전류의 크기가 관찰되면 control value를 위하여 10분간 그 크기를 기록하였으며, 1 mM 8-Br-cAMP를 15분간 처치하였다. 그 결과 EPSC의 크기는 증가하였으며 또한 washout 이후에도 EPSC의 크기가 지속적으로 증가하여 약 150%의 증가된 상태로 유지되었다. 그 유지 시간은 30분 이상 지속되는 long term change를 보였다 (Fig.
따라서 이를 확인하기 위하여 PDE 차단제인 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 20µM을 5분간 전처치하면 일시적인 EPSC의 증가를 관찰할 수 있었으며(약 140%), 이 조건에서 8-Br-cGMP/8-Br-cAMP (1:1)를 15분간 처치하면 EPSC의 크기는 더욱 증가되었고(약 170%) 이러한 시냅스 가소성은 시간 경과에 따라 지속적으로 증가하여 50분 이상 유지되는 양상을 보였다(Fig. 4, n = 7).
,1989). 또한 대물렌즈는 물에 잠길 수 있는 수침 렌즈로서 세포와 렌즈사이에 관류액이 흐르면서 전극을 위치시킬 수 있는 충분한 초점거리(3.2 mm)를 제공하며 세포와 전극을 관찰하면서 전극을 세포에 접근시킬 수 있었다. 실제 세포에 전극을 접근시키는 과정은 보다 분명한 영상을 관찰하기 위하여 흑백 CCD 카메라(NC300A, Takenaka system, Japan)를 이용한 videomicroscopy 하에서 시행하였다.
똑같은 조건에서 1 mM 8-Br-cGMP를 15분간 처치한 결과 EPSC의 크기는 증가하였으며 또한 washout 이후에도 EPSC의 크기가 지속적으로 증가하여 약 170%의 증가된 상태로 유지되었다. 그 유지 시간은 30분 이상 지속되는 long term change를 보였다(Fig.
위 실험에서 EPSC의 반응을 증가시켰던 두 약물 1 mM 8-Br-cAMP와 1 mM 8-Br-cGMP를 동시에 15분간 처치하면 EPSC의 반응이 통계적으로 유의하지 않는 수준에서 약간의 증가(약120%)가 관찰되었다(Fig. 3, n = 7). 또한 두 약물을 투여하는 동안에도 큰 변화가 관찰되지 않았다.
이러한 결과를 종합해 보면 각각의 2차 전령계는 통증 유발에 있어서 중요한 역할을 하며 또한 두 2차 전령계가 활성화 되는 상황에서는 서로의 신호전달경로를 조절함으로써 통증조절을 하고 있음을 의미한다. 이처럼 척수 통증 조절은 분자적 수준에서 서로의 신호전달 과정을 조절하는 음양이론이 적용되고 있으며 이에 근거한 시냅스 가소성 및 통증조절에 대한 재해석을 위한 기초 자료로서 그 의미가 있다.
이 연구를 통해서 얻은 결과를 정리하면, 1) cAMP 또는 cGMP는 각각 척수 통증 시냅스 효율을 강화시키는 작용을 통해 과감작 통증을 유발할 수 있고, 2) cAMP와 cGMP의 동시 투여는 척수 통증 시냅스 효율 조절에 있어서 서로의 효과를 길항하는 작용을 가지고 있으며, 3) 이러한 cAMP와 cGMP의 상호길항작용에 PDE가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 과감작 통증이 유발되는 상황에서 2차 전령계의 상호 작용을 통해 통증의 효율이 조절됨을 유추할 수 있으며, 이러한 상호관련 작용기전은 신호전달계 내의 효율을 조절하는 내재적 요소를 지니고 있는 것으로 사료된다.
후속연구
이처럼 척수 통증 조절은 분자적 수준에서 서로의 신호전달 과정을 조절하는 음양이론이 적용되고 있으며 이에 근거한 시냅스 가소성 및 통증조절에 대한 재해석을 위한 기초 자료로서 그 의미가 있다. 또한 기억과 학습의 기전을 척수 수준에 도입함으로써 만성통증과 관련된 통증정보처리 기전에서 시냅스 가소성에 대한 정확한 이해를 할 수 있으며 만성통증의 발생기전에 대한 음양이론에 근거한 새로운 재해석은 이후 통증연구의 발전에 기여할 것으로 사료되며 통증지식 증진에 도움이 되리라 사료된다.
5는 세포내 인산화효소와 2차 전령계 cAMP, cGMP에 따라 시냅스 가소성의 방향이 결정됨을 도식적으로 그린 그림이다. 세포내 Ca2+이 중등도로 증가하면 LTD가 사라지며 오히려 시냅스가소성이 발생하지 않는 구간이 있으나 이에 대한 해석은 논란이 있으며 이번 연구결과에서처럼 cAMP/ cGMP ratio로 이 부분에 대한 작용기전을 해석할 수 있으리라 기대된다(Fig. 5).
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